Metodologie Biomolecolari

Metodologie biomolecolari

Queste sono alcune delle attrezzature usate in un laboratorio biologico molecolare.

Criteri generali per le separazioni e le analisi di biomolecole

Perché si parla di separare, di analizzare? Perchè per fare un’analisi di una molecola, di un analita (che sia una macromolecola o meno) quasi sempre è necessario separarla dal resto, quindi purificarla almeno in parte.

Per alcune applicazioni la purificazione invece deve essere molto spinta, dobbiamo avere una molecola praticamente pura; ad esempio, per dover fare la cristallizzazione di una proteina (avere un’analisi ai raggi X), la proteina deve essere estremamente pura.

Che cos’è un’analisi biologica? Si tratta di una caratterizzazione di un componente biologico mediante opportune tecniche di laboratorio.

Per fare un’analisi biologica in un campione possiamo seguire due approcci:

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• Analisi qualitativa: vediamo se nel nostro campione è presente o meno un certo analita, (una biomolecola). Non ci interessa sapere quanta ce n’è ma soltanto se c’è o no.
• Analisi quantitativa: è una determinazione di una quantità di un analita (una biomolecola) in un campione.

N.B. Analita è una parola più generica, si parlerà di biomolecole e macromolecole (proteine e acidi nucleici).

Spesso per fare un’analisi biologica e in particolare biochimica è necessario separare o purificare un analita presente in una miscela complessa, quindi per analizzare dobbiamo separare e spesso la separazione e l’analisi sono due processi contemporanei, cioè lo stesso strumento mentre separa analizza.

Il nostro campione biologico può essere una coltura cellulare, un tessuto (può essere preso da un animale o una biopsia umana), un fluido biologico (esempio sangue). Questo rappresenta la fonte.

Se dobbiamo analizzare ciò che è presente nelle cellule o anche al di fuori delle cellule, un tessuto deve essere sminuzzato, le cellule devono essere rotte (lisate, quindi si parla di lisi cellulare) e tutto deve essere omogeneizzato. Quando invece siamo interessati a mantenere integro un determinato organello, dobbiamo isolare dei nuclei, dei mitocondri, le tecniche cambieranno a seconda di ciò che dobbiamo andare ad ottenere.

Le tecniche per separare e purificare sono: precipitazione, separazione con membrane, centrifugazione, cromatografia ed elettroforesi.

Dopo la purificazione o anche durante dobbiamo fare un’analisi, cioè stabilire l’identità di una molecola, stabilire quanta ce n’è, quanto è pura, quali sono le sue proprietà (ad esempio se è un enzima, quali sono i suoi substrati, che funzione ha). Le tecniche per fare questo sono

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in parte le stesse usate per la separazione e poi ci sono delle tecniche tipiche di analisi: tecniche spettrofotometriche e spettrofluorimetriche, tecniche di sequenziamento e spettrometria di massa (sono tecniche per conoscere ad esempio la sequenza della proteina che abbiamo isolato. Magari sappiamo che una proteina ha un’attività enzimatica ma non la conosciamo fino in fondo e per conoscerne la sequenza usiamo queste tecniche di identificazione della sequenza), tecniche immunologiche e tecniche di biologia molecolare.

Ricapitolando talvolta separazione ed analisi sono due processi contemporanei.

Si parla di separazione analitica se stiamo separando ed analizzando contemporaneamente un analita, l’analisi di una biomolecola, quindi durante l’analisi.

Def: nel corso della separazione avviene, possiamo verificarne l’identità, la quantità o altre caratteristiche. In questo tipo di separazione si lavora con piccole quantità (un piccolo campione) e generalmente non si recupera dopo l’analisi, serve per analizzare e studiare quel analita nel campione biologico ma non per recuperarlo.

Di contro c’è la separazione preparativa cioè quella che ci serve per ottenere in quantità più grandi possibili un determinato analita su cui poi dobbiamo fare delle successive analisi.

Dunque una procedura di separazione che ci porta ad ottenere una quantità di analita, di cui già sappiamo tutto e viene semplicemente preparato perché vogliamo fare qualcosa; per esempio ci serve per usarlo per fare la cristallizzazione oppure ci serve perchè quella proteina va messa in commercio (banalmente è un processo che ci porta ad ottenere grosse quantità di una proteina che serve per scopi commerciali, questa è una separazione preparativa cioè ha l’obiettivo di preparare grandi quantità per farci qualcosa. Durante l’analisi il campione non viene perso).

