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Metodologie biochimiche II

Appunti di Metodologie biochimiche basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof.ssa Porcelli dell’università degli Studi di Bologna - Unibo, Facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea magistrale in biologia molecolare e cellulare. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Metodologie biochimiche docente Prof. A. Porcelli

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Se, invece, sono separate in un gradiente continuo di pH dove migrano in base alla loro carica fino a raggiungere il

punto isoelettrico e la mia proteina avrà carica = 0 in quel preciso pH, allora, essendo a quel pH il numero di cariche

positive uguale al numero di cariche negative – con carica netta uguale 0 – la proteina non migrerà in quel gradiente

continuo di pH.

Tutte le proteine di una determinata specie si FOCALIZZERANNO in una zona di pH precisa. Questa è una tecnica ad

alta risoluzione.

Cosa vuol dire tutto questo?

Se ho un omogenato (una miscela) con delle proteine aventi un punto isolettrico acido o basico e se il pool di proteine lo

sottoponessi in un campo elettrico, applicando una differenza di potenziale, le proteine con un punto isolettrico basico

migreranno verso l’ANODO, mentre le proteine acide migreranno verso il CATODO.

Quando la proteina raggiunge nel gel il pH pari al suo punto isolettrico, si ha avuto il fenomeno della

FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA e non migrerà più.

Come viene fatto l’esperimento?.

Nell’eppendorf mi trovo con la miscela di proteine da separare mediante IEF. Per fare questa tecnica elettroforetica

devo disporre di striscioline e colorarle con IPG (una sostanza simile al Blu di Comassie). Ogni strisciolina ha un

determinato gradiente di pH (che va scelto sulla base della/e proteina/e nella miscela da separare). Queste striscioline

contengono degli ANFOLITI o IMMOBILINE, che sono delle miscele di ACIDI SINTETICI, che sono

COPOLIMERIZZATI con le molecole di ACRILAMIDE. Queste strip dobbiamo immaginarle come veli sottili di

acrilamide, con all’interno gli anfoliti e che ci consentono di far migrare la proteina finché essa non raggiungerà il pH

alla quale il numero di cariche positive non sarà uguale a quello di cariche negative

Ho un piatto da isoelettrofocalizzazione. L’operatore ha già avviato la corsa e le striscioline vengono colorate con IPG.

Le striscioline hanno allora questo gradiente di pH, che sarà importante al fine di separare le proteine in base alla carica.

C’è un differente gradiente di pH nella strisciolina e le proteine vengono

Il SEPARATORE è un apparecchio che permette di caricare le proteine nei diversi pozzetti, poi si applica la differenza

di potenziale che fa separare le proteine in relazione al loro punto isolettrico.

Quali sono le fasi che possiamo riassumere?

Si compra la strisciolina con gradiente di pH idoneo

 A strisciolina viene idratata con dei buffer idonei

 La strisciolina viene messa sul piatto per IEF

 Si caricano 100-500 μg di proteina

 Si applica una piccola differenza di potenziale per far adsorbire il campione sulla strisciolina

Va specifica che sono gli ANFOLITI che permettono di mantenere la distribuzione del pH, dal momento che ci sono

ANFOLITI basici e acidi.

Avrò delle proteine con un punto isolettrico acido che migrano verso il CATODO e delle proteine con un punto

isolettrico basico che migreranno verso l’ANODO.

La migrazione quindi avviene e quando la proteina è giunta nel pH che corrisponde al suo punto isolettrico (quando la

sua carica netta è 0) si ferma, infatti la migrazione elettroforetica è direttamente proporzionale alla carica della molecola

migrante.

Si parte da un Voltaggio di 50 Volt affinché venga ADSORBITO il campione sulla strip e poi si aumenta il voltaggio

fino a 8000 Volt, a temperatura di 18 °C per un tempo di 24 ore circa. Le strip sono poi colorate con il colorante BLU o

altri coloranti diversi.

Per determinare il punto isolettrico di una proteina si usa una miscela di proteine a punto isolettrico noto, che migra con

la nostra proteina. Insomma, utilizzo delle proteine MARKER di cui conosco il peso molecolare, e in base alla

migrazione potrò costruirmi delle curve di calibrazione.

Abbiamo delle proteine con diversi valori di punto isoelettrico e diverse dimensioni e vengono separate in base ad una

variazione di pH. Proteine con masse diverse ma punto isolettrico simile, sono separate nella stessa zona della strip.

