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Metodologie biochimiche I

Appunti di Metodologie biochimiche I basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof.ssa Porcelli dell’università degli Studi di Bologna - Unibo, Facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea magistrale in biologia molecolare e cellulare. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Metodologie biochimiche docente Prof. A. Porcelli

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ESTRATTO DOCUMENTO

L’SDS denatura e carica negativamente le proteine e le separa sulla MASSA TAGLIA. Per linearizzare le proteine

devo adoperare l’AGENTE RIDUCENTE. In taluni casi, quando ho linearizzato le proteine MULTISUBUNITA’ (con

PONTI DISOLFURO), posso adoperare il βMercaptoetanolo o DTT, che sono in aggiuntivo all’SDS, per sfavorire ogni

interazione idrofobica.

Poi mi occorre anche un COLORANTE (CLU DI BROMOFENOLO), per monitorare l’andamento elettroforetico.

Questo colorante ha delle caratteristiche tali per cui esce prima delle proteine.

Questo per fare in modo di capire che le proteine si stanno avvicinando al POLO DI ARRIVO e, non appena arriva

fuori, devo arrestare la metodica, per evitare che il campione non venga perso.

Inoltre, nel pozzetto di partenza in cui metto il COLORANTE devo fare in modo di avere delle condizioni

OMOGENEE, che rendano la corsa omogenea per i diversi pozzetti.

Il TAMPONE DI CORSA va messo sul POLO POSITIVO (ANODO) e il campo elettrico deve essere UNIFORME,

grazie agli ioni di cui è pieno. Potrei adoperare del TRIS salificato con NaCl e c’è della GLICINA (come TAMPONE).

Il pH è sul 9,45. Il gel, ha però un caratteristica nell’SDS PAGE: è DISCONTINUO: c’è un 20% del gel sopra (detto di

COMPRESSIONE) e quello sotto è detto di SEPARAZIONE. Parleremo, allora, di STACKING GEL (per il gel sopra)

e SEPARATING GEL (per quello sottostante).

Il primo sopra serve per comprimere il campione nel più piccolo volume possibile. La separazione elettroforetica è più

risolutiva e i campioni elettroforetici sono separati in bande molto strette.

Essendo le proteine molto diluite, devo riempire il pozzetto quasi tutto, perché devo averne il più possibile. Inoltre,

avendo il gel di compattazione, le proteine, quando migrano, tendono a spostarsi con mobilità elettroforetica diversa, in

virtù della TAGLIA.

Quelle più grosse nella corda saranno più in alto rispetto a quelle di taglia più piccola (con meno attrito e più piccole). Il

GEL DI COMPATTAZIONE serve per fare in modo che la forma del pozzetto sia simile a quello della BANDA ad

elettroforesi finita e non disperde per un volume più grande del pozzetto. Questo si traduce in una RISOLUZIONE

MINORE di altri gel elettroforetici. A differenza di quanto il nome del primo gel possa far credere, la percentuale di

ACRILAMIDE è più bassa rispetto a quello di SEPARAZIONE e c’è un 5-15% di ACRILAMIDE e aggiungo 3-4 % di

BIS (dico anche 4, perché con 3 potrei rischiare di non avere polimerizzazione). Infine, aggiungo l’SDS. Anche il pH

del gel è diverso: 6,8 quello di STACKING e 9 quello sotto ed è un effetto fondamentale del gel STACKING. Infatti, la

GLICINA a pH 6,8 (che ricordiamo essere un TAMPONE DI CORSA) è POCO IONIZZATA, perché il suo punto

isoelettrico è 6. Allora, in questo gel ho: IONE GLICINATO (poco mobile, perché ha una densità di carica molto

bassa), IONI CLORURO (con elevata densità di carica, quindi molto mobili) e ho delle proteine con velocità

intermedia. Si viene a verificare un EFFETTO COMPRESSIONE sul CAMPIONE, poiché nel fronte superiore lo

IONEGLICINATO e nel FRONTE ANTERIORE gli IONI CLORURO, che comprimono le proteine nel mezzo (con

una velocità intermedia). Non appena viene passata la LINEA DI DEMRCAZIONE del primo gel, lo IONE

GLICINATO si carica (siamo a pH 9) e assume una mobilità elettroforetica alta, tant’è che va nel fronte anteriore con lo

IONE CLORURO e l’effetto compressione viene a perdersi e le proteine non sono più costrette a stare in un piccolo

volume. Inoltre, la percentuale di ACRILAMIDE aumenta e le proteine possono essere discriminate in base alla taglia.

Se devo separare delle proteine con PM tra 150-200 kD, devo usare 5-12% di acrilamide. Non è consigliato adoperarne

più del 15%, perché il gel potrebbe divenire impermeabile.

I GEL a GRADIENTE sono opposti a quello visto e hanno più ACRILAMIDE in alto e meno in basso.

Le proteine, essendo incolori, le devo colorare nel GEL e posso usare il COMASSIE BRILLANT BLUE (595-465) per

metterle in evidenza allo SPETTROFOTOMETRO, oppure uso il NITRATO d’ARGENTO nella metodica del Silver

Staining. Il gel è giallino e le bande marroni.

La prima è una colorazione ASPECIFICA, la seconda è una colorazione specifica.

Prima di colorare le proteine vanno precipitate nel gel (vanno fissate) con 10% di ETANOLO e/o METANOLO –

SOLVENTI ORGANICI) e soltanto dopo le posso colorare (senza perdere le proteine, se no perderei di sensibilità).

