Metodologie biochimiche II

NATIVE.

Per fare l’elettroforesi blu native è necessario preparare il gel a gradiente (il gradiente più utilizzato per andare a

separare le proteine mitocondriali è a gradiente 5-12%) e si caricano in esso circa 80 ng di proteine mitocondriali

solubilizzate dai mitocondri.

Si effettua, poi, la corsa elettroforetica e si colora il gel ottenuto con il colorante blu di Coomassie per l’identificazione

delle bande delle proteine.

Dopo la separazione, nel gel si possono identificare i diversi complessi, che vengono separati nel gradiente in base alla

loro DIMENSIONE:

- il complesso primo è il più pesante (880 kDa)

- il complesso quinto pesa 600 kDa

- il complesso terzo pesa 485 kDa

- il complesso quarto pesa 200 kDa

- il complesso secondo pesa 130 kDa.

Nella parte più alta del gel, dove il gel a gradiente ha la concentrazione minore e le bande più lasse, si ottengono le

proteine a maggior peso molecolare, mentre nella parte più bassa, in cui il gel a gradiente ha la concentrazione minore,

ci sono le proteine a peso molecolare minore.

Nel gel si ottengono, quindi, le bande in cui sono presenti i diversi complessi della catena respiratoria, e questi sono

nella loro FORMA NATIVA, perché il gel utilizzato non è denaturante. Ciò permette di fare quella che viene detta IN

GEL ACTIVITY del complesso primo (nel nostro caso, perché stiamo ricercando il fenotipo biochimico di una

probabile mutazione a carico di una sub unità del complesso primo).

La IN GEL ACTIVITY permette di vedere la PRESENZA del complesso primo nel campione che è stato caricato nel

gel: si può, infatti, andare a studiare se è presente il complesso primo andando a vedere se nel gel è presente la sua

attività. Essendo esso nella sua forma nativa, esso conserva la sua FUNZIONE, quindi se si aggiunge al gel un

SUBSTRATO di questo complesso enzimatico è possibile valutare se esso è presente nel campione, semplicemente

guardando se è presente la sua attività.

Il complesso primo è una DEIDROGENASI e utilizza NADH della glicolisi, quindi, se voglio vedere se il complesso

primo deidrogenasi è presente nel gel, si aggiunge al gel il suo substrato NADH: si scioglie NADH e lo si aggiunge al

gel.

Per RILEVARE l’ATTIVITA’ si aggiunge al gel l’MTT (sale di tetrazolio) che, quando viene ridotto dalle

deidrogenasi, forma un sale di FORMAZANO che precipita e ha una colorazione BLU.

Se, quindi, nella lane cui ho caricato l’estratto proteico di mitocondri di una cellula è presente la colorazione blu (banda

blu) significa che in quei mitocondri è presente il complesso primo, ed è anche funzionale. Se, invece, nella lane non

vedo la banda blu corrispondente al complesso primo, significa che ho una MUTAZIONE TRONCATIVA nella sub

unità ND1 (ad esempio) del complesso primo, e quindi i mitocondri che ho caricato in quella lane mancano del

complesso primo.

Una volta fatta la blu native in una prima dimensione, quindi, si ottiene il gel.

L’attività del complesso primo può essere identificata a seconda delle esigenze: il genetista dice al biochimico che in

una certa sub unità del complesso primo potrebbe essere presente una mutazione. Il biochimico fa esperimenti poi per

rivelare se quella sub unità specifica (o quel complesso specifico) ha realmente la mutazione.

Una volta fatta la BLU NATIVE, si ottiene il gel e si può valutare in esso l’attività del complesso in questione.

Supponiamo di aver fatto un gel e di aver visto che (nonostante il genetista molecolare abbia detto che in una subunità

del complesso primo è probabilmente presente una mutazione) il complesso primo nel gel ha ancora un po’ di attività.

Siccome c’è ancora un po’ di attività, si direbbe che non sia presente nessun effetto fenotipico e che questa mutazione

non è così penetrante da dare un difetto a livello della catena respiratoria, perché il complesso primo continua a

funzionare.

Potrebbero, però, esserci delle mutazioni che vanno ad alterare l’ASSEMBLAGGIO delle diverse sub unità del

complesso: in questo caso, quindi, non si tratta di un difetto funzionale dato dalla mutazione, ma di un difetto nella

formazione del complesso primo e nel suo assemblaggio.

I complessi respiratori, a livello della membrana interna dei mitocondri, sono organizzati in pacchetti di proteine che

non lavorano in modo separato ed isolato, ma si mescolano tra loro per la formazione di quelli che vengono detti

SUPERCOMPLESSI.

Nella membrana mitocondriale, infatti, possono essere presenti supercomplessi formati dal complesso 1, 2 e 4, che si

organizzano a formare moduli strutturali e funzionali detti appunto supercomplessi.

Possono essere presenti anche:

- supercomplessi formati dal complesso 1+3;

- supercomplessi formati dal complesso 1 più due complesso 3;

- supercomplessi formati dal complesso 3+4, in cui il complesso 3 può essere presente anche due volte e il

complesso 4 anche;

- supercomplessi formati dal complessi 1, complesso 3 e 4, in cui il complesso 3 può essere presente anche 2

volte e il complesso 4 può essere presente da 1 a 4 volte.

Si possono, quindi, formare a livello della membrana interna dei mitocondri delle piattaforme funzionali nella catena

respiratoria che aumentano l’efficacia della catena di trasporto degli elettroni, che in questo modo si scambiano più

facilmente rispetto ad una catena formata da complessi separati.

