Metodologie in microbiologia

Metodologie in microbiologia

Diagnostica microbiologica

Il ruolo del laboratorio di microbiologia clinica include:

• Isolare il patogeno
• Identificare il patogeno a livello di genere e specie
• Caratterizzare il patogeno a livello fenotipico (ad es. con antibiogramma) e genotipico

Step per l'identificazione del patogeno

1. Sospetto diagnostico di una malattia infettiva, e quindi un’ipotesi circa l'agente infettivo.
2. Prelievo del campione biologico
3. Esame microscopico a fresco o con colorazione, in pochi minuti, effettuato spesso per campioni urgenti
4. Esame colturale ed isolamento del patogeno, almeno 24-48 ore
5. Identificazione del patogeno e antibiogramma per valutare la resistenza agli antibiotici.

Il tempo per arrivare all’identificazione può variare, in base alla tecnica e al metodo utilizzato: può andare da poche ore a 24-48 ore o più.

Per la raccolta di campioni per microrganismi anaerobi, si deve trattare con attenzione il campione: dev’essere inserito in appositi contenitori, che garantiscano la creazione di un ambiente privo di ossigeno.

Percorso diagnostico

Suddiviso in 3 fasi:

1. Pre-analitica. Comprende:
   • Richiesta dell’indagine: il medico fa richiesta di indagine
   • Prelievo del campione
   • Conservazione e trasporto al laboratorio del campione
   • Accettazione del campione
2. Analitica. Comprende:
   • Esecuzione dell’esame
   • Validazione del risultato
3. Post-analitica. Comprende:
   • Stesura del referto
   • Eventuale elaborazione statistica

Fase pre-analitica

Il medico fa la richiesta di indagine, cioè la formulazione del sospetto diagnostico, in base al quale avverrà la scelta del campione da prelevare.

Esistono 3 tipi di prelievo:

• Diretto: effettuato solitamente da siti sterili (es. sangue, LCR, basse vie respiratorie, fegato). Di solito viene effettuato tramite ago o biopsia; è un tipo di prelievo invasivo, e quindi richiede l’assistenza medica. Il risultato è di facile interpretazione, poiché essendo siti sterili, gli eventuali microrganismi trovati in questi campioni saranno molto probabilmente la causa di infezione.
• Indiretto: prevede il passaggio del campione attraverso zone non sterili, con rischio di contaminazione del campione biologico (es. urina, espettorato). È un tipo di prelievo non invasivo, e il risultato di difficile interpretazione, perché il campione attraversa siti contaminati da una flora commensale.
• Da sito colonizzato da flora residente: (es. tratto oro-faringeo, intestino crasso, genitale femminile), effettuato tramite tampone sterile; il risultato è di difficile interpretazione. Diventa necessario l'impiego di terreni selettivi per evidenziare la presenza di precisi patogeni.

Si deve prestare particolare attenzione ai campioni prelevati per la ricerca di microrganismi anaerobi. I campioni devono essere inseriti in appositi contenitori che garantiscano un ambiente privo di ossigeno.

Come si esegue il prelievo?

• Scegliere un campione appropriato
• Raccogliere i campioni nel momento opportuno, durante la fase acuta della malattia
• Raccogliere quantità sufficienti di materiale, e un adeguato numero di campioni
• Evitare contaminazioni
• Usare contenitori idonei, e adeguati terreni di trasporto
• Etichettare adeguatamente i campioni
• Completare le richieste d’esame con un numero sufficiente di notizie formulando anche la diagnosi presunta
• Inviare rapidamente al laboratorio i campioni

Trasporto

Il trasporto al laboratorio di analisi è molto importante, dev’essere eseguito in contenitori adeguati per tipologia di campione. I contenitori devono essere sterili, monouso, e con una chiusura a perfetta tenuta.

Solitamente si utilizzano 2 contenitori:

• Contenitore primario: contiene direttamente il prelievo
• Contenitore secondario: contiene il contenitore primario
• Contenitore terziario: utilizzato solo se la sede del prelievo è distante rispetto il laboratorio.

N.B. Sui contenitori deve essere sempre presente il simbolo del rischio biologico. Il campione va consegnato sempre il prima possibile, e il limite massimo è di 2 ore; per campioni urgenti va consegnato IMMEDIATAMENTE. Durante un trasporto di 2 ore, a temperatura ambiente, la popolazione batterica aumenta di circa 64 volte.