Con l’SDS PAGE ho determinato la taglia delle proteine e devo costruire la CURVA di TARATURA e nelle

ORDINATE metto il log del PM e in ASCUISSA metto la MOBILITA’ RELATIVA, che calcolo nel seguente modo:

Talvolta posso evitare la COLORAZIONE e adopero la LASTRA AUTORADIOGRAFICA. Metto il gel a contatto con

la LASTRA e rimane impressa la RADIOATTIVITA’. Per avere un buon segnale ed evitare il PUNCHING EFFECT

(dovuto all’acqua del gel che tende ad assorbire la radioattività), devo un po’ disidratarlo.

WESTERN BLOTTING

Adopero questa metodologia per identificare le proteine. Si tratta di un termine che deriva da TO BLOT 

TRASFERIRE. SI fa in seguito alla separazione elettroforetica di una molecola, che, quindi, viene trasferita su una

membrana. La prima volta la fecero con del DNA DS, ma per questione di TECNICA fu estesa per NORTHEN BLOT,

oppure EASTERN BLOT, oppure FARWESTERN BLOT (identifico una proteina su un’altra proteina). Il NORT

WESTERN BLOT lo uso per identificare una proteina su una membrana adoperando l’RNA. Uso il sistema delle 13

membrane perché sono più maneggevoli e meno fragili di un gel. Ma abbiamo anche la tecnica del SOUITHERN

BLOT e utilizziamo la capillarità per trasferire DNA sulla membrana.

Per trasferire l’RNA sulla membrana, invece, adoperiamo l’ELETTROTRASFERIMENTO e, se applicato all’RNA, è il

NORTHEN WESTERN.

Mettiamo il gel sulla membrana e questa sull’apparato. Facciamo il vuoto e le proteine vanno sulla membrana. La

membrana è vicino all’ANODO (+) e il gel vicino al CATODO (-) con una differenza di potenziale. La membrana è

vicino all’anodo, perché le proteine sono cariche negativamente. La membrana deve essere coperta da cartoncino per

proteggerla (effetto SANDWITCH) e deve essere una membrana di NITROCELLULOSA o POLIVINILDF, con

elevata affinità per le proteine. Il legame è idrofobico e non le fisso covalentemente.

Una volta che ho le proteine sulla membrana, devo colorarle con il ROSSO DI PONCEAUX. E’ un colorante poco

sensibile. Devo vedere se ho avuto un EFFETTIVO ed EFFICACE TRASFERIMENTO. Posso mettere in evidenza le

proteine anche con un’INCUBAZIONE tra le mie proteine e la membrana, e poi adopero degli anticorpi. Uso del

LATTE SCREMATO più la membrana ed INCUBO, poi uso degli anticorpi. Questo lo faccio per evitare che

l’anticorpo di leghi esso alla membrana (essendo una proteina), per evitare che si formi un LEGAME ASPECIFICO.

Dunque, corpo tutta la membrana con delle proteine del latte ovviamente (perché uso il latte). Ovviamente, prima di

metterci il latte, ho trasferito le mie proteine.

L’anticorpo primario si attacca alle mie proteine e posso metterle in evidenza (altrimenti non vedrei nulla), adoperando

un ANTICORPO SECONDARIO (da animale). L’animale, in questo caso, deve essere diverso da quello da cui ho

ricavato l’anticorpo primario. Marco quello secondario con molecola radioattiva e faccio l’autoradiografia, oppure lo

marco con enzima o con FLUOROCROMO. L’enzima fa una REAZIONE CROMOGENA agendo con il suo ubstrato e

vedo dove l’anticorpo si è legato. Posso usare l’enzima FOSFATASI o PEROSSIDASI DI RAFANO e incubo la

reazione con LUMINOLO e ACQUA OSSIGENATA. La perossidasi libera ossigeno dall’acqua, che ossida il

LUMINOLO, che libera LUCE e in CAMERA OSCURA vedo dove l’anticorpo secondario si è legato questa è

CHEMIOLUMINESCENZA e le prove sono su AUTORADIOGRAFIA, che viene impressionata dalla luce e lascia

un’immagine del gel iniziale. Se colorassi le proteine nel gel precipitandole (per fissazione con solventi organici), non

potrei averle più disponibili per colorarle su membrana.

ISOELETTROFOCALIZZAZIONE

Si tratta di una tecnica elettroforetica. Il punto discriminante è il PUNTO ISOELETTRICO, il punto in cui le proteine

sono elettricamente neutre. Le separazioni non dovranno avvenire sulla base della taglia e della forma. Per togliermi

questo problema uso dei DENATURANTI e AGENTI CAOTROPI, non SDS perché caricherebbe negativamente le

proteine, ma nemmeno solventi organici, perché farebbero precipitare la mia proteina (e io voglio avercela in

soluzione). Potrei dover aggiungere DETERGENTI NON IONICI per portare le proteine delle membrane in soluzione

(TRITON X 100 e NP40). Si dice NON IONICO perché la TESTA POLARE del detergente non è carica.

Per questa elettroforesi devo usare GEL SOLIDO o una MATRICE SOLIDA il più lasso possibile, perché non abbia

discrimine sulla taglia proteica e possiede sai gel d’agarosio che di POLIACRILAMIDE (3-4%) per avere pori grandi.