Posso separare allora proteine native in base al loro punto isolettrico e si tratta di un tipo di elettroforesi a più alta

risoluzione rispetto all’SDSPage.

Se unico l’approccio di elettroforesi per SDSPage alla IEF, ottengo la IEF. Per fare la IEF le proteine devono essere

denaturate, infatti con la SDS page, il sodiododecilsolfato si unisce alle proteine ogni due amminoacidi e le carica

negativamente.

Le strip che scelgo hanno diversi range di pH che scelgo e hanno lunghezza differente (7-11-13-24 centimetri). Va

ricordato che più il gradiente è largo, meno è la risoluzione. Per contro, meno il gradiente è largo, maggiore è la

risoluzione.

ELETTROFORESI 2D o BIDIMENSIONALE (ISOELETTROFOCALIZZAZIONE + SDSPage)

Possiamo fare un ouverture interessante di questa tipologie di elettroforesi: si parla di bidimensionale, quindi ci sono

due dimensioni. Ebbene, la prima è la ISOELETTROFOCALIZZAZIONE, la seconda è la SDSPage.

Con la IEF separiamo le proteine native sul loro punto isoelettrico, in seguito – con la seconda dimensione – le

separiamo in base al PESO MOLECOLARE (dopo averle immerse e denaturate in SDS).

Un gel bidimensionale appare come un gel ricco di spot (o macchie), in cui le proteine sono messe in evidenza nei

diversi modi possibili (radioattivamente, mediante colorazione, fluorescenza, o Silver staining).

Questa tipologie di elettroforesi ci consente di poter valutare le modifiche post-traduzionali della proteina. Possiamo

usarla per studiare:

• ISOENZIMI

• Valutare pattern di espressione proteica nel tessuto che stiamo studiando

• Valutare la MASSA delle proteine

• Identificare INTERATTORI della proteina che sto studiando.

La elettroforesi bidimensionale, assieme alla SPETTROMETRIA è alla base degli studi della PROTEOMICA.

La proteomica si avvale della ELETTROFORESI 2D (SDSPage + IEF) e di spettometri di massa per studiare il

PROTEOMA (nonché il corredo proteico) di una determinata cellula, tessuto od organo.

Come funziona la elettroforesi bidimensionale?

La striscia è presa dal piatto di IEF ed è inserita in una vaschetta contenente SDS e si incuba per mezzora-un’ora, al fine

di denaturare la proteina e caricarla negativamente.

La strisciolina viene quindi caricata nel gel SDS ed effettuaimo una corsa elettroforetica normale e le proteine con il

Peso molecolare diverso, migreranno in direzione perpendicolare a come sono migrate nella IEF.

La striscia si mette sul RUNNING GEL della cella di

SDSPage e la proteina caricata negativamente si sposta verso

l’ANODO (+). Dopo l’SDSPAge otteniamo delle bande

lineari. Quindi coloro il GEL con un colorante.

Nella IEF ogni spot corrisponde ad una proteina diversa da

un’altra. Certo va ricordato che questo concetto vale qualora

abbia un range di pH basso, che consente di avere una

risoluzione maggiore.

Più stretto è il range di pH usato e più proteina carica e

migliore è la separazione tra le bande. E’ anche vero il

contrario. Se in un range di pH da 4 a 7, cambio strip e

restringo il range da 5 a 6 (caricando anche maggior quantità

di proteina), se prima vedevo un’unica banda bilobata,

restringendo il range di pH vedo due bande staccate.

Se ho adoperato un gradiente di pH idoneo e una

concentrazione proteica corretta, posso prendere la proteina e analizzarla con lo spettrometro di massa.

BLUNATIVEPage

Come dice il nome, si tratta di una metodica elettroforetica nativa e le proteine mantengono la loro attività e il loro

folding e sono separate, per lo più sulla dimensione e meno sulla base della carica.

Perché dobbiamo studiare questo tipo di elettroforesi?

Perché negli ultimi 4-5 anni è una tecnica molto usata da chi studia i MITOCONDRI e possiamo separare in condizione

nativa dei COMPLESSI PROTEICI (come AGGREGATI di PROTEINE in AMBIENTE CELLULARE e

CITOSOLICO.

La tecnica è molto utilizzata per identificare il FENOTIPO BIOCHIMICO di MUTAZIONI a carico della CATENA

RESPIRATORIA.

Le mutazioni del DNA MITOCONDRIALE, negli ultimi 10 anni, sono state associate a PATOLOGIE

NEURODEGENERATIVE e TUMORI.

