Metodologie Biomolecolari

OMOGENEIZZATORI IN VETRO E TEFLON

Per i tessuti animali, il metodo più semplice meccanico è l’impiego di omogeneizzatori che

possono essere in vetro o in teflon (è un materiale plastico). Sono delle provette con un

pistone e tra il pistone e le pareti del contenitore c’è uno spazio piccolissimo per cui

muovendo su è giù questo pistone, il tessuto presente all’interno di una soluzione verrà

piano piano sminuzzato.

Questi omogeneizzatori hanno due nomi: Appunti universitari - Au -

⬢Dounce: quello tutto in vetro (il pistone e il contenitore sono in vetro);

⬢Potter: il contenitore è di vetro ma il pistone è di metallo con l’estremità in teflon.

Inoltre lo spazio tra il pestello e la parete può variare da 0.05 a 0.5 mm

(è proprio questo minimo spessore ed il movimento creato manualmente che omogeneizza

il tessuto). Inoltre, una variante può essere che il vetro presenta anche una smerigliatura che

crea una forza maggiore per sminuzzare il tessuto.

Ora vediamo un metodo meccanico di tipo elettrico

OMOGENEIZZATORE A ROTORE-STATIVO

questa porzione dell’apparecchio

Il termine rotore-stativo si riferisce a

L’aspetto è quello di un frullatore e vi è un becker con qualcosa all’interno da

omogeneizzare. Il rotore è munito di lame e questo rotore si trova nello stativo che è una

specie di torretta capovolta, quindi abbiamo una doppia azione: il rotore con le lame

sminuzza ciò che incontra e lo spinge verso le fessure dello stativo (nella torretta); tutto

questo darà luogo all’ omogeneizzato (Quindi ricapitolando abbiamo una doppia azione, la

prima è quella svolta dalle lame e la seconda è la spinta verso le fessure).

Questi apparecchi possono avere un rotore-stativo molto grande o molto piccolo tale da

entrare anche in una microprovetta quindi poter maneggiare anche mezzo millilitro di

Appunti universitari - Au -

sospensione cellulare. Questo apparecchio è molto utilizzato, anche solo per distruggere le

cellule.

DISPOSITIVO A ESTRUSIONE LIQUIDA: FRENCH PRESSURE CELL

è uno strumento meccanico in cui vengono esercitate delle forti pressioni su una

sospensione cellulare, che può essere anche di cellule microbiche.

Questa è la sezione che ci fa vedere il principio dello strumento. Appunti universitari - Au -

la parte in verde rappresenta la sospensione cellulare che si

vuole omogeneizzare. Il pistone sopra a questa camera d’acciaio spinge la sospensione

cellulare, ad un certo punto viene aperta una piccola valvola lateralmente con un piccolo

orifizio (per cui è l’unica valvola di sfogo) da cui il materiale sarà costretto ad uscire con

grande forza e stesso questa spinta distrugge le cellule in transito lungo questa piccola

Un’altra press chiamata hughes press (no press), utilizza lo stesso principio ma il

apertura.

materiale non è una sospensione cellulare ma è una miscela congelata, è una pasta

congelata di cellule (il principio è lo stesso ma in questo caso si lavora a basse

temperature). Sono apparecchi che maneggiano grandi quantità di materiale e non li si

ritrovano nei laboratori normali di biologia ma più in quei laboratori che se mai lavorano con

finalità, ad esempio, di utilizzare grandi colture batteriche.

SONICAZIONE Appunti universitari - Au -

è un altro metodo che utilizza un apparecchio detto sonicatore, il quale è una sonda che

crea l’omogenato. Questa sonda è immersa nel campione (una sospensione) ed emette

onde ultrasoniche, le quali creano delle bolle (onde) molto forti e le cellule sotto questa

sollecitazione meccanica tendono a scoppiare. Quando si utilizza questo apparecchio

bisogna stare attenti, perché questi ultrasuoni sono fastidiosi anche per le nostre orecchie.

In questo caso la sonda è contenuta all’interno di una struttura che

crea una schermatura per l’operatore, se non c’è questa schermatura bisogna usare delle

cuffie per proteggersi.

Un sistema un po’ più blando, è un bagnetto ad ultrasuoni in cui non si utilizza una sonda

ma un bagnetto in cui si mette il contenitore che contiene le cellule che si devono rompere,

quindi non c’è una sonda a diretto contatto con il campione ma è il bagnetto ad ultrasuoni

che trasmette le onde attraverso il contenitore. Non è molto efficace per distruggere le

cellule però, in certi casi, per le cellule particolarmente delicate lo si può utilizzare. Quindi le

onde non vanno a diretto contatto con il campione ma c’è un filtro che si applica alle pareti

del contenitore.

COMPOSIZIONE DEL MEZZO DI OMOGENEIZZAZIONE Appunti universitari - Au -

Prima di decidere quale strumento utilizzare, bisogna assicurarsi che la soluzione che verrà

messa nel campione sia quella giusta per il campione che si sta maneggiando. I mezzi di

omogeneizzazione, cioè le soluzioni che si utilizzano per omogeneizzare devono garantire

l’integrità dei componenti rilasciati. Che significa integrità? Sta a significare che le

macromolecole non vengono collise, decapate oppure se si è interessati a mantenere degli

organelli, si può rompere la cellula e poi lavorare sull’ organello ad esempio il mitocondrio.

