Microbiologia

Programma del corso

Storia della microbiologia

• Evoluzione microbica
• Fisiologia microbica: nutrizione e crescita; strutture e funzioni (batteri, archea, eucarioti); metabolismo
• Genetica dei microrganismi
• Associazioni tra microrganismi ed altri organismi
• Antibiotici e quorum sensing
• Cicli biogeochimici degli elementi
• Virus e infezioni virali

La maggior parte degli organismi viventi sulla Terra sono unicellulari. Questi, insieme ad alcune classi di organismi pluricellulari, rappresentano i microrganismi. Il termine deriva dal fatto che questi organismi normalmente non sono visibili ad occhio nudo. Per osservarne forma e struttura, bisogna quindi ricorrere al microscopio ottico. I microrganismi occupano tutti e 3 i regni del vivente: batteri, archea e eucarioti.

Microbiologia: breve excursus storico

L’avvento del microscopio nel XVII secolo fu una tappa fondamentale nella scoperta del mondo microbico. In realtà già intorno alla metà del XVI secolo, microscopi rudimentali erano stati realizzati da Hans Janssen e Galileo Galilei (1590/1610) e probabilmente anche da Robert Hooke (1635-1703), che pubblicò il primo volume dedicato a osservazioni al microscopio, con disegni di corpi fruttiferi di funghi.

Antonj van Leeuwenhoek (1632-1723) è considerato lo scopritore del mondo microbico, in quanto fu il primo a descrivere batteri (1676), lieviti e protozoi. Si era appassionato alla costruzione di microscopi che potevano raggiungere ingrandimenti di circa 50-300 volte rispetto alle dimensioni reali. È considerato il padre dell'istologia.

Francesco Redi (1626-1697) confuta la teoria della generazione spontanea nel 1668. Esperimento: prese tre pezzi di carne di cui uno fu lasciato all’aria senza protezione; in questo caso le mosche potevano deporre le uova sulla carne e dopo alcuni giorni si sviluppavano le larve di mosca. Un secondo recipiente contenente la carne venne sigillato con un foglio di carta che impediva l’ingresso delle mosche, ma anche il passaggio di aria: le larve non si sviluppavano. Un terzo recipiente contenente carne fu sigillato con una garza che impediva l’ingresso delle mosche ma non il passaggio dell’aria: anche in questo caso non si svilupparono larve. Si provava così che le larve potevano derivare solo dalle uova e non dalla carne per generazione spontanea.

Nello stesso periodo si sviluppa anche la teoria cellulare, secondo cui tutti gli organismi viventi sono costituiti da unità fondamentali dette cellule. Inoltre, la scoperta di un mondo prima invisibile, costituito dai microrganismi anche unicellulari, rimise in discussione il dibattito sulla teoria della generazione spontanea; una grande varietà di "animaletti" microscopici sembrava generarsi spontaneamente e poi aumentare nell’acqua piovana, nei brodi, nel latte, nel cibo deteriorato ecc.

Lazzaro Spallanzani (1729-1799) conduce esperimenti sulla sterilizzazione e nel 1770 fornisce pubblica dimostrazione di sterilizzazione del brodo: aveva osservato che un brodo di carne sottoposto a bollitura prolungata, se lasciato esposto all’aria, dopo pochi giorni diventava torbido per la presenza di microrganismi. Ciò non avveniva se si impediva l’ingresso di aria sigillando ermeticamente la fiasca in cui era stato bollito. Spallanzani giunse quindi alla conclusione che la bollitura uccideva le forme di vita presenti nel brodo e che la sigillatura impediva l’ingresso nel brodo di nuovi organismi presenti nell’aria.

Appert inventa l’appertizzazione, ossia un modo per sterilizzare gli alimenti (es. conserve).

Cagnard-Latour, Schwann, Kutzing (~1836-37) cominciano a cogliere il ruolo dei microrganismi come principio trasformante: iniziano molti studi sui lieviti e sul loro ruolo nella fermentazione del vino e della birra.

Jenner (~1798): vaiolo. Agostino Bassi: nel 1837 dimostrò che il calcino, malattia del baco da seta, era causato da un fungo (Botrytis bassiana). Ci si inizia a interrogare su un possibile ruolo dei microrganismi nelle patologie.

