Metodologie di Embriologia Sperimentale

Embriologia sperimentale

Biologia dello sviluppo

Biologia dello sviluppo è lo studio dello sviluppo da fecondazione a organismo adulto.

Fasi dello sviluppo embrionale

1. Fecondazione

Fecondazione: cellula uovo + spermatozoo → zigote

2. Zigote

Zigote = cellula totipotente da cui si differenziano tutti i tipi cellulari (+200) ↳ Differenziamento = espressione genica differenziale dello stesso patrimonio genetico

3. Blastula

Blastula = formata da blastomeri tramite segmentazione ↳ veloci mitosi successive che portano alla divisione dello zigote in molte cellule senza aumento di volume * ciclo cellulare più corto: manca G1

4. Gastrula

Gastrula = organizzata in 3 foglietti embrionali:

• Ectoderma
• Mesoderma
• Endoderma

5. Morfogenesi

Morfogenesi = distribuzione delle cellule in base al tipo per dare forma all'embrione ↳ cruciale per il corretto sviluppo embrionale es: mutante Drosophila antenna sedia: antenne al posto degli occhi

6. Accrescimento

Accrescimento → divisione cellulare finemente regolata

• Riproduzione = assicura trasmissione del patrimonio genetico alla generazione successiva
• Induzione = ogni cellula embrionale risente dell'ambiente circostante es: notocorda (mesoderma) induce formazione del tubo neurale (ectoderma) * NO notocorda → NO tubo neurale
• Alcune strutture importanti per l'embrione possono scomparire o avere poco rilievo nell'adulto

Embriologia sperimentale

Embriologia sperimentale = studio di come funziona un embrione, attuato tramite alterazioni

Ambiente e sviluppo embrionale

Esempi

• Zebrafish:
  • Ambiente con alcohol → sviluppo completamente alterato: NO occhi, NO coda...
  • Ambiente influenza determinazione del sesso
• Rospo dai piedi a vanga:
  • Condizioni favorevoli → girini normali
  • Condizioni sfavorevoli → girini carnivori per velocizzare metamorfosi e aumentare le possibilità di sopravvivenza
• Talidomide = farmaco prescritto contro le nausee mattutine della gravidanza, causa focomelia = mancato sviluppo degli arti
  • Meccanismo studiato con zebrafish

Genetica dello sviluppo

Genetica dello sviluppo = studio dei mutanti con problemi nello sviluppo embrionale

• Geni regolatori dello sviluppo embrionale sono molto conservati

Esempi

• Gene per lo sviluppo dell'occhio è identico in Drosophila e nell'uomo:
  • Pax 6 nell'uomo (FT)
  • Twin of eyeless in Drosophila
• Gene per migrazione melanoblasti è identico in uomo e topo

Organizzazione cellulare in tessuti e organi

Mutagenesi

N-etil-N-nitrosurea (ENU) = sostanza usata per mutagenizzare spermatozoi ↳ ogni spermatozoo → 1 mutazione puntiforme random → maschio mutante × femmina normale → fenotipo mutante in F3

• Genetica diretta:
  • Mutazione random
  • Trovo fenotipo mutato
  • Risalgo a gene mutato
• Genetica inversa:
  • Mutagenesi del gene di interesse
  • Risalgo al fenotipo mutato

Manipolazione embrionale

Manipolazione embrionale → embriologia sperimentale studia i meccanismi alla base dei processi ontogenetici turbandone il naturale corso mediante manipolazione embrionale → studiare "chi fa cosa"

• Necessità di un controllo ↳ il più prossimo possibile all'esperimento stesso → deve contenere tutte le variabili es: iniezione di uno specifico mRNA per proteina di interesse controllo: iniezione con mezzo e acido nucleico (es: mRNA per GFP) variabili: iniezione, mezzo, acido nucleico
• Se fenotipo identico → dovuto a manipolazione, NON a overespressione del gene di interesse

Spemann-Mangold

Studiano "organizzatore" degli anfibi:

• Taglio regione dell'organizzatore da un embrione
• Attaccata su un altro embrione in posizione opposta all'organizzatore già presente
• Formazione di 2 embrioni attaccati
• Organizzatore dirige la formazione dell'intero organismo

Meccanismi di micromanipolazione

• Cutting = knockdown genico tramite oligonucleotidi antisenso

  esempio: Morfolino = oligonucleotide resistente alle nucleasi ↳ complementare a mRNA target ↳ appaiandosi impedisce traduzione ↳ può anche alterare splicing ↳ nell'adulto: può silenziare geni in alcuni tipi cellulari ↳ morfante = organismo con genoma wild type ma fenotipo mutante dovuto a silenziamento genico con morfolino

• Pasting → inserimento di materiale estraneo in un embrione

  esempio: mRNA, geni, cellule ↳ overespressione del messaggero inserito esempio: AgRP (= Agouti Related Peptide) = neuropeptide che regola appetito; → se overespresso: fenotipo embrionale e adulto più grosso * Transgenesi = inserimento di geni estranei in un embrione esempio: GFP → colorante verde fluorescente usato per studio dei tessuti in vivo (es: path finding dei neuroni)

