Metodologie in microbiologia

ATU - Avvertimento di Test di Incertezza

Dalla fine del 2019, EUCAST ha introdotto il termine ATU, quando vi è la necessità di mettere in allerta i laboratori sulla possibile incertezza del risultato. Questo avvertimento non riguarda il clinico, ma soltanto il laboratorio, che deve trovare una strategia per gestire questa ATU, per accertare la correttezza del risultato, o segnalarne l'incertezza.

Gestione dell'ATU:

1. Ripetere il test, se si sospetta un errore tecnico
2. Eseguire un altro tipo di test
3. Riportare il risultato come incerto, lasciando l'interpretazione vuota
4. Riportare il risultato come R (resistente), se ci sono diverse buone alternative nell'antibiogramma
5. Cogliere l'opportunità per discutere i risultati con il clinico

Fortunatamente non sono molti gli antibiotici in cui si segnala un'eventuale ATU, ad esempio osservando la tabella dei breakpoint per gli enterobatteri:

Per amoxicillina acido clavulanico, se si eseguisse il test mediante disco-diffusione...

alla Concentrazione Minima Inibente (MIC) del farmaco in esame. Kirby-Bauer. Il test per eccellenza, in disco-diffusione è il Per eseguirlo:

• si parte da una coltura pura e fresca
• preparare una sospensione batterica che deve avere una torbidità pari a UFC/mL10 (0.5 McF)
• effettuare dalla sospensione batterica una semina a confluenza (in tutte le direzioni) su piastre MH (Mueller Hinton) agar, tramite un tampone sterile inserito nella provetta contenente l'inoculo.
• deporre i dischetti di carta bibula impregnati della concentrazione nota (ricavabile dalla tabelle EUCAST) dell'antibiotico da testare
• incubazione overnight delle piastre a 37°C
• valutazione dell'attività inibente, misurando gli aloni di inibizione che si sono formati attorno il dischetto, mediante un righello, e si esprime il valore in mm. È un metodo qualitativo, perché non ci da un valore di MIC, ma ci dice, estrapolando poi i dati dal breakpoint di riferimento,

inibizione attorno a determinati dischetti di antibiotici, si definisce il microrganismo resistente.

Interpretazione dati

I risultati vanno interpretati seguendo le linee guida EUCAST, andando ad osservare la tabella relativa al microrganismo testato, confrontare i valori ottenuti con quelli di riferimento dei breakpoint relativi al diametro delle zone di inibizione. Esempio, considerando gli enterobatteri:

L'antibiotico cefotaxime è suddiviso in 2 righe perché si hanno:

• breakpoint per il cefotaxime testato in caso di ceppi batterici che causano meningite
• breakpoint per altre patologie.

Se si fosse ottenuto un valore di 25 mm, il microrganismo sarebbe stato categorizzato come S; con un valore di 17 mm sarebbe stato I.

Pro e contro del test in disco diffusione

• semplice da eseguire, non richiede particolare strumentazione
• utile mezzo di screening
• flessibile nella selezione delle molecole da testare
• economico

È un test qualitativo, per cui non da una MIC.

puntuale di resistenza o sensibilità➔ all’antibioticoper utilizzare i risultati in ambito clinico è necessario il giudizio di un esperto➔ non è automatizzabile➔ non è eseguibile su tutti i microrganismi➔

Un altro test per diffusione su agar, è l’E-test, che consiste nell’utilizzo di strisce di plastica pronte all’uso, in cui è presente un gradiente di concentrazione dell’antibiotico.

La metodica è la medesima, per cui:

• preparare l’inoculo standardizzandolo a 0.5 McF
• il terreno che si utilizza è MH agar
• si effettua la semina a confluenza
• incubazione overnight una volta appoggiata la striscia sul terreno

Il giorno successivo si osserverà l’eventuale formazione di un ellisse attorno a questa striscia; la lettura avviene intersecando l’alone di inibizione con la striscia, e si ottiene il valore di MIC, che nell’immagine a fianco è indicato dalla

freccia.Nel caso in cui si dovesse formare un alone di inibizione simile a quello riportato a alto, non sarebbe sufficiente, percui il microrganismo va categorizzato come R all'antibiotico.

Questo test è quantitativo, perché ci fornisce un valore di MIC

Metodi per diluizione

Il metodo per eccellenza è la determinazione della MIC in terreno liquido, che permette di ottenere risultati quantitativi riguardo all'attività di un antibiotico nei confronti di un agente patogeno.

Questa procedura richiede l'allestimento di una serie di diluizioni scalari dell'antibiotico da testare, generalmente secondo un fattore due.

Come si esegue:

• preparare una serie di provette sterili contenenti ciascuna lo stesso volume di terreno liquido (MH brodo)
• si aggiunge l'antibiotico da testare e si effettuano le diluizioni decrescenti (generalmente su base 2), in modo tale che se si parte da una concentrazione di antibiotico di 16 µg/mL, si diluisce

1. si aggiunge ad ogni provetta un'uguale quantità di sospensione standardizzata del batterio da saggiare (UFC/mL) 10 - 10
2. incubazione delle colture in termostato a 37°C overnight
3. il giorno seguente si leggono i risultati

antibiotico pari a 2 µg/mL) diventa limpida, per cui il microrganismo non riesce a crescere.

Il valore di MIC corrisponde al valore di antibiotico contenuto nella prima provetta che rimane limpida. Quindi, per l'esempio riportato sopra, la MIC dell'E.Coli è pari a 2 µg/mL. In seguito si va a controllare sulle tabelle EUCAST se questo valore corrisponde ad un valore di sensibilità o di resistenza.

Il test in diluizione può essere eseguito anche in micrometodo, su micropiastre a 96 pozzetti. Il principio è identico, ma si può eseguire in 2 modi:

• testare lo stesso microrganismo nei confronti di più farmaci
• testare più microrganismi per un solo antibiotico

Il principio di lettura è sempre uguale, per cui, alle basse concentrazioni di antibiotica si ha quasi sempre la crescita del microrganismo, mentre man mano che si aumenta la concentrazione, la crescita del microrganismo sarà sempre più inibita.

prende inconsiderazione la prima concentrazione che riesce ad inibire la crescita del batterio corrisponde al valore di MIC. Ad esempio, per il ceppo 1, il valore di MIC è pari a 4.

Grazie ai test per valutare la MIC in brodo diluizione, si può ottenere anche il valore di concentrazione battericida, (minima che è la quantità di antibiotico che riesce ad avere azione battericida nei confronti del microrganismo.

Testare la MBC può essere utile:

• soprattutto in caso di infezioni gravi, come osteomieliti, endocarditi, meningiti, ecc.
• quando il focolaio di infezione è localizzato in distretti anatomici difficilmente accessibili all'antibiotico.

Per testare l'MBC:

1. partire dalla provetta di MIC, e seminare l'inoculo in essa contenuto in piastra di MH agar
2. seminare anche l'inoculo delle 2-3 provette successive a quella della MIC
3. mettere in incubazione le piastre di MH in cui è seminato l'inoculo delle