Metodologie biochimiche - Appunti

Metodologie biomolecolari: clonazione

Il clonaggio di una molecola di DNA in un vettore seguirà tappe ben precise:

• Digestione: taglio del DNA da clonare e del vettore di clonaggio
• Ligazione: unione del DNA da clonare ed del vettore di clonaggio
• Trasformazione: inserimento del clone in una cellula ospite
• Piastramento: replica dei cloni in terreno nutritivo
• Selezione: riconoscimento attraverso varie metodiche dei ricombinanti

Enzimi di restrizione

La classe di enzimi di restrizione utilizzata maggiormente nella clonazione (vengono utilizzati per la digestione del DNA, primo passaggio della clonazione) saranno le nucleasi, le quali vanno ad idrolizzare i legami fosfodiesterici esistenti tra i nucleotidi. Queste si dividono in due sottoclassi: esonucleasi ed endonucleasi.

Esonucleasi

Taglieranno da un'estremità libera all'altra; a questa classe appartengono varie categorie che differiscono nel riuscire a tagliare uno o due filamenti.

Endonucleasi

Taglieranno sequenze interne, riconoscendole da siti specifici, detti di restrizione, ed anche queste si distingueranno tra taglio al singolo filamento o ad entrambi i filamenti del DNA. Avremo tre sottoclassi:

• Classe I richiedono adenosin metionina. Riconosce una sequenza e taglia in posizioni random al di fuori di questo sito di legame.
• Classe III che taglia in posizioni random al di fuori del sito di legame, ma richiederà due copie di sequenza target quindi non è molto vantaggiosa come classe.

Queste due classi sono diverse dalla seconda classe sia per la tipologia di taglio sia perché non sono palindromici: il tipo 1 ha un unico enzima multifunzionale che funge sia per la restrizione che per la modificazione; il tipo 3 sono due enzimi separati con una sequenza comune. Il 2 sottostante invece ha un complesso binario separato (endonucleasi di restrizione e metiltrasferasi di modificazione).

Classe II riconosce sequenze specifiche e palindromiche lunghe da 4 ad 8 bp e taglieranno proprio all'interno di questa sequenza, vanno a stabilire delle interazioni simmetriche con il DNA. In tutte e tre le classi necessita la presenza di ioni Mg²⁺ e per poter funzionare al meglio hanno bisogno di sali e tamponi. La classe II è di particolare importanza e interesse poiché riuscirà a tagliare il DNA in vari modi: bunt ends (estremità piatte) il taglio è simmetrico nella sequenza palindroma e si otterranno estremità senza filamenti singoli ma perfettamente tagliate (smaI); 3’ protruding se il taglio genera un filamento singolo in 3’ (kpnI); 5’ protruding crea un singolo filamento in 5’.

Le endonucleasi sono isolate dai procarioti, nei quali oltre ad avere una funzione di taglio, hanno anche una funzione di difesa: il fenomeno di restrizione e modificazione. Poiché i siti specifici per ogni specie si trovano a metraggi ben precisi, il DNA esogeno, magari immesso da virus o batteriofagi, non possedendo questa specifica distanza tra i siti di restrizione verrà degradato dalle stesse. Il DNA endogeno invece sarà protetto dalle metilazioni, così da evitare che vi sia digestione anche di quest’ultimo.

Può però accadere che vi siano delle sequenze affini a quelle del DNA batterico che ne permettono la metilazione e quindi la possibilità di trasmettere l’informazione genetica a quel ceppo batterico e di formare nuovi fagi. Se quest’ultimi che magari ormai hanno capacità di infezione nel ceppo A vanno a provare ad infettare il ceppo B ci sarà sempre una piccolissima percentuale (0.01%) che potrà essere metilato, così da riuscire a formare pochi fagi che saranno in grado di infettare anche il nuovo ceppo con una capacità del 99%.

La metilazione avviene presso le adenine, nella parte più interna della sequenza. Ciò è possibile perché E. Coli k12 ha delle metiltrasferasi che, riconoscendo le adenine interne, le metilano modificando così l’assetto. Durante la replicazione non tutti i siti sono metilati ma saranno emimetilati. Questo sistema di modificazione li riconosce e li metila immediatamente.

Successivamente dopo la modificazione entrano in gioco le endonucleasi di k 12 che, riconoscendo i siti di metilazione laddove non vi siano metilazioni, taglieranno il DNA. Per sequenze palindrome si vuole specificare che saranno sequenze che saranno leggibili in una direzione su un filamento e nell’altra sull’altro filamento.

Quindi sappiamo che un enzima di restrizione, riconoscendo i siti specifici laddove trova metilazione, non riuscirà a tagliare il DNA. Però può accadere che quello stesso enzima possa avere uno isoschizomero che consiste proprio in un enzima di restrizione isolato da un altro organismo, con esigenze differenti che però riconosce lo stesso sito attivo e riesce a tagliare in loco.

Ad esempio, MbaI riconosce la sequenza GATC e riesce a tagliarla ma non quando è metilata in GmATC, possedendo però l’isoschizomero SAM3A che riconosce GmATC e riesce a digerire il DNA.

