Microbiologia

Introduzione

Classificazione esseri viventi

Inizialmente esseri viventi erano divisi in due regni: piante e animali. Con l’avvento del microscopio è stato possibile identificare numerosissimi altri organismi che non rientravano nella tradizionale classificazione. Nel 1866 Ernst Haeckel propose il nuovo regno dei protisti, dove si poteva inserire tutto ciò che non rientrava negli altri due regni. Successivamente negli anni '40, i protisti sono a loro volta stati divisi in eucarioti, che presentavano strutture intracellulari non simili a quelle di piante e animali (nucleo e organelli delimitati da membrana), e procarioti, o comunemente batteri, che invece ne erano privi. Tuttavia quest’ultimi presentavano al loro interno delle differenze troppo evidenti per essere raggruppati in unico regno. Quindi, in seguito ai suoi esperimenti filogenetici condotti negli anni '80, Carl Woese decise di riclassificare il mondo vivente in 3 domini: Eukarya, Bacteria e Archea. In particolare questi ultimi due derivano dalla scissione dei procarioti.

Caratteristiche comuni organismi viventi

Procarioti ed eucarioti condividono le proprietà fondamentali funzionali, biochimiche e strutturali degli organismi viventi. Ogni organismo vivente ha la capacità di riprodursi, in particolare i batteri e gli archea non hanno particolari meccanismi di divisione cellulare, ma eseguono una riproduzione non sessuale: la duplicazione cellulare, un processo che trasforma una cellula madre, in due cellule figlie, spesso identiche. In ogni cellula vi sono 3 aspetti generali di cui bisogna sempre tener conto:

• Come la cellula si procura la materia, ovvero da quali molecole può partire per costruire tutte le altre molecole di cui necessita.
• Come si procura l’energia, necessaria per trasformare le molecole di partenza nelle molecole di cui è costituita e per tutte le sue funzioni cellulari.
• Come è fatta e come si attua l’informazione che guida questi processi.

Inoltre, anche la composizione chimica elementare è comparabile in tutti gli organismi viventi. Le macromolecole biologiche e nelle molecole organiche semplici sono presenti: H, O, C, N, P e S. Vi sono poi altri elementi (Mg, Fe, Ca, K, Na...) che sono presenti in forma ionica, liberi o associati a molecole organiche.

Introduzione procarioti

I procarioti, come abbiamo detto, non sono un gruppo filogeneticamente omogeneo, a differenza degli eucarioti. I batteri sono invisibili a occhio nudo e hanno generalmente dimensioni lineari nell’ordine del micrometro (solitamente 1-5 µm). Questo fa sì che il rapporto superficie/volume delle cellule procariote sia in genere molto più elevato di quello degli eucarioti. Vi è una nomenclatura binomiale per indicare il nome delle specie: genere (in corsivo con lettera maiuscola) ed epitelio specifico (in corsivo con lettera minuscola).

Classificazione morfologica

I batteri possono essere classificati morfologicamente:

• Cocchi → forma sferica
• Bacili → a bastoncello
• Vibrioni → a virgola
• Spirilli → a spirale
• Spirochete → a spirale con curva
• Prostecati → con il peduncolo
• Filamentosi

Inoltre possono trovarsi:

• Isolati
• Aggregati di poche cellule: questo fenomeno dipende dal fatto che la divisione cellulare non è completa e a seconda del piano di divisione ho diversi tipi di aggregati.
• Aggregati di cocchi:
  • Diplococchi: cocchi a 2 a 2 appiattiti
  • Streptococchi: catenella
  • Stafilococchi: poche cellule, a forma di grappolo
  • Tetradi: 4 cellule
  • Sarcine: si dividono su 3 piani, 8 cellule
• Aggregati di bacilli: diplobacilli, streptobacilli

Aggregati multicellulari:

• Colonie: origine da un’unica cellula che si moltiplica e si divide per scissione binaria.
• Miceli: aggregati multicellulari di ife
• Biofilm: aggregati multicellulari di cellule eterogenee/omogenee che sono aggregate da una matrice polisaccaridica prodotta dalle cellule stesse

Le morfologie degli Archea sono sostanzialmente le stesse dei batteri, ma esistono tuttavia forme che non si trovano nei batteri: ad esempio esistono degli archei che hanno forma a quadrato.