Ha solo lo scopo di STABILIZZARE la separazione. Devo, però, adoperare un gel con GRADIENTE di pH (non

costante). Il gel è fatto a STRISCIOLINE. Fra poco capiremo il perché.

Ho un elettrodo positivo da una parte e un elettrodo negativo dall’altra parte. Dove ho il POLO positivo ci metto il pH

acido e dove ho il polo negativo ci metto il pH BASICO. Si vendono in commercio e posso scegliere il RANGE di pH

che voglio, pH che cambia nella strisciolina. Se la mia proteina ha un certo pH basico o acido, devo scegliere un range

di pH che comprende il PUNTO ISOLETTRICO della mia proteina. Gli istoni sono basici e hanno un punto isolettrico

basico. Non ha importanza il punto di caricamento della proteina, perché andrà sempre nel suo punto isoelettrico.

La proteina se la metto in un pH MINORE del suo PUNTO ISOELETTRICO, assume una carica positiva e poi si sposta

verso il CATODO e trova sempre più pH alti (POLO negativo e pH basico), perderà le cariche positive e diventerà

sempre più negativa, finché non raggiungerà il pH del suo Punto isolettrico e si fermerà. Ovviamente, VICEVERSA!!!

Per mantenere il pH si adoperano le IMMOBILINE e sono nel gel delle molecole di ACRILAMIDE che sull’azoto

hanno un gruppo R sostituente ACIDO o BASICO che stabilizza diversi pH.

Ma le IMMOBILINE non bastano poiché devono essere distribuite in base alle loro caratteristiche elettriche nelle

diverse parti specifiche del gel (immobiline basiche nella parte basica del gel, immobiline acide nella parte acida del

gel) e lo si fa adoperando un FORMATORE DI GRADIENTE. Essendo le IMMOBILINE costose, il gel è a striscie

sottili.

La ISOELETTROFOCALIZZAZIONE (IEF) si può usare sia a SCOPO ANALITICO, che a SCOPO PREPARATIVO

(isolando le proteine)

ELETTROFORESI BIDIMENASIONALE (ISOELETTROFOCALIZZAZIONE + SDSPAGE)

Mi permette di separare le proteine nella elettroforesi bidimensionale. Questo lo faccio dopo aver visto il punto

isolettrico della proteina e incubo la striscia con SDS. Le proteine dopo il punto isolettrico dovranno essere coperte di

SDS e caricate negativamente e poi metto tutto su un gel di SDSPAGE dove mancano i pozzetti, dal momento hce le

proteine sono già presenti nel gel (che ho usato per IEF). Essendo già le proteine concentrate in questo piccolo volume

non devo ricorrere allo STACKING GEL e il GEL sarà CONTINUO.

E’ un gel BIDIMENSIONALE, perché separo le proteine in base al PESO MOLECOLARE (in direzione

perpendicolare alla IEF) e, in BASE AL PUNTO ISOELETTRICO 8direzione perpendicolare al PESO 14

MOLECOLARE). Le proteine qui migrano come SPOT o PUNTINI e non più come BANDE. C’è una RISOLUZIONE

NOTEVOLE, perché le proteine non si sovrappongono, ma il tempo di esecuzione è più lungo della IEF.

In ogni SPOT ho delle proteine con delle caratteristiche differenti. Nella ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE

ho più proteine con lo stesso punto isolettrico o con lo stesso PM e la risoluzione è minore.

Se studio un TIPO CELLULARE o un TESSUTO, potrebbe tornarmi utile la elettroforesi bidimensionale per fare degli

studi di PROTEOMIC. Per mettere in evidenza le proteine posso usare il BLU DI COMASSIE o il SILVER

STAINING (che ha un limite di sensibilità maggiore rispetto al BLU di COMASSIE)

Se in uno SPOT ho meno di 100 μg di proteine, il BLU DI COMASSIE non riesce a metterle in evidenza e devo

adoperare il SILVER STAINING (10 volte più sensibile). Posso marcare, in alternativa, con FLUOROCROMI oppure

faccio una MARCATURA RADIOATTIVA e la sensibilità è maggior sia del blu di Comassie che del Silver Staining.

La marcatura radioattiva marca anche proteine ad un PICOGRAMMO nello SPOT.

In base alla porzione dello SPOT, posso analizzare le BANCHEDATI e vedere che proteina è, se è qualcosa di nuovo

scelgo nel gelo lo SPOT e poi identifico lo SPOT con la SPETTROMETRIA di massa. Potrei fare degli studi di

confronto tra quello che accade nel proteoma del soggetto sano e quello che accade nel caso del soggetto malato.

Questo posso farlo con il GEL BIDIMENSIONALE. Ma posso anche usare il GEL BIDIMENSIONALE per

confrontare soggetti sani con soggetti in cui sto facendo un trattamento farmacologico e la dimensione dello SPOT potrà

aumentare o diminuire (poiché posso avere una maggior produzione o minor produzione di una determinata proteina).

Posso quindi andare a SEQUENZIARE la proteina dopo averla SOLUBILIZZATA e lo faccio mediante il

SEQEUNZIAMENTO DI HADMAN (FRAMMENTAZIONE DI HADMAN) e frammento la proteina e rilevo gli

amminoacidi in sequenza. Si tratta di una metodica abbastanza indaginosa e non efficace per il SEQUENZIAMENTO

di peptidi molto lunghi e allora uso la SPETTROMETRIA DI MASSA. La vediamo dopo.

