Metodologie di Embriologia Sperimentale

SVILUPPO EMBRIONALE

1) uovo + spermatozoo → ZIGOTE* cellula totipotente per eccellenza

2) SEGMENTAZIONE = rapide mitosi consecutive che dividono il citoplasma dello zigote in molte cellule più piccole → BLASTOMERI

3) GASTRULAZIONE = movimento coordinato dei blastomeri che si ridistribuiscono

* organizzazione dei 3 foglietti embrionali:

• ectoderma
• mesoderma
• endoderma
• cellule germinali → definite molto presto nell'embrione

Segmentazione

* vari tipi a seconda dell'asse di divisione:

• radiale
• a spirale
• bilaterale
• rotazionale

* OLOBLASTICA (totale) = solco interessa tutto l'uovo

• uova isolecitiche = vitello scarso, uniformemente distribuito
• uova mesolecitiche = vitello abbondante, più spostato verso il polo vegetativo

* MEROBLASTICA (parziale) = solco NON penetra nella regione del vitello

• uova telolecitiche = vitello abbondante che occupa quasi tutta la cellula
• segmentazione solo nel polo animale

centrolecitiche = vitello al centro dell'uovo→ segmentazione solo superficiale> ciclo cellulare più veloce: solo fase M e S→ fino a MBT> MBT = Mid-Blastula Transition (transizione della blastula intermedia)→ rapporto nucleo/citoplasma raggiunge la quotaesatta → ciclo cellulare normale: introdotte fasi GAP→ inizio trascrizione genoma zigotico:repressore della macchina trascrizionale inattivato↳ concentrazione non più sufficiente per reprimere tutto il DNA genomico che èaumentato nel corso delle divisioni cellulari→ inattivazione dei messaggeri materni → miRNA↳ hanno regolato tutto lo sviluppo fino a questo punto

Morfogenesi

• orientamento e numero delle divisioni cellulari
• modificazione morfologia cellulare
• migrazione cellulare → legata a interazione cellulare
• cellule migranti seguono segnali
• morte cellulare
• livelli di espressione delle proteine
• interazione tra cellule

fondamentale! tramite molecole e proteine di membranaes: CADERINE: - ampia famiglia di geni - adesione cellulare: ~ caderine compatibili → uniscono 2 cellule ~ caderine NON compatibili → dividono 2 cellula vari livelli di repulsionees: N-caderina e E-caderina sono "più compatibili" di N-caderina/E-caderina e caderina-6b2+ - necessitano di ioni Ca - intercettano citoscheletro tramite altre proteine • CELLULE EPITELIALI → interagiscono fortemente tra loro • CELLULE MESENCHIMALI → cellule che hanno perso legame con le altre cellule e interagiscono inaltro modo * CADERINE: importanti nei primi stadi di sviluppo se espressione bloccata → collasso blastocele → embrione NON più vitale es: formazione del tubo neurale 1) ispessimento ectoderma 2) parte che fermerà tubo neurale → esprime N-caderina parte che fermerà epidermide → esprime E-caderina 3) E-caderina e N-caderina NON sono compatibili 4) tubo neurale si

separa da epidermide↳ infossamento piastra neurale e chiusura a tubo

evolutivamente conservate* BLASTOCELE:→ permette migrazione cellulare durante i movimenti della gastrulazione→ impedisce contatto tra le cellule↳ nella blastula:ectoderma ed endoderma NON sono in contatto↳ se messi a contatto → 2 sfere collegate da un filetto↳ caderine NON compatibili

Gastrulazione* obbiettivo: da 1 popolazione cellulare arrivare a 2* movimenti peculiari di embrioni animali:INVAGINAZIONE = ripiegamento di una lamina cellulare all'interno dell'em rioneEMBOLIA = introflessione di una lamina cellulare sulla superficie basale di uno stratoesterno→ scorrimento delle celluleTRASFERIMENTO ALL'INTERNO = migrazione di singole cellule all'interno dell'embrioneDELAMINAZIONE = divisione o migrazione di una lamina cellulare in due→ replicazione in modo da aumentare lo spessore della laminaEPIBOLIA = espansione di una lamina cellulare al di sopra delle

altre cellule* questi movimenti NON si verificano sempre tutti> blastoporo aiuta le cellule a organizzarsi nei 3 foglietti embrionali→ riduce blastocele fino al collassamento→ formazione archenteron> blastoporo NON si forma sempre!→ in uova macrolecitiche (es: pesci):• NO invaginazione• embolia + trasferimento all'interno

Xenopus laevisanfibio modello per embriologia→ uova grosse e manipolabili facilmente→ fecondazione esterna → vitello→ polo animale pigmentato→ segmentazione oloblastica radiale→ vitello distribuito nei vari blastomeri→ semiluna grigia: regione visibile dopo la fecondazione che indica dove si formerà il labbrodorsale del blastoporo (organizzatore di Spemann)→ regione istruita da geni materni→ posizione esatta data dall'ingresso dello spermatozoo:1. interazione spermatozoo-cellula uovo: avviene solo nel polo animale↳ pigmentazione scura2. rotazione di circa 30° del