Batteri in laboratorio

In laboratorio per coltivare le cellule batteriche si usa una capsula Petri, ovvero un contenitore cilindrico in cui viene posto ad esempio agar. Una capsula può contenere più colonie; e anche se inizialmente sono isolate, a seguito di continue divisioni cellulari, possono poi interagire e formare un’unica. In seguito, per allestire una coltura batterica il primo passaggio è l’inoculazione, cioè il trasferimento delle cellule dalla capsula Petri in una beuta, al cui interno è presente un terreno di coltura liquido (il trasferimento è di circa un milione di cellule batteriche). Questo terreno di coltura è un “brodo” in cui sono presenti nutrienti per i batteri e le giuste condizioni di T e O₂ necessarie per la crescita. Escherichia coli, ad esempio, essendo un batterio intestinale, ha una T di crescita ottimale intorno ai 37°C. Dopo 24h, la coltura nella beuta è molto torbida, perché le cellule hanno iniziato a proliferare, creando una coltura vera e propria. Si può monitorare nel corso del tempo, l’aumento del n° di cellule dopo che è avvenuto l’inoculo. Per contare i batteri considero il volume della coltura in crescita e faccio delle diluzioni seriali e poi trasferisco delle aliquote nella coltura. Nel calcolo devo tenere conto del fattore di diluizione.

Dopo che le cellule sono cresciute posso raccoglierle per centrifugazione; devo poi eliminare il surnatante, mentre il sedimento (pellet) contiene le cellule. A questo punto peso il sedimento. Dopo essiccazione, posso fare l’analisi chimica elementare.

Analisi elementare batteri

I macroelementi sono i costituenti delle macromolecole che formano le cellule batteriche e, come abbiamo visto, sono:

• C → 50% del peso secco; è l’elemento più abbondante ed è il costituente principale del materiale cellulare e gli organismi possono ottenerlo o da materiale organico (eterotrofi) o dalla CO₂ atmosferica (autotrofi).
• O → 20% del peso secco, costituisce composto organici ed acqua ed è l’accettore di elettroni nella respirazione aerobica. Origina da composti organici, acqua, CO₂ e O₂.
• N → 14% del peso secco, forma aa, basi azotate, lipidi e coenzimi. Ha origine da composti organici, NH₃, NO₂, N₂.
• H → 8% peso secco; forma H₂O e composti organici. Ha origine da H₂O e H₂
• P → 3% del peso secco, forma acidi nucleici e nucleotidi, partecipa a molte reazioni metaboliche. Ha origine da composti organici e PO₄^3-.
• S → 1% del peso secco; è il costituente di metionina e cisteina (aa), glutatione, molti coenzimi. Ha origine da composti organici, H₂S, So, SO₄^2-.

Vi sono poi degli elementi in forma ionica, i microelementi. Rappresentano meno dell’1% del peso secco e sono K⁺, MG⁺⁺, Ca⁺⁺, Fe. Hanno origine da sali e formano coenzimi e cofattori.

Analisi molecolare

In un'analisi molecolare si studiano le molecole che costituiscono la cellula, particolarmente importante è la composizione della parete. Le molecole sono organizzate nelle strutture complesse della cellula: nucleoide, citosol, envelope e polisomi.

Struttura e funzioni delle cellule procariotiche

La morfologia batterica è determinata dalla parete mureinica, costituita da un’unica macromolecola gigantesca di un polisaccaride complesso: il peptidoglicano. Nei batteri, tuttavia, sono state scoperte proteine simili a proteine del citoscheletro eucariote. Queste proteine batteriche hanno un ruolo fondamentale nel definire la forma e nel controllare le dimensioni della cellula interagendo con il meccanismo di biosintesi della parete e sono:

1. FtsZ = simile alla tubulina. Nel momento della divisione si posizione nella parte mediana della cellula e forma un anello (setto) che coordina la sintesi della nuova parete cellulare, reclutando le altre proteine necessarie. Il mutante produce cellule filamentose.
2. MreB = simile all’actina. Forma una struttura elicoidale a livello della membrana plasmatica. Il mutante è caratterizzato da un progressivo aumento del diametro cellulare, che porta all’arrotondamento delle cellule.
3. CreS (crescentina) = simile ai filamenti intermedi, permette di dare una forma ricurva alla cellula del vibrione.