La tecnica permette di identificare delle mutazioni a carico del DNA MITOCONDRIALE. Si tratta di una tecnica di

elettroforesi che utilizza il gel di POLIACRILAMIDE a gradiente, perché devo separare de complessi proteici molto

grossi. Quindi devo avvalermi di un SETACCIO MOLECOLARE per separare grandi range di pesi molecolari.

E’ una tecnica nativa e la proteina mantiene il suo folding e la sua attività. La proteina migrerà in base alla sua

dimensione. E’ molto utilizzata per lo studio di complessi proteici.

I primi ad utilizzarla furono due scienziati nel 1991. Questi due ricercatori separarono nel gel i complessi I, II, III, IV e

V della catena respiratoria.

Come si prepara il campione per sottoporlo a questa separazione?

Se devo separare i complessi della catena respiratoria devo utilizzare delle cellule del paziente in cui il genetista

molecolare ha identificato la mutazione su geni che codificano per le proteine che vanno a far parte dei complessi della

catena respiratoria. Devo capire se la mutazione è silente o se altera il normale fenotipo biochimico.

Allora estraggo i mitocondri dalle cellule del paziente, perché devo studiare le proteine mitocondriale (-.-‘) e li preparo.

Li preparo mediante CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE a 13.000 rpm per ottenere i mitocondri CRUDI.

Oltre al reticolo endoplasmico legato ai mitocondri devo estrarre le proteine sulla membrana interna mitocondriale. C’è

da solubilizzare i complessi respiratori della membrana interna dei mitocondri.

Allora sorge spontanea una domanda: come ottengo i complessi della membrana interna dei mitocondri?

Mi avvalgo di un detergente NON IONICO DELIPIDIZZANTE (N-dodecil β-D-Maltoside), che delipidizza le

membrane mitocondriale e vengono rimossi i complessi respiratori dalle membrane interne, senza aver usato detergenti

denaturanti. La solubilizzazione mitocondriale è anche aiutata da ACIDO AMINOCAPROICO. Quindi centrifugo a

20.000g per 30 minuti a 4 °C e ottengo un SURNATANTE con le proteine che sono i complessi della catena

respiratoria mitocondriale.

Recupero il mo sovranatante e aggiungo il colorante Serva Blu G-250, e carico i campioni sul gel di

POLIACRILAMIDE al 5-12%. Solitamente, il gradiente per studiare i complessi della catena respiratoria è del 5-12%.

La parte più bassa è al 12% per separare complessi respiratori più piccoli, mentre la parte alta è al 5% per separare

complessi respiratori più grossi.

Uso il Serva Blu G-250 come colorante, che è un derivato del Blu di Comassie e possiede un po’ la funzione dell’SDS,

andando a caricare negativamente le proteine, ma senza andare a DENATURARLE (a differenza dell’SDS) e le

proteine che ho solubilizzati avranno tutte una carica negativa e le potrò separare in un campo elettrico, sfruttando la

loro mobilità differenziale verso l’ANODO.

Oltre a caricare negativamente le proteine, questo Serva Blu mi permette di seguire anche la CORSA

ELETTROFORETICA, dal momento che possiede una colorazione BLU. Questa tecnica mi permette di studiare il

fenotipo BIOCHIMICO MITOCONDRIALE.

Abbiamo detto che questa tecnica ci permette di studiare il fenotipo biochimico di mutazioni mitocondriale. La catena

respiratoria mitocondriale è formata da vari complessi proteici (proteine grosse costituite da varie subunità proteiche).

COMPLESSO I: formato da 43 subunità, di cui 4 sono codificate da geni esclusivamente del DNA

 mitocondriale e altre 39 sono codificate da GENI NUCLEARI e, in seguito alla sintesi a livello citoplasmatico,

sono portate a livello dei mitocondri.

COMPLESSO II: Tutto a codifica nucleare

 COMPLESSO III: ha una sola subunità codificata dal DNA MITOCONDRIALE (che è il CITOCROMO B).

 COMPLESSO IV: ha 3 subunità codificate dal DNA MITOCONDRIALE (come COX1, COX2 e COX3)

 COMPLESSO V: è l’ATPsintasi, che possiede due subunità codificate dal DNA MITOCONDRIALE (l’A8 e

 la A6), tutte le altre sono codificate dal nucleo.

Questa tecnica permette di studiare dal punto di vista biochimico il FENOTIPO di una mutazione. Sappiamo che la

catena respiratoria comprende diversi complesso, che sono complessi proteici grossi formati da differenti sub unità.