• Painting

  Colorante iniettato nell'embrione:

  • Iniezione nello zigote → overespresso in tutto l'embrione
  • Iniezione in singolo blastomero → colora solo ciò che si origina da quel blastomero
  ↳ Mappa presuntiva

Mappe presuntive

Utili per tracciare linee di discendenza cellulare. Durante gastrulazione, la situazione è dinamica → diventa difficile seguire le cellule ↳ colorazione blastomeri per seguirle

• Differenziamento blastomeri dovuto a determinanti citoplasmatici localizzati (es: mRNA citoplasmatici che conferiscono particolari caratteristiche)
• Spostamento solco di segmentazione → spostamento determinanti citoplasmatici → cambiamento destino cellulare
• Styla partita: tunicato che presenta blastomeri con citoplasmi naturalmente pigmentati in modo diverso
• Facile seguire percorso differenziativo
• Colori convenzionali:
  • Blu → ectoderma
  • Rosso → mesoderma
  • Giallo → endoderma

Colorazioni

• Marcatura con coloranti vitali (Vogt, 1929)

  Coloranti vitali = colorano la cellula senza ucciderla esempio: Blu Nilo, Rosso Neutro

  • Agar colorato con coloranti vitali
  • Contatto agar con cellule da colorare
  • Cellule prendono il colore e possono essere seguite
  • Colorante si distribuisce via via nelle nuove cellule → sempre più debole

• Marcatura con radioisotopi
  • 1 embrione marcato radioattivamente ↳ timidina calda (DNA marcato)
  • 1 embrione normale
  • Taglio di un distretto da embrione marcato
  • Sostituzione del distretto nell'embrione normale
  • Tutte le cellule originate dal distretto caldo saranno radioattive

• Marcatura genetica
  • Da embrione di una specie (es: quaglia) taglio una regione embrionale
  • Trapianto regione in embrione di specie diversa (es: pollo)
  • Utilizzo di anticorpi per riconoscere le cellule estranee
  • Le 2 specie devono essere simili

• Marcatura con coloranti fluorescenti

  Non diffondono: caged ↳ iniettati in tutto lo zigote evidenziano una singola regione → embrioni immobilizzati in agarosio in posizioni ottimali → per localizzare regione di interesse → necessari altri marcatori di regioni già conosciute → fluorescenza visibile dopo fotoattivazione con laser della regione di interesse → permettono costruzione di mappe presuntive estremamente precise

Tecniche molecolari per studiare il differenziamento

Per studiare espressione genica si studia mRNA o trascritti a RNA

• Procedimento:
  • Estrazione RNA da zona di interesse
  • Northern blot
  • Confronto più zone → dove un mRNA è espresso e dove no
  • 1 o pochi geni contemporaneamente
  • Con embrioni giovani: informazione solo temporale
• Northern blot
  • Elettroforesi su gel di agarosio → supporto instabile
  • Trasferimento per capillarità su filtro di nitrocellulosa → molto più gestibile
  • Ibridazione con sonde marcate complementari a mRNA target

• RT-PCR (Real Time PCR)

  = PCR fatta su cDNA del messaggero di partenza → ottenuto tramite trascrittasi inversa

  • 2 primers che riconoscono cDNA target
  • Copiatura del cDNA target * presente solo in alcune zone
  • Analisi con elettroforesi
  • Lunghezza del messaggero non è importante
  • Analisi di splicing alternativi → più primers
  • Primers presi su esoni differenti * se contaminazione da DNA genomico → bande più lunghe perché contengono introni
  • Utilizzo fluorofori → visibile anche quantità iniziale di DNA
  • Con PCR serve sempre controllo negativo = miscela di reazione senza DNA

• Ibridazione in situ
  • Sonda marcata complementare al mRNA di interesse ↳ inserita in tutto l'embrione grazie a detergenti che bucano membrana cellulare
  • Interazione solo in cellule che esprimono mRNA target
  • Informazioni spazio-temporali
  • Aumento T→ solo sonde totalmente complementari legano mRNA target
  • Esempio:
    • Sonda marcata con digossigenina legata a uridina ↳ inserita in cellula
    • Per visualizzare: anticorpo per digossigenina coniugato con fosfatasi alcalina
    • Fosfatasi alcalina rimuove un P da substrato incolore → prodotto colorato
  • Utilizzabili più sonde marcate in modo diverso es: digossigenina, biotina, fluoresceina
  • Localizzazione più precisa: doppia ibridazione con un gene marcatore (che marca un territorio specifico)

• Immunoistochimica
  • Anticorpi riconoscono solo una forma della proteina ↳ proteina attiva/proteina inattiva
  • Esempio: proteina fosforilata riconosciuta; proteina defosforilata NON riconosciuta