Rivestimento della cellula procariota

Le cellule procariote sono dotate di complesse strutture di rivestimento che consentono loro di adattarsi a specifici habitat e di affrontare le più disparate e spesso difficili condizioni fisiche, chimiche e nutrizionali. Come tutte le cellule viventi, la cellula procariote è innanzitutto delimitata da una membrana citoplasmatica. Questa è protetta da una parete, che assume strutture diverse. Inoltre, molti procarioti possiedono ulteriori strati di rivestimento (strato S, capsula o glicocalice). Proprio in base alla parete si differenziano due tipologie di batteri:

• Didermi (gram negativi) → vi è una vera e propria membrana esterna formata da lipopolisaccaridi e nello spazio delimitato tra le due membrane, il periplasma, si trova un sottile strato di peptidoglicano (o mureina). Al microscopio elettronico la parete è meno elettrondensa.
• Monodermi (gram positivi) → sono privi di membrana esterna e la parete è costituita da uno spesso strato di peptidoglicano (90%) insieme ad altre proteine minori (acido teicoico+lipoteicoico). Al microscopio elettronico la parete è più elettrondensa.

Gli Archea al microscopio elettronico hanno un’elettrondensità marcata, come i gram positivi, ma la parete è tuttavia diversa. Negli archei non c’è il peptidoglicano, ma sono presenti altri polimeri tra cui il pseudopeptidoglicano, simile alla mureina. Alcuni archei non hanno proprio la parete: la membrana plasmatica è rivestita da uno strato S di proteine (può succedere anche per i batteri).

Colorazione gram

La classificazione dei batteri è stata permessa grazie al medico Hans Gram, che mise a punto la colorazione Gram nel 1884. Il procedimento consiste in:

1. Fissazione delle cellule al colore
2. Colorazione cristal-violetto, che per essere fissata viene fatta reagire con ioduro, andando a formare un complesso insolubile che precipita nel citoplasma.
3. Decolorazione con alcol/acetone, che lava via il cristal-violetto soltanto nei gram negativi.
4. L’ultimo passaggio è la colorazione di contrasto con safranina, che non modifica la colorazione dei Gram positivi, mentre quelle Gram negativi si coloreranno di rosa.

La diversa colorazione da questo trattamento è dovuta alla diversa architettura della parete. Più che a una differenza di componenti, si pensa sia dovuto alla differenza di spessore di peptidoglicano: nel caso dei batteri gram positivi la spessa parete di mureina riesce a trattenere il complesso cristal-violetto precipitato nel citoplasma durante il trattamento con alcol. Al contrario nei gram negativi, l’etanolo va a distruggere la membrana esterna e lo strano sottile di mureina non è quindi in grado di trattenere il precipitato. Una divisione di batteri basato su questa distinzione porta a un raggruppamento con significato tassonomico: i gram positivi sono i bacilli, clostridi, lattici, attinomiceti e micobatteri (è qua che c’è stretta parentela). Tutti gli altri risultano essere gram negativi (in realtà gli organismi in questa categoria non sono molto imparentati fra loro). Questa suddivisione tra gram positivi e negativi così netta è stata messa in discussione, essendo presenti delle eccezioni:

1. La classe degli Actinobacteria gram positivi, in cui si ha una famiglia, la Corynobacteriaceae che ha una membrana esterna che non contiene LPS.
2. Ci sono dei gram negativi, come ad esempio thermotogae, che non presenta LPS. È un gram negativo senza LPS.

Si è introdotto il concetto, nel caso dei Bacteria, di monodermi e didermi. Un gram positivo tipico è monoderma, mentre un gram negativo è diderma.

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica delimita il contenuto cellulare in uno spazio definito e separa la cellula dall’ambiente esterno, regolando gli scambi con esso. Inoltre, come vedremo, è fondamentale per acquisire nutrienti, secernere sostanze di rifiuto, secerne molecole specifiche ma soprattutto di mantenere l’omeostasi.

Struttura membrana plasmatica nei batteri

La membrana nei batteri ha una composizione simile agli eucarioti. Sono infatti entrambe costituite da un doppio strato fosfolipidico in cui sono presenti diversi tipi di proteine:

1. Lipoproteine → proteine che sono ancorate alla membrana e si estendono verso l’esterno. Il legame con la membrana è reso possibile grazie a una modificazione post-traduzionale, che introduce una coda lipidica all’estremità N-terminale.
2. Proteine transmembrana → non sono facilmente estraibili e sono insolubili in soluzioni acquose. Come i lipidi di membrana, è una molecola anfipatica, in quanto vi è la parte idrofobica (a-elica) nel doppio strato e le componenti idrofiliche verso i due lati.
3. Proteine periferiche → sono più facilmente rimuovibili e sono ancorate alla membrana o tramite legami non-covalenti con altre proteine integrali oppure ancorate direttamente al foglietto lipidico tramite un corto segmento di aa idrofobici.