1. citoplasma corticale verso il punto di ingresso dello spermatozoo
2. attraverso il citoplasma vegetativo trasparente è visibile il polo animale pigmentato sottostante
3. rotazione del citoplasma corticale è accompagnata da riorganizzazione dei microtubuli
4. studiati con anticorpi per tubulina
5. nocodazolo: impedisce polimerizzazione tubulina
6. se aggiunto al medium: NO formazione semiluna grigia
7. durante la rotazione corticale si spostano solo gli organelli citoplasmatici e determinanti citoplasmatici
8. Dsh + mRNA per Wnt11 → attivazione pathway Wnt → β-catenina nel nucleo → determinazione lato dorsale
9. Gastrulazione di anfibio
10. INVAGINAZIONE = ripiegamento di una lamina cellulare all'interno dell'embrione
11. inizia con modificazione morfologica di alcune cellule: cellule a fiasco
12. citoccheletro modifica la forma della cellula a cuneo restringendo la membrana apicale
13. per dimostrare che queste cellule sono responsabili

dell'invaginazione:↳ eliminazione delle cellule a fiasco dà lo stesso risultato dell'eliminazione dell'interolabbro dorsale del blastororo↳ trapianto di cellule a fiasco crea doccia blastoporica 2) EMBOLIA = introflessione di una lamina cellulare sulla superficie basale di uno strato esterno→ scorrimento verso l'alto delle cellule endodermiche 3) EPIBOLIA = espansione di una lamina cellulare al di sopra di altre cellule→ scorrimento verso il basso delle cellule ectodermiche che avvolgono l'embrione→ compensazione delle cellule che migrano tramite replicazione↳ istone H3 con coda N-terminale fosforilata è marcatore di mitosi↳ facilmente visibile con anticorpi 4) scorrimenti delle cellule grazie a interazioni tra fibronectina e integrine→ fibronectina interagisce con matrice extracellulare e integrine;integrine contattano fibronectina e citoscheletro;→ integrina riconosce stretch Arg-Gly-Asp della fibronectina;se

questo tripeptide viene iniettato nell'embrione, integrina interagisce con questo e non con la fibronectina

NO scorrimento cellulare

Polarità dell'uovo

distribuzione asimmetrica di determinanti citoplasmatici

polo vegetativo → VegT (FT) e Vg1

determinanti citoplasmatici segnano il destino delle cellule derivanti da quella regione dell'uovo

cellule del ECTODERMA

polo animale

cellule MESODERMABLASTULA equatoriali

cellule del ENDODERMA

polo vegetativo* endoderma determinato da VegT (FT)

induce differenziamento del mesoderma sovrastante tramite secrezione di FT morfogeni

se tolgo cellule equatoriali → cellule del polo animale diventano mesoderma

cellule del polo animale e cellule equatoriali isolate NON originano mesoderma

a seconda della posizione dei blastomeri viene indotto un tipo di mesoderma piuttosto che un altro

gradienti morfogenetici: importanti per specificazione di vari tipi cellulari

activina:

bassa

concentrazione→ attiva gene brachyury → differenziamento mesoderma↳ alta concentrazione → attiva gene goosecoid → differenziamento mesoderma dorsale (es.notocorda)> l'espressione di un mRNA non coincide sempre con presenza della proteina corrispondentees. proteina può essere espressa solo dopo fecondazione> primi stadi di sviluppo regolati da mRNA materni> importanza degli mRNA:↳ presenza↳ posizione> mRNA in 3'-UTR → zipcode o C.A.P. = sequenze che indicano la localizzazione dell'mRNAes. Vg1LE = Vg1 Localization Element↳ per studiare queste sequenze: mutagenesi↳ punto di aggancio per proteine e altri mRNA necessari per una corretta localizzazionees. Vg1RBP/VeraNotocorda> si forma dalle cellule mesodermiche che convergono verso il labbro dorsale del blastoporo(organizzatore)↳ unica regione embrionale con destino predeterminato:* INDUZIONE PRIMARIA = induce formazione ai tessuti mesodermici dorsali e

tuboneurale> prima struttura di sostegno assiale> esprime cordina↳ diverso da mesoderma parassiale che esprime protocaderina parassiale → proteina diadesione> protegge ectoderma sovrastante da BMP4↳ induce formazione tubo neurale> formata da cellule turgide perché richiamano acqua

Centro di Nieuwkoop = cellule vegetative più dorsali (endoderma) che specificano mesoderma dorsale(notocorda e somiti) e organizzatore → ASSE DORSO-VENTRALE> mesoderma laterale e ventrale determinato da gradiente di morfogeni* morfogeni inducono differenziamenti diversi a seconda della distanza e al tempo di esposizionedelle cellule target

Totipotenza dei blastomeri

Spemann dimostrò che almeno fino allo stadio di 16 blastomeri i nuclei delle cellule mantengono latotipotenza:

1. strozzatura dello zigote: nucleo solo da una parte
2. formazione blastomeri → fino a 16
3. migrazione di 1 nucleo
4. strozatura e divisione dei blastomeri
5. formazione di 2 embrioni

tra i complessi di adesione cellulare3) β-catenina fosforilata viene degradata dal proteasoma4) senza β-catenina, i fattori di trascrizione TCF/LEF non possono attivare i geni target5) mancanza di attivazione dei geni target porta a difetti nello sviluppo embrionale