Posso usare la elettroforesi BIDIMENSIONALE per apprezzare le MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI

proteiche, come ACETILAZIONE, METILAZIONE, FOSFORILAZIONE, GLICOSILAZIONE, SUMOILAZIONE,

UBIQUITINAZIONE e, spesso, alcune modificazioni dipendono da vie del segnale EXTRACELLULARE, che

attivano delle CHINASI 8Per esempio) che fosforilano le proteine cambiando la funzione.

SPETTROMETRIA DI MASSA

La spettrometria di massa e’ una tecnica analitica di delucidazione strutturale basata sulla ionizzazione di una molecola

e sulla sua successiva frammentazione in ioni di diverso rapporto massa / carica (M/z).

A differenza delle tecniche spettroscopiche, però, questo è un metodo d’analisi distruttivo (la molecola non

rimane intatta dopo l’analisi), e soprattutto non si basa sull’interazione tra radiazioni e materia.

Il principio su cui si basa è il seguente: una molecola è ionizzata per espulsione di un elettrone; il catione radicalico che

si forma (ione molecolare) in parte si frammenta dando molecole e/o radicali neutri (che lo strumento non rileva), in

parte generando cationi e/o radicali cationi (ioni frammento). Lo ione molecolare e i vari ioni che si originano per

frammentazione (cationi e radicali cationi) vengono discriminati sulla base del loro rapporto massa/carica e rivelati

da un detector.

L’esperimento di spettrometria di massa consiste dunque nella ionizzazione di molecole in fase gassosa, nella

separazione dei diversi ioni prodotti e nella loro rivelazione.

I peptidi che ottengo dalla digestione della proteina (magari con TRIPSINA che taglia dopo la LISINA), la sottopongo a

migrazione in un campo elettrico nel vuoto (poiché non uso il GEL) e si parla di TEMPO DI VOLO o TIME of

FLIGHT – per indicare il tempo che il peptide impiega per arrivare all’elettrodo di segno opposto alla carica del

peptide). METODOLOGIE BIOCHIMICHE

La biochimica si occupa di studiare le reazioni chimiche che avvengono nella cellula.

In queste ultime decine di anni è una disciplina strettamente connessa alla INFORMATICA, alla BIOLOGIA

MOLECOLARE, ma anche alla GENETICA e alla MEDICINA.

COLTURE CELLULARI

Si comincia con queste per poter fare degli studi di BIOLOGIA, anche per fare ANALISI QUANTITATIVE E

QUALITATIVE su una specifica molecola. Possiamo adoperare:

ORGANISMI PLURUICELLULARI ANIMALI DA ESPERIMENTO

 

CELLULE DERIVATE DA ORGANI O TESSUTI COLTURA CELLULARE ANIMALE o VEGETALE.

 

Si possono usare anche i BATTERI, per fare CLONAGGI, SUBCLONAGGI o per fargli produrre una

proteina.

Noi vedremo le tecniche biochimiche per studiare ZUCCHERI, PROTEINE, LIPIDI e ACIDI NUCLEICI, anche se ci

occuperemo di più delle proteine perché sono alla base delle funzioni cellulari.

Perché si usano le colture cellulari?

Innanzitutto per valutare la BIOLOGIA DI BASE; fare studi di TOSSICOLOGIA (effetti di un farmaco, insetticida…),

ma anche per eventuali RICERCHE.

Lo svantaggio nell’adoperare animali è che il costo è elevato rispetto alle colture. 15

Posso adoperare le cellule per aumentare il numero di VIRUS disponibili, aumentare il numero di proteine, ottenere

ANTICORPI, ORMONI, ma sono importanti anche per fare esprimenti di INGEGNERIA GENETICA.

Che vantaggi ci sono rispetto agli animali dam esperimento?

1) Innanzitutto il fatto che abbiamo a che fare con COLTURE OMOGENEE. Se vogliamo testare un farmaco su una

coltura di fibroblasti, questa al 99% sarà costituita solo da fibroblasti.

2) Inoltre si evita di cercare su stabulari cosa dare da mangiare al topolino. 3) Ancora, possiamo vedere la

MORFOLOGIA quotidianamente e vediamo l’effetto.

Quali svantaggi?

Un topolino IMMUNODEPRESSO costa molto e devo usare 50-100 animali per pubblicare un articolo attendibile. Nel

caso delle cellule devo usare del MATERIALE STERILE (ed è il costo delle colture). Inoltre, il materiale che ottengo

da epatociti murini in coltura, per esempio, è poco (RESA SCARSA). Al contrario, invece, la resa non sarebbe scarsa se

usassi il FEGATO di RATTO direttamente.

Ancora, potrei avere delle modificazioni genotipiche e fenotipiche che modificherebbero la morfologie delle cellule.

Ogni giorno si deve andare in incubatore e osservare. In ogni caso, prima di passare allo studio in vivo, lo si fa in vitro.

Le colture spesso si scambiano da un laboratorio a quell’altro, visto l’elevato costo. Più raramente si acquistano.

Possiamo distinguere:

• COLTURE CELLULARI ADESE: cellule che crescono adese al substrato (piano del contenitore di plastica

sterile)

• COLTURE CELLULARIN IN SOSPENSIONE: crescono nel contenitore di plastica senza aderire al substrato.

La differenza tra le due dipende dal tessuto che usiamo: SANGUE/LINFA o TESSUTI SOLIDI.