Il COMPLESSO PRIMO è formato da 43 differenti sub unità, che comprendono 6 subunità dette ND1, ND3, ND3,

ND4, ND5 e ND6, che sono a codifica mitocondriale, cioè sono prodotte dall’espressione di geni che sono contenuti nel

DNA mitocondriale. Le altre 39 subunità del complesso primo, invece, sono a codifica nucleare, quindi vengono

prodotte nel citoplasma come tutte le proteine e trasportate in un secondo momento a livello del mitocondrio.

Il COMPLESSO SECONDO è formato da sub unità tutte a codifica nucleare.

Il COMPLESSO TERZO comprende solo una sub unità che è il citocromo B che viene codificato dal DNA

mitocondriale.

Il COMPLESSO QUARTO ha 2 subunità codificate da DNA mitocondriale che sono COX 2 e COX 3.

Il COMPLESSO QUINTO, cioè l’ATP SINTASI, ha anch’esso due sub unità a codifica mitocondriale che sono la A8 e

la A6.

Se la catena respiratoria non funziona o è presente una mutazione a livello del DNA mitocondriale o a livello del DNA

nucleare, in geni che codificano per delle sub unità dei complessi respiratori che fanno parte di essa.

Negli ultimi anni sono state individuate molte mutazioni a livello di geni nucleari che codificano per sub unità dei

complessi: un esempio è la sindrome di LEIGH e le encefaliti.

Uno dei geni la cui mutazione provoca patologie è NDUFA 1, che codifica per una sub unità del complesso primo, ed è

un gene nucleare.

Mutazioni a carico del complesso primo nelle sub unità ND a sintesi mitocondriale sono state associate a diversi tipi di

CANCRO.

Mutazioni nella sub unità ND1 è stata associata a carcinoma renale e tiroideo, carcinomi che sono stati chiamati

ONCOCITOMI, in quanto sono tumori in cui le cellule sono ricche e ripiene di mitocondri.

Mutazioni a livello di sub unità SDH B, SDH C e SDH D del complesso secondo, che sono tutte a codifica nucleare,

sono state associate a un carcinoma benigno del rene.

Questa tecnica permette, quindi, di studiare una mutazione e il suo fenotipo biochimico, cioè che conseguenze ha la

mutazione. Per studiare il fenotipo biochimico di una mutazione probabile a carico di proteine dei complessi della

catena respiratoria, codificate da un gene mitocondriale o nucleare, si può applicare, quindi, l’elettroforesi BLU

NATIVE.

Per fare l’elettroforesi blu native è necessario preparare il gel a gradiente (il gradiente più utilizzato per andare a

separare le proteine mitocondriali è a gradiente 5-12%) e si caricano in esso circa 80 ng di proteine mitocondriali

solubilizzate dai mitocondri.

Si effettua, poi, la corsa elettroforetica e si colora il gel ottenuto con il colorante blu di Coomassie per l’identificazione

delle bande delle proteine.

Dopo la separazione, nel gel si possono identificare i diversi complessi, che vengono separati nel gradiente in base alla

loro DIMENSIONE:

- il complesso primo è il più pesante (880 kDa)

- il complesso quinto pesa 600 kDa

- il complesso terzo pesa 485 kDa

- il complesso quarto pesa 200 kDa

- il complesso secondo pesa 130 kDa.

Nella parte più alta del gel, dove il gel a gradiente ha la concentrazione minore e le bande più lasse, si ottengono le

proteine a maggior peso molecolare, mentre nella parte più bassa, in cui il gel a gradiente ha la concentrazione minore,

ci sono le proteine a peso molecolare minore.

Nel gel si ottengono, quindi, le bande in cui sono presenti i diversi complessi della catena respiratoria, e questi sono

nella loro FORMA NATIVA, perché il gel utilizzato non è denaturante. Ciò permette di fare quella che viene detta IN

GEL ACTIVITY del complesso primo (nel nostro caso, perché stiamo ricercando il fenotipo biochimico di una

probabile mutazione a carico di una sub unità del complesso primo).

La IN GEL ACTIVITY permette di vedere la PRESENZA del complesso primo nel campione che è stato caricato nel

gel: si può, infatti, andare a studiare se è presente il complesso primo andando a vedere se nel gel è presente la sua

attività. Essendo esso nella sua forma nativa, esso conserva la sua FUNZIONE, quindi se si aggiunge al gel un

SUBSTRATO di questo complesso enzimatico è possibile valutare se esso è presente nel campione, semplicemente

guardando se è presente la sua attività.