Quindi bisogna fare attenzione ad utilizzare la giusta tecnica e il giusto metodo di

omogeneizzazione per ottenere, ad esempio, organelli integri. Comunque, in generale, cosa

c’è in un mezzo di omogeneizzazione? Ci può essere tutto o una parte di queste cose a

seconda dello scopo. Tipicamente contengono:

•Tampone ad opportuno pH: in genere tampone TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethane)

o tampone fosfato, che mantengono un pH fisiologico tra 7.0 e 8.0. Sostituisce i sistemi

cioè all’interno della cellula ci sono dei sistemi tampone ma quando la

tampone intracellulari,

cellula viene districata, tutto viene riversato all’esterno, il sistema tampone non funziona più

adeguatamente e viene sostituito dal tampone che viene messo per mantenere un

opportuno pH.

•Sali inorganici: come NaCl (cloruro di sodio) o KCl (cloruro di calcio), per mantenere una

forza ionica che è quella tipica all’interno della cellula ed è abbastanza alta; quindi quando le

cellule si rompono, per mantenere l’integrità dei componenti cellulari ci devono stare dei sali

(non sono tamponi, i sali sono degli ioni che danno una forza ionica e non tamponante).

•EDTA o EGTA: servono per chelare ioni bivalenti, perché? Perché una serie di ioni come

Cu2+ (rame), Hg2+(mercurio), Pb2+(piombo), possono inattivare le proteine con gruppi

tiolici (proteine con gruppi tiolici, magari enzimi che hanno la cisteina nel sito attivo, possono

essere inibiti dalla presenza di questi ioni) e questi ioni possono essere, semplicemente,

oppure vengono liberati dopo la distruzione dell’identità cellulare. Inoltre,

presenti in acqua

chelano anche Ca2+ (calcio) e Zn2+ (zinco) che possono attivare le proteasi. Quindi si ha

una doppia azione, la prima di non far perdere l’integrità delle proteine che presentano

gruppi tiolici liberi e la seconda è quella di non far attivare le proteasi (per esempio pensiamo

alle proteasi dei lisosomi, quando si rompe la cellula e si rompe anche il lisosoma, le

proteasi vengono liberate all’esterno ma non solo queste anche le nucleasi e le lipasi e per

bloccare la funzione di questi enzimi, i quali funzionano a ph acidi 3-4, si blocca la loro

azione, cioè si bloccano soltanto quegli ioni che servono per la loro funzione.

Perchè a volte si utilizza l’EDTA anziché l’ EGTA? Perché l’ EGTA non chela l’ Mg2+

(magnesio), quindi se si hanno degli enzimi magnesio-dipendenti e bisogna studiarli, allora

non bisogna utilizzare l’EDTA ma l’ EGTA.

•Saccarosio: viene aggiunto se si vuole isolare gli organelli. Quando viene fatto un

omogenato, non tutti gli organelli (i quali sono più piccoli rispetto alla cellula) si rompono; si

pensa al mitocondrio, potrebbe restare intero almeno che non viene effettuata un

omogeneizzazione molto spinta. Nel caso si vuole isolare gli organelli viene fatta un

omogeneizzazione delicata (esempio congelamento/scongelamento) e una volta liberati per

evitare che essi scoppiano, viene usata una soluzione un pò più ipertonica in modo da

preservarli.

•Inibitori di proteasi lisosomiali: ce ne sono tanti e sono molecole specifiche che vanno a

bloccare delle proteasi (ad esempio se si lavora con le proteine e le si vuole isolare, non è

possibile fino a quando non vengono aggiunti al campione degli inibitori di proteasi).

Appunti universitari - Au -

•Agenti riducenti: (2-mercaptoetanalo, ditiotreitolo, glutatione, ecc), servono per preservare

i gruppi tiolici liberi delle proteine. Un gruppo tiolico libero può essere inattivato da uno ione

ma può essere inattivato anche da un’ossidazione, si formano degli addotti con altri gruppi

SH liberi e la proteina che per la sua funzione ha bisogno dei gruppi SH ridotti, li perde e

perde la sua funzione. Quindi vengono aggiunte delle sostanze che mantengono l’ambiente

in forma riducente in modo che le proteine non vengono ossidate (bisogna tener conto che

un ambiente intracellulare è un ambiente abbastanza riducente e per mantenerlo tale vengo

aggiungi questi agenti riducenti. Se ad esempio si ha interesse ad isolare del DNA, non si è

interessati a mantenere l’ambiente riducente e non vengono aggiunti gli agenti riducenti.

Quindi a seconda di ciò che si deve fare o studiare si prepara la miscela adatta).

•Detergenti: servono per favorire la solubilizzazione delle membrane, il rilascio delle

componenti intracellulari (anche quelli presenti negli organelli) e la liberazione delle proteine

presenti all’interno delle membrane; ad esempio se si sta studiando una proteina integrale di

membrana e la si vuole isolare, bisogna usare dei detergenti che sciolgono i lipidi altrimenti

la proteina non viene liberata e non la si può studiare libera dalla membrana. lezione 12-03-2018

Ricapitolazione

Abbiamo visto la composizione di un mezzo di omogeneizzazione e abbiamo visto che un

mezzo di omogeneizzazione deve garantire l’integrità biologica dei componenti rilasciati, sia

che siano organelli e sia che siano macromolecole; quindi occorre la presenza di un

tampone ad un opportuno pH (generalmente pH fisiologico tra 7.0-8.0) e quelli molto usati

sono i tamponi a base di fosfati oppure il tampone TRIS con un pH 7.0-7.5. Questi tamponi

vanno a sostituire i sistemi tamponi intracellulari ma oltre ad un tampone che mantiene un

pH costante, ci vuole una certa forza ionica simile a quella intracellulare, la quale si realizza

aggiungendo sali come NaCl (cloruro