Le cellule che abbiamo dal 1940 del CARCINOMA dell’ENDOMETRIO, sicuramente hanno perduto la loro

morfologia iniziale e sono di forma POLIGONALE e non FIBRIFORMI. Se sto lavorando con una coltura sana e vedo

che il giorno dopo la morfologia è cambiata, potrebbe voler dire che c’è stata contaminazione da pipette, microrganismi,

oppure sta male la coltura.

Possiamo avere a che fare con LINEE JURKAT, nonché LINFOCITI T che derivano da LINFOMA (crescono in

sospensione, senza forma definita). ORIGINE DELLE COLTURE CELLULARI

MESENCHIMALE: tessuto muscolare o polmone

 EPITELIALE: polmone, trachea, vene, arterie

 NEUROECTODERMA: melanociti, cellule neuronali, gliali (non microglia)

 EMOPOIETICA: microglia, cellule del sangue

Le colture cellulari si possono comprare alla ATCC (American Tissue Colture Collection). Ci sono dei cataloghi con la

carta d’identità di quello che cerchiamo, prezzo compreso (grado di pericolosità biologica, suscettibilità a diversi virus,

chi ha preso il brevetto, modalità di crescita, morfologia…).

Possono derivarci anche da BIOPSIA, per avere delle cellule tumorali (e mi metterò d’accordo con l’ANATOMO

PATOLOGO, che avviserà il chirurgo), oppure una BIOPSIA SANA, per studiare i fibroblasti sani.

Da un TESSUTO NORMALE ottengo delle COLTUREV CELLULARI PRIMARIE, che posso portare avanti per un

numero limitato di giorni: dopo 20-30 passaggi di coltura muoiono.

Dalle cellule TUMORALI ottengo, essendo già immortalizzate, una LINEA (come nel caso delle cellule HeLa).

Una volta che mi arriva il pezzo di biopsia (ammesso che abbiamo tessuto solido), dobbiamo mettere il pezzo in una

FALCON con TERRENO DI CRESCITA. Poi possiamo agire in due modi:

DIGERISCO il pezzo Over Night a 37 °C, usando COLLAGENASI e il tessuto viene disgregato (la collage

 nasi taglia il collagene della matrice extracellulare) e abbiamo una SOSPENSIONE CELLULARE, con cellule

staccate tra loro. Le centrifugo per eliminare la collage nasi e le piastro e attecchiscono nel giro di 2-3

settimane- un mese. Cominciano a replicare dopo altre 2-3 settimane.

Spezzetto il pezzo di BIOPSIA con bisturi e metto i pezzettini in piastre diverse, aggiungendo ANTIBIOTICI,

 ANTIFUNGINI e terreno di crescita. I pezzetti si attaccano alla piastra e dopo un mese-un mese e mezzo le

cellule cominciano a crescere.

Le COLTURE PRIMARIE di cellule derivate da cellule non tumorali dopo 12-15 passaggi vanno incontro a

SENESCENZA e le cellule poi non crescono più.

Queste cellule sane (come LINFOCITI, EPATOCITI, CHERATINOCITI e anche HELEC –Human Umbelical Vein

Endothelial Cells) hanno INIBIZIONE DA DENSITA’ e possono diventare immortalizzate solo se le trasformassi.

METODI DI TRASFORMAZIONE CELLULARE IN LABORATORIO

Posso farlo mediante diversi approcci:

VIRUS, aggiunti nella coltura cellulare, come SV40

 ONCOGENI TRASFETTATI o TRASFORMATI. Posso usare gli ONOCOGENI RAS o RAF, proteine

 importanti nella via di segnalazione delle MAP CHINASI e parte da RECETTORI che ricevono dei fattori di

crescita e con un meccanismo di trasduzione del segnale che si esplica sul nucleo per via di

FOSFORILAZIONE e DEFOSFORILAZIONE e si ha regolazione del CICLO.

Sembra che tra i due approcci sia meglio adoperare il VIRUS. Come funziona? 16

Si tratta di VIRUS delle SCIMMIE e dei TOPI. Dobbiamo, innanzitutto, distinguere tra CELLULE PERMISSIVE e

NON PERMISSIVE. Nel caso delle prime, il VIRUS va in CICLO LITICO e la cellula scoppia, nell’altro caso il

VIRUS va in CICLO LISOGENICO e integra il suo genoma nel genoma della cellula ospite e si ha trasformazione. Va

ricordato che possiamo anche non usare tutto il virus, ma solo il suo LARGE ANTIGEN T (e non lo SMALL

ANTIGEN T). se trasformo delle cellule non competenti con vettore di espressione codificante per il “Large T antigen”,

detta proteina interagisce con un ONCOSOPRESSORE e lo inattiva e si ha DISREGOLAZIONE del ciclo. Questo

antigene, allora, funge da ONCOGENE.

Per trasformare una coltura cellulare primaria sana in una coltura cellulare primaria tumorale (per indicare che deriva da

primaria sana – ma la si può chiamare comunque LINEA), ci vuole molto tempo (un anno e mezzo circa).

Tra le LINEE TUMORALI possiamo ricordarne alcune:

• MCF7 (linea immortalizzata di CARCINOMA MAMMARIO)

• PC3 (linea immortalizzata di CARCINOMA della PROSTATA)

• HeLa

Queste cellule non mostrano INIBIZIONE DA CONTATTO e si ha ALTERAZIONE dell’INTERAZIONE Cellula-

Cellula. Si attaccano meno al substrato e si attaccano meno tra loro e sono più libere di muoversi e dare METASTASI.