Il complesso primo è una DEIDROGENASI e utilizza NADH della glicolisi, quindi, se voglio vedere se il complesso

primo deidrogenasi è presente nel gel, si aggiunge al gel il suo substrato NADH: si scioglie NADH e lo si aggiunge al

gel.

Per RILEVARE l’ATTIVITA’ si aggiunge al gel l’MTT (sale di tetrazolio) che, quando viene ridotto dalle

deidrogenasi, forma un sale di FORMAZANO che precipita e ha una colorazione BLU.

Se, quindi, nella lane cui ho caricato l’estratto proteico di mitocondri di una cellula è presente la colorazione blu (banda

blu) significa che in quei mitocondri è presente il complesso primo, ed è anche funzionale. Se, invece, nella lane non

vedo la banda blu corrispondente al complesso primo, significa che ho una MUTAZIONE TRONCATIVA nella sub

unità ND1 (ad esempio) del complesso primo, e quindi i mitocondri che ho caricato in quella lane mancano del

complesso primo.

Una volta fatta la blu native in una prima dimensione, quindi, si ottiene il gel.

L’attività del complesso primo può essere identificata a seconda delle esigenze: il genetista dice al biochimico che in

una certa sub unità del complesso primo potrebbe essere presente una mutazione. Il biochimico fa esperimenti poi per

rivelare se quella sub unità specifica (o quel complesso specifico) ha realmente la mutazione.

Una volta fatta la BLU NATIVE, si ottiene il gel e si può valutare in esso l’attività del complesso in questione.

Supponiamo di aver fatto un gel e di aver visto che (nonostante il genetista molecolare abbia detto che in una subunità

del complesso primo è probabilmente presente una mutazione) il complesso primo nel gel ha ancora un po’ di attività.

Siccome c’è ancora un po’ di attività, si direbbe che non sia presente nessun effetto fenotipico e che questa mutazione

non è così penetrante da dare un difetto a livello della catena respiratoria, perché il complesso primo continua a

funzionare.

Potrebbero, però, esserci delle mutazioni che vanno ad alterare l’ASSEMBLAGGIO delle diverse sub unità del

complesso: in questo caso, quindi, non si tratta di un difetto funzionale dato dalla mutazione, ma di un difetto nella

formazione del complesso primo e nel suo assemblaggio.

I complessi respiratori, a livello della membrana interna dei mitocondri, sono organizzati in pacchetti di proteine che

non lavorano in modo separato ed isolato, ma si mescolano tra loro per la formazione di quelli che vengono detti

SUPERCOMPLESSI.

Nella membrana mitocondriale, infatti, possono essere presenti supercomplessi formati dal complesso 1, 2 e 4, che si

organizzano a formare moduli strutturali e funzionali detti appunto supercomplessi.

Possono essere presenti anche:

- supercomplessi formati dal complesso 1+3;

- supercomplessi formati dal complesso 1 più due complesso 3;

- supercomplessi formati dal complesso 3+4, in cui il complesso 3 può essere presente anche due volte e il

complesso 4 anche;

- supercomplessi formati dal complessi 1, complesso 3 e 4, in cui il complesso 3 può essere presente anche 2

volte e il complesso 4 può essere presente da 1 a 4 volte.

Si possono, quindi, formare a livello della membrana interna dei mitocondri delle piattaforme funzionali nella catena

respiratoria che aumentano l’efficacia della catena di trasporto degli elettroni, che in questo modo si scambiano più

facilmente rispetto ad una catena formata da complessi separati.

Per poter evidenziare e studiare i SUPERCOMPLESSI si fa una SECONDA dimensione su un gel BLU NATIVE: con

la blu native abbiamo detto che separo con essa i diversi complessi proteici e che permette di studiare in vitro il fenotipo

di una mutazione.

Se si è bravi, con questa tecnica è possibile anche valutare l’attività dei complessi che si separano, perché la proteina è

una proteina nativa che mantiene la sua attività, in quanto il gel non è denaturante.

I complessi respiratori, però, non sono organizzati in complessi separati, ma formano delle piattaforme di proteine per

aumentare l’efficienza di funzionamento della catena di trasporto degli elettroni: alcune mutazioni possono alterare


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia molecolare e cellulare
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher paolo.morandi.1987 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Metodologie biochimiche e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Porcelli Annamaria.

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