Nel caso in cui non fosse possibile consegnare il campione al laboratorio entro le due ore, la sua conservazione deve avvenire secondo precise indicazioni, spesso fornite dal laboratorio:

• Sangue: a temperatura ambiente, inoculato in flaconi per emocoltura, se possibile incubato a 37 °C in attesa del trasporto.
• Essudati, drenaggi, liquidi: inoculati nei flaconi per emocolture e, una parte conservata a temperatura ambiente, la restante per le successive analisi a 4 °C.
• Catetere: conservazione a 4 °C.
• Espettorato e/o broncoaspirato: conservazione a 4 °C.
• Tamponi: conservazione a temperatura ambiente; a 4 °C se si devono ricercare: Campylobacter, Shigella, Vibrio, Versinia.
• Urine e feci: conservazione a 4 °C.
• Liquor: temperatura ambiente; a 4 °C per la ricerca virale.
• Ricerca micobatteri: 4 °C
• Essudato: 4 °C
• Biopsie: 4 °C
• Ricerca anaerobi: a temperatura ambiente.

Il trasporto deve avvenire a temperatura controllata:

• 2-8 °C per la maggior parte dei campioni
• 4 °C per la ricerca virale (NON CONGELATI)
• Temperatura ambiente per campioni come sangue, per la ricerca di anaerobi, feci per esame parassitologico, per la ricerca di gonorrhoeae, dell’occhio, dell’orecchio, per la ricerca di streptococco.

Terreni di trasporto

Per alcuni campioni biologici, è necessario mantenere il prelievo in terreni di trasporto atti a garantire la sopravvivenza del microrganismo, per tutto il tragitto del trasporto. Questi terreni sono adatti a ritardare la crescita, e/o evitare la crescita di altri microrganismi (es. microrganismi della flora commensale della sede del prelievo).

Alcuni esempi di terreni:

• Stuart: di uso generale, indicato soprattutto per tamponi faringei e vaginali;
• Amies: di uso generale, indicato per la conservazione dei patogeni di occhio, naso, orecchio, gola, pelle, apparato genitale.
• Amies con carbone: contiene carbone vegetale, migliora la sopravvivenza di Neisseria gonorrhoeae e dei batteri patogeni intestinali, neutralizzando i metaboliti tossici che andrebbero a falsare i risultati delle analisi.

Per gli anaerobi esistono dei terreni di trasporto appositi, che contengono un terreno nutritivo, che serve a ritardare la diffusione dell’ossigeno dopo l’aggiunta del campione. In questi terreni, gli anaerobi possono rimanere vitali fino a 72 ore. Quando si effettua un prelievo per la ricerca di microrganismi anaerobi, sarebbe utile impiegare delle siringhe sottovuoto.

Accettazione del campione al laboratorio

Informazioni da inviare con il campione:

1. Nome e cognome del paziente
2. Età e sesso
3. Provenienza anatomica del campione
4. Data e ora di raccolta
5. Diagnosi clinica presuntiva
6. Eventuale trattamento antibiotico a cui è stato sottoposto il paziente fino ad ora.

Quando il campione NON è idoneo:

• Campione non identificabile
• Trasporto dilazionato nel tempo:
  • Urine: > 1 ora a temperatura ambiente
  • Feci per trofozoiti: > 1 ora dalla raccolta
  • Campioni per la gonorrea: > 1 ora non in terreno di trasporto
• Contenitore non sterile
• Contenitore non chiuso correttamente (soprattutto per gli anaerobi)
• Contaminato da popolazione batterica orofaringea
• Contaminato da materiale estraneo
• Due campioni identici inviati contemporaneamente
• Campione non idoneo per l'indagine richiesta, ad esempio richiesta di ricerca di anaerobi, trasportati in terreno per anaerobi
• Due campioni dello stesso materiale inviati nello stesso giorno, escluso il sangue
• Quantità non sufficiente

Priorità di processazione dei campioni urgenti

Campioni urgenti, provengono da persone in pericolo di vita:

• Sangue
• Liquor, per sospetto di meningite, o sepsi
• Aspirato transtracheale, broncoaspirato, broncolavaggio, materiale chirurgico, proveniente da paziente ricoverato in terapia intensiva, sono da considerare SEMPRE urgente.
• Materiale oculare profondo, per sospetto di endoftalmite.
• Liquido pericardico
• Liquido amniotico
• Liquido articolare, in caso di artrite settica.

I campioni urgenti vengono processati nell’immediato, con precedenza rispetto ai campioni routinari.