A volte, va ricordato che se prendiamo delle cellule tumorali e delle cellule sane contigue nel DONATORE e le

piastriamo, quelle che partono prima a volte possono essere proprio quelle sane, perché quelle tumorali espongono in

maniera alterata delle proteine di superficie cellulare.

INBIZIONE INDIPENDENTE DALLA DENSITA’

I FIBROBLASTI normali crescono formano un MONOSTRATO e poi si bloccano, perché hanno esaurito i fattori di

crescita nel terreno e quindi sono nella fase G0 del CICLO CELLULARE.

Al contrario, le cellule tumorali proliferano e formano il MONOSTRATO e continuano a proliferare e crescono ad uno

strato l’una sull’altro. Va ricordato che le cellule tumorali sono in grado di produrre dei fattori di crescita in maniera

AUTOCRINA e anche se li finiscono se li producono da sole.

Le cellule normali crescono in MONOSTRATO, perché sono sensibili all’INIBIZIONE DA CONTATTO, mentre le

cellule tumorali no e hanno delle alterazioni proteiche per quanto riguarda le proteine atte al CROSS-TALK

CELLULARE e possono invadere il torrente sanguigno e andare in altri organi.

MODELLO DEL CI-IBRIDO

E’ molto usato per studiare l’effetto di MUTAZIONI MITOCONDRIALI. Per farlo partiamo da una linea cellulare

IMMORTALIZZATA (detta 143 B Cell) che deriva da OSTEOSARCOMA UMANO. Le cellule sono ampiamente

adoperate. Queste cellule hanno un DNA MITOCONDRIALE WT. S’incubano le cellule con ETIDIO BROMURO (un

intercalante del DNA) e si sostituisce all’ADENINA e se metto le cellule in INCUBAZIONE con concentrazioni molto

basse di Etidio Bromuro (nanoMolare). Questo intercalante s’intercala nel DNA mitocondriale e i mitocondri non

riescono più a replicare e man mano che le cellule si duplicano non possono duplicare il DNA mitocondriale e

nemmeno le proteine possono essere codificate. Queste sono chiamate le Rho-0-Cell. Possiedono il CITOSOL e il

NUCLEO, ma non i MITOCONDRI.

Parallelamente, si prendono le cellule dalla coltura o dal paziente con determinata mutazione mitocondriale e le si

incubano con AGENTE che disgrega il CITOSCHELETRO (come la CITOCALASINA D) e mancano del supporto che

tiene il NUCLEO. Le si centrifugano ad alta velocità e le si ENUCLEANO e ottengo delle cellule dove ho i

MITOCONDRI con la MUTAZIONE, ma prive del nucleo. Otteniamo un CITOPLASTO

Cosa faccio ora?

Fondo le due tipologie di cellule, usando delle sostanze che favoriscano questo evento (FOSFOLIPIDI). Ci ritroviamo

con i MITOCONDRI della cellula detta CITOPLASTO fusa alle Rho-0-Cell, ottenendo il CI-IBRIDO. Ora mi ritrovo

con i MITOCONDRI con la MUTAZIONE da studiare e con il NUCLEO immortalizzato delle 143 B.

LA COLTURA CELLULARE

Abbiamo parlato delle colture tumorali primarie (intendendo LINEE TUMORALI che abbiamo ottenuto per

trasformazione di colture cellulari sane primarie), colture cellulari primarie e LINEE.

Le colture non devono essere contaminate da BATTERI ne FUNGHI e devono essere sterili. Devo usare il MEDIUM

con dei fattori di crescita, Sali minerali e pH 7 o 7.3 (pH fisiologico), rispettando anche la temperatura di 37 °C.

Queste colture che usiamo possono avere diverse origine. Possiamo comprarle oppure averle ottenute da tessuto

patologico o sano.

Bisogna controllare il pezzo quando lo otteniamo, controllare le INFEZIONI più comuni (AIDS, EPATITI) e le cellule

vanno protette dalla eventuale contaminazione esterna, ma anche noi dobbiamo proteggerci.

SICUREZZA IN LABORATORIO

Non c’è da contaminare le colture starnutendoci su, proteggendole dal mio ADENOVIRUS. Va usato il CAMICE e i

DPI vari. Non vanno messe le mani in bocca. Pulire sempre il banco di laboratorio, non staccare scotch o etichette con

denti. Per pulire bancone usare ETANOLO al 90%, accorti di aver tolto prima le piastre con le cellule, altrimenti le

proteine vengono precipitate. Non si beve, né si fuma e va fatta la RACCOLTA DIFFERENZIATA. I RIFIUTI

CHIMICI (anche i coloranti caduti per sbaglio) vanno nel BIDONE dei rifiuti chimici, come quelli biologici vanno nel

bidone dei rifiuti biologici. I rifiuti biologici è tutto ciò che è venuto a contatto con materiale biologico. 17

Ci deve essere un rapporto di MUTUA PROTEZIONE OPERATORE-COLTURA. L’operatore non deve infettarsi con

le cellule e non deve contaminare le colture. Non vanno respirate sostanze tossiche sotto cappa.