Def: isolamento e recupero di quantità più grandi possibili di una data molecola, per studiarne successivamente le proprietà chimiche e/o biologiche o proprio per utilizzarla per qualche scopo utile all’uomo.

Considerazioni generali per le separazioni o purificazioni

Lo studioso o il ricercatore che si trova ad affrontare una separazione di una molecola deve tenere conto di una serie di cose:

• Capacità della tecnica: si fanno delle scelte, si sceglie la tecnica migliore per quello che voglio fare. Si prendono delle decisioni e una decisione, sulla tecnica da utilizzare, riguarda la quantità di materiale che sto maneggiando cioè se ho una grossa quantità di materiale dovrò utilizzare, in termini di volume o concentrazione, una tecnica ad alta capacità in modo da poter maneggiare grandi quantità di sostanze. Queste tecniche ad alta capacità vengono utilizzate all’inizio di una separazione.

Nessuna purificazione è fatta in un’unica tappa, si procede per step cioè in pratica si sgrossa man mano il campione fino ad utilizzare tecniche più raffinate per la fase finale di purificazione; oppure mi fermo prima se mi serve un campione non del tutto purificato (magari ci serve solo purificato dalle membrane o dagli acidi nucleici).

Quindi tecniche che possono maneggiare grandi quantità di materiale hanno alta capacità e si usano nelle fasi iniziali di una purificazione con lo scopo di ridurre la quantità iniziale del campione, eliminando quello che non ci interessa e a ridurre fisicamente il campione che stiamo maneggiando.

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• Ogni tecnica ha la sua risoluzione: cioè una capacità più o meno buona nel separare i vari componenti.

Generalmente una tecnica più è altamente risolutiva, quindi ci consente buone separazioni, e più è a bassa capacità.

• Resa: la quantità di sostanza recuperata dopo ogni passaggio di purificazione. Se facciamo una purificazione e alla fine non ho niente perchè ho perso il campione poiché quella tecnica non era adatta o abbiamo commesso uno sbaglio, la resa sarà bassissima.

La resa è espressa come quantità di sostanza rispetto alla quantità iniziale.

Esempio: se in origine il campione contiene 100 mg di analita di interesse e al termine della procedura di purificazione si ottengono 10 mg, la resa è 10%.

Quindi dobbiamo tenere conto di avere alte rese in una tecnica di separazione.

• Purezza: quanto è pura la sostanza che recuperiamo dopo ogni passaggio. Questa quantità di sostanza recuperata viene espressa come percentuale della quantità totale di materiale in studio.

Esempio - Purificazione di una proteina

Una proteina può essere purificata per diversi scopi: perché la dobbiamo studiare, perché vogliamo riconoscerne la sequenza, perché la dobbiamo vendere per esempio magari si tratta di un vaccino, un anticorpo o un fattore di crescita.

Se vogliamo fare la purificazione di una proteina, bisogna valutare:

• Quanta ce ne serve; a seconda di cosa dobbiamo fare avremo bisogno di quantità diverse.
• Quanto deve essere pura.
• Se in forma nativa o denaturata. Le proteine se hanno una determinata conformazione hanno un’attività biologica che può essere enzimatica ma non solo. Durante i passaggi di purificazione la conformazione della proteina può essere persa, banalmente, se non si fa attenzione alla temperatura a cui facciamo questi passaggi (magari la temperatura ambiente, a 25°C, può essere già sufficiente a denaturare la proteina durante questi passaggi). Se vogliamo studiare la sequenza amminoacidica non importa se alla fine si denatura, a differenza se vogliamo conservare l’attività biologica (esempio un enzima deve per forza restare nella sua conformazione altrimenti non possiamo usarlo come enzima e quindi la tecnica che usiamo deve prevedere anche questo. Non può essere una tecnica molto aggressiva se poi ci serve la proteina in forma nativa).
• Quanto tempo e quante risorse si intende investire.