Louis Pasteur nel 1864 confuta definitivamente la teoria della generazione spontanea della vita. Esperimento: un brodo di coltura è posto in un matraccio il cui collo viene modellato alla fiamma, per formare un’ansa così che sia permesso il passaggio di aria ma non quello delle "particelle" microscopiche presenti nell’aria stessa. Il brodo viene quindi portato a ebollizione in modo da uccidere tutte le forme viventi ivi presenti. Anche dopo un lungo periodo, il brodo non diventa torbido per la presenza dei batteri. Solo se il collo del matraccio viene rotto permettendo alle particelle sospese nell’aria di penetrare nel matraccio, si osserva intorbidimento del brodo dovuto alla crescita dei microrganismi presenti nell’aria. Alternativamente, se si inclina il matraccio per un breve intervallo di tempo, così da portare le particelle intrappolate nel tratto curvo a contatto con il brodo ora sterile, il liquido nel matraccio poi si intorbidisce.

Dal 1857 al 1876 Pasteur si occupa di fermentazioni: tutti i processi fermentativi sono il risultato di attività microbiche e scopre la vita in assenza di ossigeno (definisce la fermentazione come "vita senz’aria"). Inoltre si occupa dell’eziologia delle malattie, tra cui: carbonchio, colera e rabbia.

Lister nel 1876 scopre l’antisepsi chirurgica (sterilizzazione in chirurgia).

Tyndall e Cohn scoprono l'esistenza di spore batteriche. Microrganismi come agenti di malattie

Robert Koch e la microbiologia medica

Robert Koch (1843-1910) si dedicò allo studio delle cause di molte malattie e diede origine alla microbiologia medica isolando per primo un microrganismo causa di una malattia. Chiarisce l’enzimologia di molte malattie (carbonchio, tubercolosi, difterite), definendo la specificità biologica. Il suo primo contributo importante allo sviluppo delle tecniche batteriologiche fu il metodo per coltivare microrganismi su terreno solido (gelatina, fette di patata). Sulla base dei suoi esperimenti formulò i postulati di Koch, per provare che un determinato microrganismo è responsabile di una specifica malattia.

Postulati di Koch (1881)

• Il microrganismo deve essere presente in tutti gli individui affetti dalla malattia e assente negli individui sani.
• Il microrganismo deve essere isolato dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine a una coltura pura (formata da individui appartenenti tutti alla stessa specie).
• L’inoculo di una coltura pura di microrganismo in individui sani può causare la comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile.
• Il medesimo microrganismo deve poter essere nuovamente isolato dall’organismo infettato sperimentalmente in cui la malattia sia insorta.

Rivisitazione moderna dei postulati di Koch (molecolari)

• Il gene implicato nella patogenicità o virulenza deve trovarsi in tutti i ceppi patogeni di una data specie ed essere assente nelle specie non patogene.
• L’inattivazione selettiva del gene deve portare a una diminuzione misurabile della patogenicità o virulenza.
• La complementazione o reversione della mutazione deve ripristinare il livello originario di patogenicità o virulenza. L’introduzione del gene in un ceppo non patogeno lo trasforma in patogeno.

Walter Hesse introduce l’uso dell’agar come agente solidificante. L’uso dell’agar aveva un duplice vantaggio rispetto a quello della gelatina: liquefa alla temperatura di 100°C ma rimane allo stato liquido fino a 45°C e non viene degradato da microrganismi, salvo poche eccezioni.

Julius Petri nel 1887 introdusse l’uso di scatole di vetro, dette piastre Petri, nelle quali preparare i terreni solidi.

Ehrlic pone le basi di immunologia e chemioterapia. Colorazioni (es. blu di metilene).

Gram (1835-1938) sviluppò un metodo di colorazione differenziale che da lui prese il nome di colorazione Gram.

Ruolo dei microrganismi in natura

Martinus Beijerinck (1851-1931) studia i microrganismi del suolo e sviluppa la tecnica di arricchimento, basata sull’impiego di terreni colturali di tipo selettivo. Aggiungendo o togliendo certi componenti da un terreno di coltura tradizionale o incubando la coltura in diverse condizioni ambientali, era possibile favorire la crescita di determinati microrganismi escludendo quella di altri. È importante anche per gli studi dei cicli biogeochimici (es. studia batteri azotofissatori) e per il “virus filtrabile”.