SICUREZZA DELLE COLTURE

La coltura è sacra. Se ci sto lavorando su da un mese e viene contaminata sono nella MERDA! Devo assolutamente

proteggerla da eventuali contaminazioni. Devo lavorare in un ambiente sterile. Posso usare la CANDEGGINA (anche

AMUCHINA) diluita con acqua. Posso usare FENOLO, ma anche ETANOLO (come ALCOOL più spesso usato)

contro BATTERI e VIRUS.

Posso anche usare le ALDEIDI come GLUTARALDEIDE e FORMALDEIDE. Sono molto tossiche e le si usano nei

periodi di QUARANTENA del LABORATORIO. Questi periodi avvengono quando cominciano a crescere i LIEVITI

nel laboratorio (spesso nel periodo primaverile) e si mettono sotto cappa a bollire le ALDEIDI e lascio aperte le finestre

per 2-3 settimane e poi torno a lavorarci.

Posso usare approcci di STERILIZZAZIONE, adoperando diversi approcci:

CALORE UMIDO: AUTOCLAVI. L’AUTOCLAVE funziona con VAPORE ACQUEO ad ALTA

 PRESSIONE e TEMPERATURE che vanno da 120 a 130 °C (vengono uccise anche le ENDOSPORE). Sa la

uso per sterilizzare bottiglie o strumentazioni varie, le devo lasciare aperte, se no IMPLODONO. In ogni caso

uso pressioni e temperature diverse a seconda di quello che devo sterilizzare.

CALORE SECCO: STUFA (che ora si usa di meno). Possono essere VENTILATE o A FIAMMA a 180 °C

 per 3 ore e posso adoperarle per sterilizzare i recipienti usati di vetro.

AGENTI CHIMICI

 FIAMMA DEL BECCO BUNSEN: posso adoperarlo sotto cappa. Lo posso usare per sterilizzare le

 strumentazioni metalliche oppure dei vetrini.

IRRAGGIAMENTO UV sotto cappa.

 FILTRO DI POROSITA’: si tratta di filtri di cellulosa con dei pori più o meno grandi (0,1 – 0,2 – 0,45 μm), il

 cui diametro diverso mi permette di poter trattenere microrganismi, spore, batteri, ma NON VIRUS.

MODALITA’ DI CRESCITA DELLA COLTURA CELLULARE

Mi occorre il MEDIUM (o terreno di crescita), con la soluzione di DULBECCO, che ha migliorato le tecniche di Hary

Eagle. Mi occorre PLASTICHERIA, CAPPA A FLUSSO LAMINARE (per manipolare le cellule), INCUBATORI

(dove crescere le cellule), MICROSCOPIO OTTICO ROVESCIATO (per osservare le cellule) e le CENTRIFUGHE,

MAGNETI TERMORISCALDATI (per conservare terreni conservati in frigo) Non si possono, infatti, seminare le

cellule incubate a 37 °C su un terreno freddo di frigo e prima va riscaldato.

Nel 1952 harry Eagle ha brevettato un TERRENO di CRESCITA BASE, ma perfezionato poi da Dulbecco. Al terreno

base sono poi aggiunti GLUTAMMINA, SIERO, INSULINA specifici per quello che devo coltivare. Se coltivo

NEURONI non ci metto certo il GLUTAMMATO. I terreni sono soluzioni ISOTONICI, TAMPONATI e STERILI,

contenenti fattori di crescita per le cellule che devono crescere. Ci sono anche SALI INORGANICI (importanti per

l’equilibrio osmotico) e per la presenza di IONI IMPORTANTI per le attività cellulari. Ho anche SISTEMI

TAMPONE. Infatti, i terreni contengono BICARBONATO e ACIDO CARBONICO (che è un ACIDO DEBOLE).

Questo equilibrio rosso in termostato viene mantenuto dalla presenza di anidride carbonica al 5%. Le cellule usano per

produrre energia e per crescere il GLUCOSIO e con i 10 passaggi di REPLICOLISI ottengono PIRUVATO e ATP e il

PIRUVATO è usato dalla LattatoDeHidrogenasi, per produrre LATTATO. Le cellule usano la GLICOLISI e la

FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA. Le cellule in coltura, però, usano per lo più la GLICOLISI. Producono

GLUCOSIO e formano ATP, NADPH e PIRUVATO. Questo non va nel CICLO DI KREBS, ma è usato dalla LDH e si

forma NAD+ + H+ + LATTATO. La LDH permette così di ripristinare il pull di NAD+, andando ad ossidare NADH a

NAD+ + H+ e anche il LATTATO. L’H+ con il HCO3 riforma l’ACIDO CARBONICO (nel terreno), che dissocia in

ACQUA e anidride carbonica.

Vanno anche aggiunti degli INDICATORI DI pH. I terreni contengono il ROSSO FENOLO, un indicatore di pH di

colore ROSSO-ARANCIO a pH 7.2, che diventa GIALLO a pH acido e FUXIA a pH basico. Se le cellule

metabolizzano velocemente e producono molto H+, l’indicatore diviene GIALLO. Se invece metabolizzano poco, il pH

è alcalino e vedrò l’indicatore FUXIA. C’è un equilibrio tra la dissociazione e l’associazione di H+, che passa da

ACIDO CARBONICO a BICARBONATO e IDROGENIONI e, in questo modo, il pH è mantenuto a 7 – 7,2.