Fase analitica

Come trattare il campione una volta che arriva al laboratorio:

1. Esame macroscopico, permette di stabilire se il campione è idoneo o meno, valutando la qualità del campione, ma anche il suo odore, aspetto, eventuale presenza di materiali estranei;
2. Esame microscopico diretto, è essenziale per la diagnosi presuntiva; può essere eseguito:
   • A fresco, quindi senza colorazione.
   • Dopo colorazione.

Questo metodo permette un primo approccio terapeutico in attesa della definitiva identificazione del microrganismo. Inoltre, l’osservazione della morfologia dei batteri colorati può essere d’aiuto per formulare una diagnosi, perché, ad esempio, riconoscendo batteri gram + e gram -, questi presentano una diversa sensibilità agli antibiotici, aiutando il medico ad approntare una terapia.

Inoltre, permette di valutare:

• Numero e percentuale dei granulociti neutrofili, per valutare lo stato di infiammazione;
• Se si tratta di un’infezione batterica, fungina, da parassiti, o se sono presenti delle inclusioni virali.

Inoltre ci permette di capire se il materiale è idoneo; ad esempio, se in un espettorato, si riscontrano molte cellule squamose rispetto ai leucociti, non si tratta di un vero espettorato, in quanto le cellule squamose sono tipiche del tratto alto delle vie respiratorie.

Va sempre eseguito per:

• Malattie di gravità rilevante, in cui occorre una risposta rapida;
• Casi in cui è difficile la coltura del microrganismo (ad es. per infezioni da Chlamydia trachomatis).

Vantaggi della diagnosi microscopica: diagnosi presuntiva

Svantaggi della diagnosi microscopica: limite di sensibilità, se si hanno pochi batteri, in particolare meno di batteri/ml, non si riuscirà a vederli; ad es. il liquor, prima di osservarlo, va centrifugato e in seguito colorato il pellet ottenuto (cellule che si depositano sul fondo della provetta).

Il campione può essere processato tramite metodi diagnostici:

• Diretti:
  • Evidenziano la presenza dell’agente infettivo (rilevamento microscopico e/o colturale)
  • O parti di esso (rilevamento proteine, acidi nucleici, polisaccaridi)

  Vengono utilizzati per campioni di: sangue, feci, urine, biopsie, tamponi, ecc.

• Indiretti: rileva una traccia immunologica dell’incontro con l’agente infettivo (rilevamento di anticorpi); è alla base della diagnosi sierologica. Viene effettuata sul siero del paziente; solitamente viene utilizzata per la ricerca virale, microrganismi difficilmente coltivabili, o di lunga crescita.

Dopo aver effettuato una diagnosi diretta, si può procedere con:

• Diagnosi rapida, utilizzata per microrganismi a lenta crescita o campioni urgenti;
• Esame colturale, seguita da identificazione del microrganismo e antibiogramma.