Digestione con enzimi di restrizione

Avverrà utilizzando il giusto tampone per l’enzima di restrizione, l’aggiunta dell’enzima (che è espressa in unità/microlitri) e incubazione a 37 gradi per un tempo determinato. Il tempo di incubazione dipenderà dall’enzima di restrizione che stiamo utilizzando, in generale di solito si va da un'ora alle 4 ore per gli enzimi utilizzati in laboratorio. Dopo l’incubazione si aggiungerà fenolo o EDTA o si riscalda a 70°C per 15 minuti.

Le digestioni possono essere multiple, ma si possono verificare casi di:

• Compatibilità totale, in questo caso un enzima non lede all’azione dell’altro e vengono aggiunti contemporaneamente.
• Compatibilità parziale, si aggiunge un primo enzima che magari necessita di NaCl a basse concentrazioni, si fa agire, si aumenta la concentrazione di NaCl e si utilizzerà come secondo enzima un enzima che agisce a concentrazioni di NaCl elevate.

Tutti gli enzimi hanno attività a 37°C ma sono inattivabili a 65°C.

Elettroforesi su gel di agarosio

L’elettroforesi su gel di agarosio è specifica per il DNA, come l’SDS PAGE lo è per le proteine. Ma il gel di agarosio si può utilizzare anche per le proteine (immonoelettroforesi e isoelettrificazione). L’agarosio è un estratto delle alghe rosse di cui i maggiori produttori sono la Spagna, il Cile e il Giappone; a livello strutturale è un polisaccaride lineare di agarobiosio. Le sue caratteristiche gelificanti sono date dalle interazioni inter e intra molecolari.

Si prepara sciogliendolo in un tampone adatto, a 100°C. Una volta sciolto l’agarosio, andremo (sotto cappa) ad aggiungere il bromuro di etidio, molto tossico e volatile una volta aggiunto alla soluzione bollente. Si farà raffreddare un minimo e si porrà nel letto con i pettinini già posizionati, a quel punto aspetteremo la sua solidificazione. Una volta solidificato, leveremo il pettinino (che ci serve per creare i pozzetti che accoglieranno i campioni di DNA da analizzare) e prenderemo il gel che porremo in un bagnetto di corsa in TAE.

Come nell’elettroforesi su gel di poliacrilammide, porremo i pozzetti nel polo negativo (poiché i nostri campioni, essendo denaturati, hanno parziale carica negativa). Ad oggi in alternativa al bromuro di etidio abbiamo varie alternative, in genere i GEL RED TM ed i GEL GREEN TM, che sono stati inventati proprio per sostituire la componente dell’etil di bromuro che è altamente tossico. Abbiamo ad esempio il SYBR GOLD che è la prima alternativa al bromuro di etidio, non è tossico, è molto sensibile ed è usato sia per filamenti singoli che doppi; SYBR GREEN va comunque maneggiato con cura in quanto è potenzialmente mutagenico ma è molto più sensibile; SYBR sicuro invece non ha alcuna controindicazione, ha colorazione blu e non è né mutagenico né tossico. Infine, abbiamo l’EVA GREEN che è un colorante verde che inibisce però la PCR, poco fluorescente e non tossico.

In generale, la velocità di questo tipo di elettroforesi è influenzata dalla dimensione dei frammenti, dalla concentrazione dell’agarosio e la conformazione del DNA se è circolare, superavvolto o lineare. I fattori che influenzano poi sono in base al campione (forma, dimensione e carica), in base al campo elettrico (I=V/R che può anche dipendere dal tampone del campione), in base al tampone (mantiene il pH dei campioni ma stabilizzandolo va ad interagire con la velocità di migrazione perché mantiene lo stato di ionizzazione, non deve legarsi ai campioni es. fosfato, TRIS e acetato) e il supporto (che deve eliminare le correnti convettive e la diffusione, deve essere di materiale inerte e deve reagendo formare un setaccio molecolare che discrimini le varie molecole).

L’elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica sia preparativa che analitica, serve per identificare, purificare e separare i frammenti di DNA; può accogliere fino a 10 ng di DNA e può essere visualizzato esponendo il gel colorato con etidio bromuro a luce ultravioletta.

Per eliminare le impurità legate all’agarosio dai frammenti di DNA, esistono dei kit appositi. Si va a tagliare il gel laddove c’è la banda rilevata a luce ultravioletta e possiamo purificare il DNA in tre modi:

• Spin column
• Tubo di dialisi
• Paper strip metodo

La prima consiste nel prelevare la fetta, sempre usando le giuste precauzioni visto che il bromuro di etidio è tossico, e scaldarla a 50°C per 10 minuti e centrifugare per 1 minuto. Si lava la colonna facendo passare il 70% di etanolo, il sale e le impurità saranno lavati ed eluendo il tampone in un po’ d’acqua centrifugando nuovamente.

Il secondo invece consiste nel porre la fetta in congelatore per 30 minuti circa e poi porla in tubo da dialisi dopo averlo sterilizzato con acqua sterile, con il suo tampone (lo stesso utilizzato per la corsa). Viene messo nel tubo da dialisi (5 centimetri) con 200-400 microlitri di tampone esempio TBE e posto in un becher con tampone di corsa. Si pone il tubo in una cella da elettroforesi in modo che la banda di DNA...