Metodologie biochimiche II

Il Western Blot e le tecniche immunochimiche

Il Western Blot è una tecnica che rientra tra quelle immunochimiche, che si avvale di una reazione antigene-anticorpo tipico del test ELISA. Abbiamo un anticorpo primario, che riconosce la proteina antigenica specifica (che dobbiamo mettere in evidenza). L’anticorpo primario, a sua volta, viene riconosciuto da un anticorpo secondario marcato.

Anticorpi primari e secondari

Va ricordato che, di solito, l’anticorpo primario è prodotto da una specie diversa rispetto alla specie da cui prendiamo l’anticorpo secondario anti-anticorpo primario. Questo per evitare fenomeni di cross-reattività aspecifici. L’anticorpo secondario potrà essere coniugato con enzimi (e la detection avverrà avvalendosi di un substrato che, in seguito all’azione dell’enzima coniugato con l’anticorpo secondario, potrà portare alla modifica del substrato, che potrebbe diventare colorato), altrimenti con isotopi radioattivi o con fluorocromi.

Tecniche di marcatura

La proteina si trova sul filtro di nitrocellulosa e l’anticorpo primario, dopo aver incubato con latte scremato, riconosce specificamente la proteina antigenica e l’anticorpo secondario riconosce il primo. Possiamo avere un anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano, per esempio. In presenza del substrato acqua ossigenata, questo viene ridotto ad acqua, portando alla liberazione di due ossigeni, che, legandosi a una sostanza detta luminolo, ossidandolo, è in grado di generare luce a 480 nm. È usato in chemioluminescenza. In alternativa, l’anticorpo può essere marcato con fosfatasi alcalina.

Va specificato che, mentre la perossidasi di rafano è più che altro adoperata con organismi vegetali, la fosfatasi alcalina è più che altro usata con mammiferi. L’anticorpo può essere marcato con l’isotopo 125 dello iodio, una tecnica altamente specifica ed economica, ma lavoro con del radioattivo e, per i motivi di radioattività deleteria all’organismo, sono poco adoperati. Possiamo usare anticorpi anche legati a fluorocromi, come fluoresceina (emette nel verde) o rodamina (emette nel rosso).

Oppure possiamo adoperare degli anticorpi biotinilati, in una tecnica d’immunoistochimica. La biotina sarebbe la vitamina H. La biotina ha elevata affinità per la streptavidina. La streptavidina la possiamo coniugare all’anticorpo primario, mentre la biotina all’anticorpo secondario. Il riconoscimento altamente specifico di anticorpo secondario-anticorpo primario, fa sì che la biotina si unisca alla streptavidina e saremmo in grado di vedere particolari cose. La fosfatasi alcalina utilizza un substrato salino. Idrolizza il sale formando dei componenti intermedi che dimerizzano e si producono due idrogenioni (H⁺) che riducono il blu tetrazolio e con una colorazione blu sono in grado di vedere la formazione delle bande.

GEL in gradiente

Per le proteine utilizziamo il gel di poliacrilamide di solito e possono essere fatti in condizioni native o denaturanti. Un gel in poliacrilamide denaturante è il classico SDSPage con i detergenti. I gel nativi, invece, non hanno il detergente e ho la proteina con la sua attività e la sua funzione.

Per le proteine, normalmente, parlo di gel al 4% o a concentrazioni diverse a seconda della proteina da separare, ma posso usare dei gel a gradiente costituiti da un gradiente di poliacrilamide. Questi gel a gradiente servono per aumentare l’intervallo di separazione tra vari pesi molecolari.

Con il gel in poliacrilamide posso separare le proteine sia ad alto che a basso peso molecolare e possono essere denaturanti o nativi, a seconda se uso o meno il detergente. Per fare queste tipologie di gel devo adoperare un formatore di gradiente o gradientatore, che è costituito da due tubi collegati da una valvola. Nei due tubi sono messe due soluzioni 5-25% di gradiente. Nel tubo A (quello più lontano) metto una percentuale di acrilamide del 5%, mentre nel tubo B metto una concentrazione di acrilamide del 25%. Si apre la valvola, parte la pompa peristaltica, per avere un flusso lineare e continuo della soluzione che esce e si ottiene il gel a gradiente.

Il gradiente è diverso a seconda delle proteine da separare e posso separare proteine maggiori o minori. Questo gel consente di separare delle proteine con pesi simili, ma diversi. La concentrazione maggiore del gradiente è nella parte bassa, dove ho maglie piccole e qui vengono separate le proteine più piccole. La concentrazione minore del gradiente è nella parte alta, dove ho le maglie grandi e qui vengono separate le proteine più grandi. Questo gel può essere usato nelle due tecniche di elettroforesi su gel, quali:

• Elettroforesi bidimensionale 2D, ottenuta dalla prima dimensione isoeletrofocalizzazione e dalla seconda dimensione SDSPage (eseguita in un secondo tempo).

Elettroforesi bidimensionale 2D

È una tecnica costituta dalla isoelettrofocalizzazione (IEF) e dalla SDSPage. Si tratta di un'elettroforesi che consente di separare le macromolecole (proteine nel nostro caso) cariche in base al loro punto isoelettrico. Sfruttando il punto isolettrico delle proteine (la SDSPage sfrutta la massa delle proteine), questo tipo di elettroforesi, separa le proteine ed è più discriminante e a più alta risoluzione in confronto all’SDSPage. Infatti, è un tipo di elettroforesi che separa anche delle proteine che differiscono tra loro di 0,01 unità di pH. Se, invece, sono separate in un gradiente continuo di pH dove migrano in base alla loro carica fino a raggiungere il punto isoelettrico e la mia proteina avrà carica = 0 in quel preciso pH, allora, essendo a quel pH il numero di cariche positive uguale al numero di cariche negative – con carica netta uguale 0 – la proteina non migrerà in quel gradiente continuo di pH.