La maggior parte dei lipidi che compongono una membrana biologica sono molecole anfipatiche costituite da una testa polare e una coda fortemente idrofoba. La membrana plasmatica di Bacteria ed Eukarya è costituita tipicamente da fosfolipidi, in cui:

1. Testa polare → molecola di D-glicerolo-3-fosfato. Al gruppo fosfato può essere legata una sostanza (-R), che in base alla tipologia dà il nome al fosfolipide.
2. Coda → due molecole di acidi grassi non ramificati ed esterificati al C1 e al C2 dello scheletro della testa.

In ambiente acquoso i fosfolipidi tendono a formare un doppio strato con le catene laterali degli acidi grassi che si associano tramite legami idrofobi, mentre le porzioni polari sono rivolte verso l’esterno. La struttura generale della membrana è stabilizzata da interazioni idrofobe e da cationi divalenti, come Mg²⁺ o Ca²⁺. Nei batteri fototrofi, la membrana plasmatica non è solo superficiale, ma ha anche delle invaginazioni che invadono il citoplasma e che sono necessarie per la fotosintesi. La fluidità della membrana dipende da:

• Acidi grassi → in particolare dalla lunghezza e dal rapporto tra acidi grassi saturi e insaturi. La presenza di acidi grassi insaturi diminuisce la viscosità e rende il tutto più fluido per una maggioranza di insaturi.
• Caratteristiche di -R
• Presenza di altri lipidi di membrana → gli opanoidi sono molecole di tipo planare presenti nelle membrane dei Bacteria che hanno la stessa funzione degli steroidi (es: colesterolo) presente nella cellula animale, ovvero di rendere la membrana più rigida.

Struttura membrana plasmatica negli Archaea

Struttura generale della membrana simile ai batteri, ma lipidi di membrana hanno delle differenze:

1. Chiralità del glicerolo → non è nella forma D, ma è nella forma L-glicerolo. Infatti, è il fosfato che risulta essere legato tramite un’esterificazione in C1.
2. Tipo di catena alifatica → Al posto degli acidi grassi sono presenti due catene isoprenoidi ramificate.
3. Tipo di legame tra glicerolo e catena alifatica → le catene alifatiche sono legate al glicerolo in C2 e C3 tramite un legame etereo. Presentano anelli di ciclopentano, che hanno la stessa funzione opanoidi, in quanto modulano la rigidità.

I lipidi di membrana degli Archaea possono essere:

• Dieteri di glicerolo → costituiti da due catene alifatiche (fitanile), tipicamente a 20C. Si va a costituire un doppio strato lipidico.
• Tetraeteri di glicerolo → vi sono due lunghe catene alifatiche (bifitanile), tipicamente a 40C, che sono legate, a ciascuna delle due estremità, formando così un tetraetere. Si forma così un monostrato lipidico, che ha il vantaggio di essere resistente ad alte T: si pensa che questa organizzazione sia un adattamento che consente a questi organismi la vita in ambienti di elevate temperature.

Parentela Arche-Batteri-Eucarioti

Considerando tutte queste informazioni verrebbe da pensare che batteri ed eucarioti hanno una progenie comune, ma non è così. Infatti, sono gli Archea ad avere una derivazione comune con gli eucarioti e questo si può spiegare tramite il fenomeno della convergenza adattativa. Ipotesi: si può pensare a una situazione iniziale di coesistenza delle due forme lipidiche (racemo = miscela delle due forme), da cui poi a un certo punto si sarebbe scelta una particolare tipologia di lipidi (batteri ed eucarioti avrebbero scelto acidi grassi, mentre gli Archei i soprenoidi, vivendo appunto ad alte T).

Funzioni della membrana plasmatica

Barriera selettiva: La membrana è una barriera selettivamente permeabile tra il citoplasma e l’ambiente extracellulare, grazie alla composizione lipidica e proteica della membrana. Il doppio strato fosfolipidico permette la diffusione dell’acqua, di gas (O₂, CO₂) e di piccole molecole liposolubili (prive di carica o scarsamente polari). La barriera risulta invece impermeabile a ioni, composti polari e grosse molecole. Queste attraversano la membrana attraverso specifici sistemi di trasporto. Distinguiamo quindi 2 tipologie di passaggio delle molecole attraverso la membrana:

• Diffusione → passaggio attraverso la membrana avviene secondo gradiente di concentrazione e pertanto non richiede consumo di E. È a sua volta divisa in:
• Diffusione semplice