Per poter evidenziare e studiare i SUPERCOMPLESSI si fa una SECONDA dimensione su un gel BLU NATIVE: con

la blu native abbiamo detto che separo con essa i diversi complessi proteici e che permette di studiare in vitro il fenotipo

di una mutazione.

Se si è bravi, con questa tecnica è possibile anche valutare l’attività dei complessi che si separano, perché la proteina è

una proteina nativa che mantiene la sua attività, in quanto il gel non è denaturante.

I complessi respiratori, però, non sono organizzati in complessi separati, ma formano delle piattaforme di proteine per

aumentare l’efficienza di funzionamento della catena di trasporto degli elettroni: alcune mutazioni possono alterare

l’attività di un complesso, ma anche la funzione dei supercomplessi, che sono alla base del buon funzionamento di una

catena respiratoria.

Come si evidenzia ciò?

La potenziale ALTERAZIONE DI FORMAZIONE dei supercomplessi può essere evidenziata ASSOCIANDO la BLU

NATIVE con una SECONDA DIMENSIONE di SDS-PAGE.

Il complesso primo è stato separato mediante la BLU NATIVE nella prima dimensione; per studiare se l’assemblaggio

delle sue sub unità è avvenuto in maniera corretta, esso deve essere DISGREGATO il più possibile nelle sub unità che

lo compongono e per fare ciò si utilizza la SDS-PAGE con il gel DENATURANTE.

A causa del gel denaturante e del fatto che il complesso viene disgregato, esso perde la sua attività e viene separato

nelle sue diverse sub unità in base al PESO MOLECOLARE delle singole sub unità che lo formano.

Quindi, si prende il gel ottenuto dalla blu native in cui ci sono i diversi complessi respiratori ancora funzionanti e

assemblati. La striscia si incuba: dal gel si taglia via la striscia e si pone in una vaschetta contenente SDS, dove si

incuba per 30 minuti o un’ora. In questo modo, grazie all’SDS, le proteine vengono DENATURATE e CARICATE

tutte negativamente.

Poi, si carica la striscia con le proteine su un running gel da SDS-PAGE classico: la striscia di gel viene caricata sul

running gel in modo identico al pettine con cui si formano i pozzetti.

Si applica, poi, il campo elettrico per fare la SDS-PAGE e le proteine possono così migrare e separarsi in relazione al

loro peso molecolare.

Per poter identificare le differenti sub unità si procede con un classico WESTERN BLOT: le proteine separate nel gel di

SDS-PAGE vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa.

Sul filtro di nitrocellulosa ho così le diverse sub unità del mio complesso respiratorio, che posso ora andare a

identificare mediante l’utilizzo di ANTICORPI MARCATI.

Non esistono ancora degli anticorpi per tutte le sub unità dei complessi respiratori, ma solo per alcune.

L’identificazione delle differenti sub unità presenti sul filtro permette di vedere se sono tutte presenti e quindi permette

di valutare se l’assemblaggio del complesso è corretto.

Vediamo un esempio di complesso primo, quinto e quarto: ho complessi respiratori separati in una dimensione in blu

native. Sono poi stati separati in seconda dimensione con SDS-PAGE.

Nella prima dimensione con blu native, i diversi complessi vengono separati tra loro in base al loro peso molecolare, ma

sono ancora funzionanti, perché il gel non è denaturante e essi rimangono formati dalle loro sub unità; nella seconda

dimensione, con l’SDS-PAGE, il complesso di interesse (che si è tagliato dal gel blu native e si è caricato sul running

gel per la SDS-PAGE) viene separato nelle diverse sub unità che lo formano, quindi non è più funzionante dopo ciò.

Le diverse sub unità ottenute sul gel di SDS-PAGE vengono, poi, trasferite sul filtro di nitrocellulosa per fare il Western

blot, dove posso andare a identificarle utilizzando anticorpi specifici per esse.

Se, ad esempio, uso l’anticorpo per NDUF S3, una sub unità del complesso primo a sintesi nucleare, posso identificare

la presenza delle diverse sub unità del complesso primo.

L’anticorpo specifico per una sola sub unità del complesso primo può andare a riconoscere più bande ottenute dalla

SDS-PAGE fatta, ad esempio, sul complesso primo: ciò indica che il complesso primo è un complesso molto grosso,

che si frammenta non in singole sub unità, ma in SUBCOMPLESSI, quindi posso avere più sub complessi in cui è

presente la sub unità per cui ho usato l’anticorpo specifico.

Il complesso primo è stato frammentato in sub complessi e non in singole subunità, che contengono tutti la sub unità in

questione.

Vediamo, ora, un vero e proprio esperimento: abbiamo dei mitocondri estratti da cellule di controllo, cioè cellule che

non hanno nessuna mutazione mitocondriale, e abbiamo anche mitocondri estratti da cellule di un paziente con una

probabile mutazione mitocondriale a carico del complesso primo.

Se uso anticorpi contro le sub unità 39, 20 e 17, che sono i 3 anticorpi che sono commerciali e che esistono per

identificare il complesso primo, nel controllo ci sono 3 bande molto larghe, mentre nel paziente, le stesse 3 bande sono

quasi assenti. Ciò indica che la mutazione nei mitocondri del paziente porta a problemi nell’assemblaggio del

complesso primo. I pazienti