Sergei Vinogradskij (1856-1953) studia i microrganismi del suolo, in particolare quelli coinvolti nel ciclo dell’azoto e dello zolfo. Scopre i solfo batteri. Dallo studio di batteri che ricavano il carbonio cellulare dall’anidride carbonica, conia il termine autotrofia per descrivere questa proprietà. Successivamente introduce anche il concetto di chemiolitotrofia per descrivere batteri capaci di ricavare energia e carbonio esclusivamente da composti inorganici.

Biochimica comparata

Albert Jan Kluyver (1888-1956) viene considerato il fondatore della biochimica comparata: attraverso lo studio dei processi metabolici nei microrganismi e il confronto con analoghi processi in cellule di organismi superiori, arrivò alla moderna concezione di unitarietà nelle reazioni biochimiche, sostenendo che i processi metabolici sono funzionalmente equivalenti in tutte le cellule viventi. Chiarì che la caratteristica di base di tutti i processi metabolici è il trasferimento di idrogeno (elettroni) e suggerì la formula generale per i processi respiratori sia aerobi sia anaerobi e quella per la fotosintesi:

AH + B → A + BH₂ (respirazione)

CO₂ + 2H₂A → CH₂O + H₂O + 2A (fotosintesi)

Sviluppo della microbiologia come scienza di base e applicata

• Alexander Fleming nel 1929 scopre la penicillina.
• Gerhard Domagk nel 1930 scopre i sulfamidici.
• Joshua Lederberg nel 1946 scopre il trasferimento di DNA tra cellule batteriche mediante coniugazione e trasduzione.
• Monod e Jacob nel 1960 scoprono il primo modello di regolazione genica nei batteri.
• Brock nel 1967 isola “batteri” ipertermofili, poi definiti Archea.
• Howard Temin, David Baltimore, Renato Dulbecco nel 1969 scoprono retrovirus e trascrittasi inversa.
• Prusiner nel 1981 primo isolamento di prioni.
• Kary Mullis nel 1985 inventa la PCR, tecnica importantissima per la manipolazione e analisi del DNA.
• Venter e Smith nel 1995 pubblicarono la prima sequenza genomica completa di un microrganismo (Haemophilus influenzae).

Origine della vita, vita microbica e biosfera

Testimonianze fossili/rocciose: Rocce sedimentarie, vulcaniche e carbonati. Datazione: 3.9 bilioni di anni. Significa che doveva esserci acqua liquida. Le prime evidenze di vita microbica risalgono a 3.5 bilioni di anni fa.

Stromatoliti

Testimonianza di organismi filamentosi che non facevano fotosintesi ossigenica.

Teorie sull'origine della vita

• Formazione spontanea di molecole organiche.
• Era dell’RNA.
• Era del solfuro di ferro.

I primi esperimenti sulla comparsa delle molecole organiche risalgono agli anni '20. Una combinazione di gas che riproducono l’atmosfera di 3.9 bilioni di anni fa ed elettricità, o radiazioni UV o nucleari. L’esperimento di Urey e Miller (1950) dimostra la possibilità che si generino molecole quali amminoacidi, zuccheri, acidi grassi e basi azotate. Attenzione: questo può essere vero per singole molecole, difficile da immaginare per molecole che si formano per disidratazione (ruolo delle “superfici esposte” di argille, piriti, basalti); brodo in cui parte delle molecole aderiscono a superfici rocciose (es. piriti). Inoltre: amminoacidi ed altre molecole organiche sono state trovate in meteoriti, nonché nello spazio, attraverso analisi di spettri.

L’RNA può portare informazioni, ma può anche avere attività catalitica. È una molecola molto duttile. 1990-2000: Russel, Hall, Martin.

Testimonianze fossili sulla comparsa dell’ossigeno

• Banded Iron Formations (BIF, Formazioni Bandeggiate Ferrose).
• Quando comparvero i cianobatteri, che per primi svilupparono la fotosintesi ossigenica, prevalentemente nelle acque marine, l’O₂ prodotto non si accumulò subito nell’atmosfera poiché erano presenti grandi quantità di ione ferrico e ferroso.
• La combinazione chimica portava dunque alla formazione di precipitati di Fe₂O₃ e Fe₃O₄.
• Solo una volta esaurita questa grande quantità di ferro ridotto l’O₂ cominciò ad accumularsi nell’atmosfera.