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Vediamo la tabella. Ci sono i passaggi di una purificazione, partiamo da uno estratto grezzo che è stato tagliuzzato, omogeneizzato e poi sono elencati dei passaggi con il nome della tecnica usata. Abbiamo, sicuramente, tecniche ad alta capacità e poco risolutive all’inizio (come una precipitazione frazionata) e nell’ultimo passaggio abbiamo la cromatografia di affinità, la quale è più risolutiva ma ha minore capacità di tutte le altre. Mentre al centro abbiamo delle tecniche intermedie.

Il volume del nostro campione qui è elevato abbiamo un litro e mezzo (1500 ml) di materiale di partenza e alla fine abbiamo soltanto 7 ml. Le proteine totali in un litro e mezzo sono 12500 mg e poi possiamo vedere che nei vari passaggi man mano esse diminuiscono, fino ad avere 30 mg in 7 ml.

Della proteina di interesse ne abbiamo 100 mg e alla fine ne abbiamo 29 mg.

Riprendendo il concetto di resa e purezza, abbiamo detto che la:

Resa(%): (quantità di proteina recuperata/quantità di proteina di partenza) x 100

Purezza(%): (quantità di proteina recuperata/quantità di proteine totali) x 100

Usiamo i dati della tabella e calcoliamo la resa e la purezza.

Resa: (quantità di proteina recuperata/quantità di proteina di partenza) x 100

La proteina recuperata dopo il primo passaggio è 80 mentre la proteina è 100 quindi:

Resa: (80/100) x 100 = 80%

Quindi al primo passaggio ho una resa dell’80%

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Mentre se vogliamo sapere la resa al secondo passaggio dobbiamo fare lo stesso calcolo solo che questa volta la proteina recuperata dopo il secondo passaggio è 40 quindi poi applicando la formula di prima ottengo una resa del 40%.

Purezza: (quantità di proteina recuperata/quantità di proteine totali) x 100

All’inizio quando ho ancora l’estratto grezzo ho una purezza dell’0,8% e cioè abbiamo che la quantità della nostra proteina recuperata è 100 e la quantità delle proteine totali è 12500. Quindi:

Purezza: (100/12500) x 100 = 0,8%

Mentre nel primo passaggio abbiamo che la purezza è del 2,5%, viene fatto lo stesso calcolo di prima soltanto che adesso abbiamo che la quantità di proteina recuperata è 80 e la quantità di proteine totali è 3200.

Possiamo notare che i successivi passaggi ci portano ad un aumento della purezza, fino ad arrivare ad una purezza del quasi 97%.

La tabella di sotto riportata è l’esempio della purificazione di una proteina, ma quando questa proteina è anche un enzima, ci sono altre cose a cui siamo interessati durante la procedura di purificazione e quindi consideriamo l’attività enzimatica che recuperiamo.

Questa tabella, nel caso di purificazione di un enzima può contenere altre informazioni che riguardano l’attività enzimatica e l’attività specifica.

Attività enzimatica: viene espressa in unità. 1 U è la quantità di enzima che converte in prodotto 1 micromole di substrato in 1 min in condizioni definite di pH e temperatura.

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Attività specifica: è relativa all’U di enzima in una frazione della purificazione, rispetto alla quantità totale di proteine nella frazione.

Che cosa vuol dire? Guardando la tabella, all’inizio della purificazione e quindi nell’estratto grezzo abbiamo 100 mg di enzima di nostro interesse che corrispondono a 100000 unità di attività enzimatica. L’attività specifica, quindi quante unità di enzima ci sono nel materiale totale che sto maneggiando, sarà 100000/12500 = 8 U/mg (attività specifica: unità nella quantità totale delle proteine).

Possiamo notare che durante la purificazione l’attività totale tende a diminuire (diminuisce man mano che la resa diminuisce, cioè perdiamo un pò di proteina e perdiamo anche le attività totali dell’enzima) ma aumenta l’attività specifica; cioè man mano che il nostro enzima viene purificato l’attività enzimatica rispetto alle proteine totali aumenta tantissimo.

Questa è una visualizzazione della purificazione di un enzima, cosa aumenta e cosa diminuisce quindi è un pò una graficizzazione della tabella precedente. Possiamo vedere che in una procedura di purificazione dove partiamo da un estratto grezzo e andiamo verso la proteina purificata, il volume (il materiale iniziale) si riduce fortemente, la quantità di proteina totale (non riguarda solo la proteina di interesse) si riduce, la proteina di nostro interesse, la quale si riduce perché una parte viene persa ma ne resta abbastanza e rispetto ad un enzima l’attività totale anche si riduce. L’attività specifica sarà molto bassa poi diventa molto alta.