Tutte le proteine di una determinata specie si focalizzeranno in una zona di pH precisa. Questa è una tecnica ad alta risoluzione. Cosa vuol dire tutto questo? Se ho un omogenato (una miscela) con delle proteine aventi un punto isolettrico acido o basico e se il pool di proteine lo sottoponessi in un campo elettrico, applicando una differenza di potenziale, le proteine con un punto isolettrico basico migreranno verso l’anodo, mentre le proteine acide migreranno verso il catodo. Quando la proteina raggiunge nel gel il pH pari al suo punto isolettrico, si ha avuto il fenomeno della focalizzazione isoelettrica e non migrerà più.

Esperimento di elettroforesi

Come viene fatto l’esperimento? Nell’eppendorf mi trovo con la miscela di proteine da separare mediante IEF. Per fare questa tecnica elettroforetica devo disporre di striscioline e colorarle con IPG (una sostanza simile al Blu di Comassie). Ogni strisciolina ha un determinato gradiente di pH (che va scelto sulla base della/e proteina/e nella miscela da separare). Queste striscioline contengono degli anfoliti o immobiline, che sono delle miscele di acidi sintetici, che sono copolimerizzati con le molecole di acrilamide. Queste strip dobbiamo immaginarle come veli sottili di acrilamide, con all’interno gli anfoliti e che ci consentono di far migrare la proteina finché essa non raggiungerà il pH alla quale il numero di cariche positive non sarà uguale a quello di cariche negative.

Ho un piatto da isoelettrofocalizzazione. L’operatore ha già avviato la corsa e le striscioline vengono colorate con IPG. Le striscioline hanno allora questo gradiente di pH, che sarà importante al fine di separare le proteine in base alla carica. C’è un differente gradiente di pH nella strisciolina e le proteine vengono separate.

Separatore e fasi di elettroforesi

Il separatore è un apparecchio che permette di caricare le proteine nei diversi pozzetti, poi si applica la differenza di potenziale che fa separare le proteine in relazione al loro punto isoelettrico. Quali sono le fasi che possiamo riassumere?

• Si compra la strisciolina con gradiente di pH idoneo.
• La strisciolina viene idratata con dei buffer idonei.
• La strisciolina viene messa sul piatto per IEF.
• Si caricano 100-500 µg di proteina.
• Si applica una piccola differenza di potenziale per far adsorbire il campione sulla strisciolina.

Va specificato che sono gli anfoliti che permettono di mantenere la distribuzione del pH, dal momento che ci sono anfoliti basici e acidi. Avrò delle proteine con un punto isolettrico acido che migrano verso il catodo e delle proteine con un punto isolettrico basico che migreranno verso l’anodo. La migrazione quindi avviene e quando la proteina è giunta nel pH che corrisponde al suo punto isolettrico (quando la sua carica netta è 0) si ferma, infatti, la migrazione elettroforetica è direttamente proporzionale alla carica della molecola migrante.

Si parte da un voltaggio di 50 Volt affinché venga adsorbito il campione sulla strip e poi si aumenta il voltaggio fino a 8000 Volt, a temperatura di 18 °C per un tempo di 24 ore circa. Le strip sono poi colorate con il colorante blu o altri coloranti diversi. Per determinare il punto isolettrico di una proteina si usa una miscela di proteine a punto isolettrico noto, che migra con la nostra proteina. Insomma, utilizzo delle proteine marker di cui conosco il peso molecolare, e in base alla migrazione potrò costruirmi delle curve di calibrazione.

Abbiamo delle proteine con diversi valori di punto isoelettrico e diverse dimensioni e vengono separate in base a una variazione di pH. Proteine con masse diverse ma punto isolettrico simile, sono separate nella stessa zona della strip. Posso separare allora proteine native in base al loro punto isolettrico e si tratta di un tipo di elettroforesi a più alta risoluzione rispetto all’SDSPage. Se unisco l’approccio di elettroforesi per SDSPage alla IEF, ottengo la IEF. Per fare la IEF le proteine devono essere denaturate, infatti, con la SDS page, il sodiododecilsolfato si unisce alle proteine ogni due amminoacidi e le carica negativamente.

Le strip che scelgo hanno diversi range di pH che scelgo e hanno lunghezza differente (7-11-13-24 centimetri). Va ricordato che più il gradiente è largo, meno è la risoluzione. Per contro, meno il gradiente è largo, maggiore è la risoluzione.

Elettroforesi 2D

Elettroforesi 2D o bidimensionale (Isoelettrofocalizzazione + SDSPage) possiamo fare un’ouverture interessante di questa tipologie di elettroforesi: si parla di bidimensionale, quindi ci sono due dimensioni. Ebbene, la prima è la isoelettrofocalizzazione, la seconda è la SDSPage. Con la IEF separiamo le proteine native sul loro punto isoelettrico, in seguito – con la seconda dimensione – le separiamo in base al peso molecolare (dopo averle immerse e denaturate in SDS). Un gel bidimensionale appare come un gel ricco di spot (o macchie), in cui le proteine sono messe in evidenza nei diversi modi possibili (radioattivamente, mediante colorazione, fluorescenza, o Silver staining).

Questa tipologia di elettroforesi ci consente di poter valutare le modifiche post-traduzionali della proteina. Possiamo usarla per studiare:

• Isoenzimi
• Valutare pattern di espressione proteica nel tessuto che stiamo studiando
• Valutare la massa delle proteine
• Identificare interattori della proteina che sto studiando

La elettroforesi bidimensionale, assieme alla spettrometria, è alla base degli studi di proteomica.