Origine delle forme cellulari

Le molecole organiche mostrano naturale tendenza all’aggregazione. Strutture simili alle membrane plasmatiche possono facilmente formarsi, cosa che è osservabile anche in esperimenti di laboratorio. Le microsfere così create, dette anche coacervati, possono anche replicare. Anche in questo caso è stato possibile dimostrare in laboratorio la comparsa di coacervati con proprietà catalitiche ed autoreplicanti. Crescita e divisione dei coacervati: dobbiamo immaginare iniziali tentativi e copresenza di autotrofi ed eterotrofi, questi ultimi prima dipendenti da organico di origine abiotica, poi da autotrofi.

Prima della scoperta dei microrganismi erano stati identificati 2 regni: piante e animali. Successivamente alghe e funghi furono aggiunti alle piante e venne aggiunto il regno degli Infusori (che compaiono in seguito all’infusione). Al 1866 risale la classificazione di Heackel:

• Piante (a semi, felci e muschi)
• Animali (vertebrati e invertebrati)
• Protisti (alghe, protozoi, funghi e batteri)

I protisti sono tutti unicellulari. Questa classificazione ha il merito di essere fondata sullo schema del vivente.

Evoluzione della classificazione dei viventi

1950: microscopia elettronica Viventi classificati in base alla struttura cellulare: Procarioti ed Eucarioti. 1980: Procarioti (Eubatteri e Archeobatteri) ed Eucarioti. 2000: Eucarioti, Batteri, Archea.

Relazioni evolutive tra (micro)organismi e orologi molecolari

Gli orologi molecolari sono delle molecole che sono caratterizzate da sequenze che si possono allineare e confrontare; permettono di ricostruire le relazioni filogenetiche. Dovrò usare una molecola presente in tutti i viventi di cui si vuole costruire la relazione filogenetica e che abbia la stessa funzione. A seconda della scala temporale, la molecola deve essere presente in tutti gli individui e ci devono anche essere state un certo numero di variazioni che mi permettano di ricostruire i rapporti tra gli individui studiati. Carl Woese utilizza le sequenze di rRNA 16S/18S come orologio molecolare.

A partire al procariote ancestrale, i batteri si trovano su un ramo indipendente mentre gli Archea e i procarioti nucleari (da cui derivano poi gli eucarioti) si dipartono da una linea comune. Il nucleo si è originato per organizzare l’incrementata quantità di DNA. Un evento simbiontico genera gli organelli delle cellule eucariote: mitocondri e cloroplasti. C’è stato e c’è tutt’ora, lo scambio di sequenze di genoma tra organismi diversi (es. virus che introduce un frammento del suo genoma nei batteri).

Proprietà comuni ai viventi

• Vita organizzata su scheletri carboniosi.
• Tre classi principali di macromolecole: DNA, RNA, proteine. (I virus non sono organismi viventi perché queste tre non sono mai attive contemporaneamente). Svolgono le attività metaboliche.
• Attività metaboliche (consentono al vivente di vivere e generare una progenie).
• Organizzazione in (sub)unità microscopiche: Cellule.
• Membrana citoplasmatica (i virus non ce l’hanno, possono “rubarla” all’ospite infettata).

Organizzazione cellulare

• Organismi unicellulari
• Organismi pluricellulari: Possono essere differenziati oppure no.
• Struttura cenocitica: Preludio al differenziamento vero e proprio.

Principi generali della crescita microbica

Per studiare un microrganismo bisogna farlo crescere; per valutare la crescita di una popolazione microbica è necessario determinare nel tempo la variazione del numero di cellule o della massa cellulare. Supponiamo quindi di aver isolato un certo microrganismo. Moltissime specie di microrganismi unicellulari sia procarioti sia eucarioti si duplicano per scissione binaria (es. E. coli): incremento di massa con mantenimento di forma. Quando si raggiunge una massa critica (dimensioni all’incirca doppie rispetto a quelle di partenza) si ha separazione nelle due cellule figlie, grazie alla formazione di un setto di divisione. Con generazione si intende la duplicazione dell’individuo primario nelle due cellule figlie. Il tempo di generazione è quello che intercorre dall’inizio della duplicazione alla formazione delle cellule figlie. Comprende una fase di replicazione del DNA, una di allungamento della cellula e una di divisione delle due cellule. Nel lievito S. cerevisiae la divisione avviene per gemmazione, nei funghi filamentosi si osserva la crescita filamentosa, in diverse specie di cianobatteri la divisione avviene per scissione multipla o per frammentazione.

Metodi diretti per la determinazione della crescita microbica

1. Conta diretta al microscopio: Solitamente si usa un vetrino che faciliti la conta (grigliato con