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Dobbiamo tener conto che stiamo parlando di separazioni di tipo preparativo cioè stiamo cercando di ottenere una proteina per farci qualche cosa. In uno stadio iniziale di purificazione preparativa abbiamo dei passaggi ad alta capacità perché abbiamo molto materiale, di conseguenza scarsa risoluzione.

Esempio: tecniche quali la precipitazione con solfato d’ammonio, la dialisi, la cromatografia a scambio ionico possono però essere usate in successione, lavorando con quantità notevoli di materiale (sono tecniche ad alta capacità).

Gli stadi successivi utilizzano metodi a bassa capacità e ad elevata risoluzione, quali ad esempio la cromatografia ad esclusione molecolare e di affinità.

Considerazioni specifiche per la purificazione e l’analisi di biomolecole

Quando iniziamo una purificazione di una biomolecola ci dobbiamo porre una serie di domande: la nostra sostanza che caratteristiche ha, è solubile e in che cosa, è volatile, che peso molecolare ha, è carica, è neutra, è stabile, dobbiamo stare attenti alla temperatura, magari è molto resistente ad una variazione di pH (quindi il nostro tampone può essere anche ad un pH più estremo).

Se la sostanza è conosciuta dobbiamo sapere di cosa si tratta, le sue caratteristiche, le sue proprietà ed inoltre dobbiamo avere anche un modo per seguirla questa sostanza, cioè facendo la purificazione bisogna avere un metodo che ci consenta di verificare dopo una separazione (in cui abbiamo delle frazioni) dove sta la sostanza o dove sta di più. Quindi si dice che dobbiamo avere un metodo di saggio, bisogna saggiare le varie frazioni per identificare dove è presente la nostra sostanza di interesse.

Il saggio che noi adottiamo deve essere specifico cioè mi deve distinguere cose diverse e deve essere sensibile in modo da poter identificare anche la più piccola quantità possibile nelle varie frazioni. Per un enzima parliamo di saggio enzimatico, esso è un metodo che ci permette di seguire l’andamento della purificazione.

Altre definizioni importanti sono:

→ Specificità (analitica) o selettività: un metodo che sia capace di distinguere tra cose diverse.

Def precisa: capacità di un metodo di essere libero da interferenze dovute ad altre sostanze nel campione.

Quindi altre sostanze presenti nel campione non devono interferire con la nostra determinazione che sto facendo.

→ Sensibilità o limite di rivelazione: è la concentrazione minima che può essere rivelata in un campione (nota: con il termine sensibilità si intende anche la capacità di un metodo di discriminare piccole differenze nella concentrazione di un analita).

Se due campioni hanno due quantità diverse di analita ma molto simili tra di loro, un metodo sensibile è un metodo che mi rileva queste differenze.

Altre considerazioni che bisogna fare riguardano quali sono le tecniche migliori per affrontare una separazione in termini di capacità e risoluzione, quali apparecchi abbiamo in laboratorio, se abbiamo le competenze nel fare questa procedura e quanto costa. A volte ci sono delle tecniche molto importanti ma che richiedono macchinari, competenze e costi esagerati, quindi bisogna tener conto di quello che si ha e delle competenze che si hanno.

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Sicurezza in laboratorio

Che cos’è un rischio? È la probabilità che una sostanza, un agente biologico, un’attrezzatura, o una procedura possa causare un danno.

I rischi sono di diversa natura:

• Rischio chimico: può essere dovuto a sostanze irritanti, corrosive, tossiche, cancerogene, teratogene;
• Rischio biologico: presenza di patogeni, trasmissione di malattie, sviluppo di allergie;
• Rischio radioattivo;
• Rischi elettrici o meccanici;
• Rischi generali: ad esempio un ago, un cilindro che si rompe, l’azoto liquido a temperatura bassissima può creare delle ustioni.

Quindi bisogna stare attenti e in generale bisogna usare le cappe (quelle chimiche quando si maneggiano sostanze chimiche, le cappe biologiche quando si maneggiano possibili