Metodologie biochimiche - Appunti

PROPRIETà COMUNI A TUTTI :

capacità di esistenza autonoma nella cellula e di replicarsi autonomamente

1) avere un marcatore selezionabile (che da resistenza ad antibiotici) sono utili per

2) riuscire a capire se il nostro ospite è vuoto , contenente il vettore , contenente il

vettore con l’inserto .

contenere siti unici di restrizione

3)

I vettori più comuni sono proprio questi plasmidici , che sono delle molecole di dna

extracromosomico circolare in grado di replicarsi autonomamente contenente i geni che

sono responsabili di una caratteristica utile al batterio. Ne esistono sia a basso numero

che ad alto numero di copie. L’inserto può essere di massimo 10 kb.

Pbr322 : è un plasmide artificiale con caratteristiche vantaggiose = basso peso

molecolare(cosi da essere facilmente isolato e maneggiato ) , ORI , due geni per la

resistenza ad antibiotici , siti per vari siti di restrizione. Essendo la resistenza acquisita

grazie ad esso sia all’ampicillina che alla tetraciclina per selezionare i ricombinanti con

pBR322 , essendo due i siti attivi dei geni legati alla resistenza può accadere che o

l’ospite ha subito trasformazione completa e resisterà ad entrambi oppure che avrà

acquisito un vettore con inserto in BAMH1 (sito attivo sul gene della resistenza ad

ampicillina ) e quindi resiste ad ampicillina ma non a tetraciclina , oppure che al contrario

ha un vettore con inserto in Pst I( sul gene della resistenza per la tetraciclina) e pur

resistendo ad essa non resiste all’altra.

Puc : è un plasmide ad alto numero di copie da 500 a 700 , ha varie caratteristiche : il

sito di clonaggio interrompe il gene per la Beta – galattossidasi , ha ORI, si possono

identificare le cellule con i ricombinanti piastrandole su terreno con ampicillina x-gal e

induttore dell’enzima IPTG. In presenza di quest’ultimo la trascrizione è attivata e viene

prodotto la beta galattossidasi.

Questo gene sul cromosoma batterico prende il nome di LAC Z codica una porzione della

beta-galattossidasi la porzione alfa. Oltre a questo ci sarà il gene LACI che invece

codifica per il repressore del lattosio(la beta galattossidasi è una porzione di esso) in più

ci sarà anche LAC R che fa da controllo negativo in presenza sempre di lattosio.

Il plasmide agirà cosi.. formerà l’altro frammento della beta galattossidasi l’omega

attraverso l’alfa complementazione . il substrato x gal va a legarsi prima con alfa e solo

se complementato con omega rilascia xgal clivato verso il blu nelle colonie che saranno

divenute competenti

Quindi per selezionare le colonie che hanno subito alfa complementazione e che quindi

hanno integrato al loro interno il plasmide, basterà selezionare quelle clivate verso il blu.

pGem : è utilizzato per clonaggio , trascrizione in vitro e sintesi del ssDNA . E molto

usato per la sintesi di RNA in vitro , si useranno batteriofagi SP3 , T3 E T7 hanno una rna

polimerasi dna dipendente e sono in grado di sintetizzare fino ad 1 microgrammo di RNA

al minuto in quantità superiore rispetto a coli.

E.COLI è in generale un ottimo ospite per varie caratteristiche ottimali : cromosoma di 5

milioni di bp, può accetare dna estraneo proveniente da qualsiasi organismo, è

comunemente presente nella nostra flora batterica del colon , cresce a 37° in terreno on

LB , si replica ogni 22 minuti, ed ogni batterio è capace di accogliere circa 100 copie di

plasmide.

Trasformazione : è una modificazione del patrimonio genetico della cellula batterica(o

più in generale ospite) con l’introduzione di dna estraneo. I metodi per rendere le cellule

competenti sono due : 1) trattamento con CA2CL e/o RbCl le cellule vengono raccolte

sul fondo con centrifugazione e risospensione in Ca2Cl e messe subito in ghiaccio, ne

vengono divise varie aliquote che sono riposto ad -80° e ad una verrà aggiunto il nostro

plasmide si rimette in ghiaccio si mette in un bagnetto a 42 ° cosi da creare uno shock

termico che permetta l’ingresso dei plasmidi nell’ospite , successivamente si piastra in

terreno con LB e ampicillina. Questa tecnica ha una confluenza di 10 alla 6 10 all’ottava.

2) Elettroporazione si centrifuga si risospende in acqua sterile e si mette in ghiaccio si

ricentrifuga e si risospende nuovamente in acqua sterile e si rimette subito in ghiaccio a

questo punto si prende un eppendorf e si aggiunge il plasmide e si sottopone ad

elettroschok cosi da creare varchi nella membrana , successivamente si mette un baffer

salino e si piastra . Questa tecnica ha una confluenza di 10 alla 6 10 alla 10 .

Estrazione di DNA plasmidico.

si prende una sospensione di cellule trasformate che vengono risospese in soda

- naoh e sds , procurando la lisi alcalina che denatura sia le proteine che gli acidi

nucleici

neutralizzazione con HSS (potassio acetato /acido acetico) che rinatura il DNA

- plasmidico ma non quello cromosomico che è troppo grande e resterà insolubile

precipitando . Anche l’Rna verrà rinaturato e potrà eventualmente contaminare il

Dna ,ma con aggiunta di RNA nucleasi è eliminato.