Microscopi

• Microscopio ottico in campo chiaro, permette di visualizzare strutture con dimensioni nell’ordine dei mm fino al di sotto del μm.
  • Oculari, dotati di lenti, che ingrandiscono 10 volte l'oggetto che si osserva
  • Portaobiettivo a revolver contenente obiettivi dotati di lenti che ingrandiscono fino a 100 volte l’oggetto che stiamo osservando
  • Sorgente di luce regolata dal condensatore
  • Ripiano portaoggetti su cui viene poggiato il vetrino
  • Vite per il movimento del ripiano portaoggetti
  • Vite per la messa a fuoco macrometrica
  • Vite per la messa a fuoco micrometrica
• Microscopio in campo oscuro, o ultramicroscopio. Oculari e obiettivi sono identici a quelli del microscopio ottico in campo chiaro, cambia il condensatore: in questo caso, esso impedisce l’illuminazione diretta del campione da parte della luce trasmessa. La luce raggiunge il preparato microscopico in modo tangenziale, illuminandolo su uno sfondo nero; per cui l’oggetto apparirà chiaro, su uno sfondo scuro. Questo tipo di microscopio viene utilizzato per l’osservazione di batteri particolarmente sottili (es. Treponema pallidum); non permette però l’osservazione della struttura interna, ad esempio, dei microbi. Ha un potere risolutivo maggiore rispetto al microscopio ottico.
• Microscopio a contrasto di fase. Consente di osservare i microbi viventi senza l'uso del colorante, ma anche materiali molto sottili e poco aggregati; permette un’analisi più dettagliata delle strutture interne dei microrganismi. A differenza del microscopio ottico, ha un ottica a contrasto di fase, che è in grado di convertire le differenze nell’indice di rifrazione dei diversi materiali, in una differenza di luminosità. Maggiore è l’indice di rifrazione, minore è la velocità della luce nel mezzo; ad esempio la luce che attraversa il nucleo di una cellula, arriva in ritardo rispetto all’onda luminosa che attraversa l’acqua circostante. L’ammontare di questo ritardo viene detto differenza di fase, che dipende e varia per lunghezza di percorso e tipo di materiale; la differenza di fase viene trasformata in livelli di grigio, per cui l’immagine osservata è in bianco e nero.
• Microscopio a luce ultravioletta (a fluorescenza). Utilizza come sorgente luminosa i raggi UV, il condensatore ha delle lenti al quarzo che permettono il passaggio della luce UV. Gli obiettivi hanno lenti di vetro che trattengono le radiazioni UV. Il campione è naturalmente fluorescente, oppure viene reso fluorescente grazie all’utilizzo di fluorocromi; viene colpito da fasci di raggi UV, e rilascia energia sotto forma di luce colorata che raggiunge l’oculare, rendendo visibile la sua visualizzazione. Viene utilizzato soprattutto in sierodiagnosi, per rilevare se, gli anticorpi marcati con sostanza fluorescenti, si sono combinati con gli specifici antigeni batterici o virali.
• Microscopio elettronico:
  • A trasmissione (TEM). Come fonte di energia utilizza un fascio di elettroni, e magneti al posto delle lenti, che permettono di convogliare il raggio di elettroni. Per questo tipo di osservazione, il campione dev’essere preparato in un determinato modo: mantenuto sottovuoto, montato su plastica. Gli elettroni passano attraverso il campione, e l’immagine è poi visibile sullo schermo fluorescente; a questo punto può essere fotografato e ingrandita.
  • A scansione (SEM). Permette di visualizzare in 3D il preparato microscopico permette di visualizzare strutture con dimensioni di 1 Å (0.1 nm); è possibile quindi osservare virus, e singoli componenti di un corpo batterico. I batteri di importanza medica misurano circa 2-5 μm in lunghezza e 0,2-1,5 μm in larghezza, sono quindi visibili tramite microscopio ottico.

Esame microscopico a fresco

Serve ad osservare i microrganismi vivi e la loro motilità, e può essere visualizzato in contrasto di fase o campo oscuro.

Può essere effettuato su:

• Materiale liquido (es. liquor centrifugato)
• Materiale reso liquido per diluizione

Come ottenere un esame microscopico a fresco?

1. Utilizzo di soluzione fisiologica.
2. Metodo della goccia pendente. Si utilizzano dei particolari vetrini, nel cui centro è presente un incavo. Procedimento:
   • Mettere una goccia del campione sul vetrino coprioggetto.
   • Capovolgere il vetrino coprioggetto e adagiare sul vetrino concavo; in questo modo, la goccia penderà.
3. Preparazione in soluzione di iodio
4. Preparazione in soluzione di idrossido di potassio
5. Preparazione con inchiostro di china, che è una colorazione negativa, in particolare per visualizzare la capsula batterica. Solo alcuni batteri sono dotati di capsula batterica, come ad esempio il Cryptococcus neoformans, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae; mediante la colorazione negativa di inchiostro di china, l’involucro capsulare viene visualizzato come un alone chiaro dello spessore di 2-10 μm, attorno alla cellula batterica.
6. Reazione di rigonfiamento capsulare di Neufeld (per visualizzare capsula batterica). Visualizzabile in contrasto di fase o in campo oscuro. Utilizza le componenti polisaccaridiche della capsula come antigeni per anticorpi specifici; se il microrganismo è presente nel preparato, gli anticorpi si legano agli antigeni della capsula, generando un aumento capsulare, dovuto all’aumento di idratazione causato dagli anticorpi.

L’efficacia dell’osservazione a fresco è migliore utilizzando un microscopio in contrasto di fase o in campo oscuro.

Coloranti

Perché colorare il preparato?

Perché la cellula batterica è trasparente, per cui il contrasto tra la cellula e l’ambiente esterno non è sufficiente per poterla visualizzare al microscopio. Perciò, nella maggior parte dei casi, prima dell’osservazione al microscopio, il preparato viene colorato.

Funzioni dei coloranti:

• Creare contrasto tra i microrganismi e il fondo
• Differenziare vari tipi morfologici, come: forma, organizzazione
• Evidenziare alcune strutture, come: flagelli, capsule, endospore

I coloranti principalmente utilizzati sono dei sali, per cui formati da ioni, che possono essere negativi o positivi. Per cui distinguiamo coloranti:

• Basici, che hanno carica positiva, e affinità per le strutture acide della cellula; rappresentano le colorazioni dirette. Alcuni esempi: blu...