Allontaniamo proteine e membrane in fase acquosa con un estrazione di

fenolo/cloroformio

etanolo 100 % e lavaggio con etanolo al 70 %

- risospensione in TE , il DNA plasmidico in presenza di etanolo e Sali subità SALTING

- OUT oppure in alternativa si possono usare colonne di silice su cui viene caricato

l’estratto cellulare neutralizzato . Il DNa in presenza di concentrazioni elevate di Sali

si lega al silice e viene separato dai contaminanti

-LIGAZIONE – è la fase necessaria per legare due estremità di Dna a doppia elica

con 3primo OH esposto e 5 primo fosfato .

Ciò è reso possibile con l’ausilio della DNa LIgasi che è un enzima che normalmente

va ad unire i frammenti di okazaki formati sul filamento no senso durante una

replicazione .

In questo caso condensano le estremità con ausilio dell’ATP a formare un legame

fosfodiesterico. Si useranno T4 DNA ligasi che riescono ad unire le due estremità

anche se 3 primo OH o 5 primo fosfato non è in posizione giusta , e un sigolo

polipeptide di MW di 68000dalton, agisce in un range di ph tra 7-5 e 8 al di sotto o

al di sopra di questo valore è inibito, ha bisogno poi di ioni mg 2+ di agenti sulfidrici

(DTT) . In più è inibito da una quantita di NaCl eccessiva. Per essere efficiente deve

essere incubato a 16 ° .

In generale sono state selezionate due classi di DNA ligasi, una che usa il nad*

come cofattore estratto da battari , e una che invece ha l’atp come cofattore

estratto da virus e batteriofagi.

Ma la ligazione può avvenire anche su estremità piatte.

In più si possono usare gli enzimi di restrizione con diversa specificità per

controllare l’orientamento di inserzione e ridurre la probabilità di richiusura del

vettore.  FOSFATASI ALCALINA(estratta dai gamberi) = è un enzima idrolitico in cui

zn ha azione catalitica che si occupa proprio di evitare la richiusura del vettore e lo

fara con la defosforilazione, cioè excidendo il gruppo fosfato al 5 primo per idrolisi ,

solo una volta aggiunto l’inserto non trattato si rigenereranno le estremita che sono

substrato per la ligasi . Prima però bisogna disattivare la fosfatasi e si fa incubando

a 65° c per 10 minuti. Ne esistono di vario genere batteriche BAP che è la più attiva

e stabile ma difficile da inattivare quella estratta da coli è un omodimero di 94 kDa

con due centri zn2+ e uno mg2+ ; intestinale CIP efficacemente inattivabile con

trattamento termico e quella estratta dal gambero SAP efficacemente inattivabile.

Per poter rendere le estremità coesive BLUNT possiamo usare

Frammento di klenow : è stato ottenuto con la proteolisi limitata o subclonaggio

di una DNA ligasi 1 che avrà 3 subunità (una con attività esonucleasica in direzione

3primo 5primo ; una con attività esonuscleasica in direzione opposta ed una

subunità con attività polimerasica) di cui saranno mantenute solo qualla

esonucleasica in direzione 3 primo  5 primo e quella polimerasica. Partendo da un

estremità 5primo protuding non ho alcun problema perché c’è gia 3primo oh libero

come filamento stampo con la tecnica di fill in va ad aggiungere i nucleotidi

mancanti e forma l’estremità piatta. Ma se ci troviamo in posizione opposta

partendo quindi da estremità 5primo protuding questa viene resa blunt tagliando il

tratto a singolo filamento con attività esonucleasica in 3primo  5 primo con tecnica

chop off.

T4 DNA POLIMERASI: questa invece ha attività polimerasica in 5primo 3primo

esonucleasica in direzione opposta e non in 5 3- .

Simili a KLENOW ci sono le T4 e T7 DNA polimerasi , la t4 ha maggiore attività

esonucleasica 3 primo.. la t7 è usata molto per il processamento.

Vettori derivanti da batteriofago M13

Infezione tramite formazione di pilo per questo infettano solo cellule F+ con il

fattore di fertilità o Hfr (cioè quelle che oltre ad aver integrato il fattore f anche i

geni vicini nel proprio genoma) DIFFERANZA NELL’INFEZIONE ECC ECC.

Si usa perché ha un genoma piccolo , non uccide la cellula ospite la forma

replicativa a doppio filamento si comporta come un plasmide ed è usato come tale

e si prepara facilmente da coli infettato per trasfezione. E soprattutto perché i geni

clonati possono essere tenuti come DNA a singolo filamento.

Nel capside virale c’è la PIII essenziale per il riconoscimento del pilo batterico. Tra i

geni fondamentali per la formazione di nuovi fagi c’è una sequenza di 507

nucleotidi dove possono essere inseriti i geni di interesse. Ad esempio potremmo

inserire lac z cosi da ottenere placche blu su terreno con xgal.

E magasi su lacz inserire siti di restrizione con estremità ecoriI con una ligasi e

aggiungere il polilinker che potrà essere o inserito o sostituito da nuovo dna o non

inserito.

I polilinker poi non sempre sono diversi ad esempio per M13MP8 E M13MP9 il

polylinker sarà uguale ma con orientamento differente.

I vettori m13 ci daranno cloni ricombianti ognuno con una copia dei due filamenti

che compongono l’inserto .

Fagemidi = sono ibridi tra vettori plasmidici e M13 , hanno l’origine di

replicazione , ma in essi non sono mantenute le informazioni per la costruzione

delle parti fagiche per questo avremo un dna ricombinante detto M13 helper che

tramette queste sequenze.

Il fagemide è inserito per trasformazione e le sequenze helper sono ingegnerizzate

per fare in modo di essere meno efficietri di quelle presenti nel fagemide cosi da far

entrare nei nuovi fa