Oltre ai Sali minerali e al sistema tampone, abbiamo anche degli ZUCCHERI, che possono essere usati solo mediante la

GLICOLISI. Ci sono anche delle VITAMINE (A,B ed E), AMMINOACIDI (importanti per la biosintesi delle

proteine), SIERO (generalmente il BSA) con fattori di crescita, che sono importanti non solo per la crescita delle

cellule, ma anche per attivare le VIE DI SEGNALAZIONE delle MAP CHINASI. Per le cellule NERVOSE uso SIERO

EQUINO, che ha dei fattori di crescita adatti.

CAPPE A FLUSSO LAMINARE

ORIZZONTALE: utili per preparare le soluzioni, non usata per coltivare cellule

 18

VERTICALE di classe I: usata solo se la stanza è sterile, perché sulle cellule ci passa tutto prima di essere

 sterilizzate.

VERTICALE di classe II: è più usata rispetto alla classe I e ha una DOPPIA entrata di FLUSSO di

 sterilizzazione. L’aria che entra (dove l’operatore lavora con le mani) viene FILTRATA e poi lo ripassa, viene

filtrata e nuovamente e poi estrusa.

VERTICALE di classe III: usata soprattutto quando si lavora con i VIRUS. L’aria passa posteriormente, passa

 per il filtro EPA e poi l’aria esce.

CHIUSE: dove l’operatore inserisce due mani in due buchi. Usata quando si lavora con PATOGENI

 INCUBATORE AD ANIDRIDE CARBONICA

Sono delle macchine che vanno a 37 °C al 5% di anidride carbonica, perché il prodotto finale del metabolismo è

anidride carbonica. Generandolo dall’ambiente mantengo il pH del mezzo costante.

PLASTICHERIA

FIASCHE: una faccia è trattata con materiali simili a quelli della MATRICE, così le cellule possono crescere

 in ADESIONE (ovviamente per le cellule che crescono in adesione).

CAPSULE PETRY

 FALCON

 VASSOI DA BANCO: hanno diametri diversi e hanno nomi diversi a seconda del numero di buchi.

 RISCHI PER LE COLTURE CELLULARI: LE CONTAMINAZIONI

Annoveriamo MUSCHI, FUNGHI, MICOPLASMI, LIEVITI, MUFFE e BATTERI.

I batteri li vedo anche ad occhio nudo, perché l’aspetto del terreno della FIASCA diventa GIALLO e al microscopio mi

sembra della sabbia. Posso usare della CANDEGGINA al 5-15% e la lascio ad incubare qualche ora. Ovvio che perdo

la COLTURA CELLULARE. Le muffe sono dei cuscinetti che galleggiano e butto via tutto. I peggiori sono i

MICOPLASMI, che non vedo a meno che non adoperi particolari approcci. Hanno delle dimensioni di 0,3 μm e li vedo

se adopero approcci di FLUORESCENZA (mediante DAPI o EXT – sonde fluorescenti), con struttura analoga

all’etidio bromuro. S’intercalano nel DNA e vedrò colorato il DNA. Se la coltura non contaminata vedrò colorati solo i

nuclei, se vedo colorato anche il citoplasma, vuol dire che ho dei micoplasmi che hanno infettato la coltura e vedo il

DNA fluorescente dei micoplasmi. COME STUDIAMO LE CELLULE

Al microscopio controlliamo lo STATO METABOLICO, il FENOTIPO e la MORFOLOGIA della coltura cellulare.

Ovviamente dobbiamo introdurre la MICROSCOPIA:

MICROSCOPIA OTTICA IN CAMPO CHIARO: si tratta di un microscopio con la lampadina bianca, con

 delle LENTI e degli OCULARI. Lo si usa quotidianamente.

MICROSCOPIA A CONTRASTO INTERFERENZIALE: microscopia ottica in campo chiaro, ma mette in

 dettaglio particolari cose

MICROSCOPIA a FLUORESCENZA: è sempre una microscopia ottica e mette in evidenza dettali cellulari

 usando delle molecole a fluorescenza. Di questo tipo di microscopia fanno parte:

MICROSCOPIA CONFOCALE: usa il LASER

o MICROSCOPIA A FLUORESCENZA: usa la luce

o

Con la microscopia in campo chiaro possiamo prendere una fiasca, metterla sotto al microscopio e vedere alcune cellule

più appiccicate sul fondo e altre cellule non POLIGONALI, ma TONDE in sospensione, segno che sono morte o stanno

morendo. Potrebbero non aver più posto nella fiasca o aver finito i nutrienti. Con questo tipo di MICROSCOPIA posso

valutare lo STATO DI CONFLUENZA di una coltura cellulare.

Nella MICROSCOPIA A CONTRASTO DI FASE: è una microscopia in campo chiaro e si usano dei filtri che creano

un contrasto e mettono in evidenza delle particolari cellule con NUCLEO, NUCLEOLI, CITOSOL e MEMBRANA,

senza vederne l’ULTRASTRUTTURA.

MICROSCOPIA A CONTRASTO INTERFERENZIALE: microscopia in campo chiaro, ma riusciamo a vedere

l’ULTRASTRUTTURA della coltura. Vediamo la variazione della morfologia tridimensionale della coltura. Vediamo

se le cellule sono in buona salute e si riesce ad apprezzare se hanno delle propaggini e se si stanno staccando dalle altre.

MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

Riusciamo a mettere in evidenza una o più strutture intracellulari.

Abbiamo una FONTE di LUCE che illumina con UV nel VISIBILE. Posso vedere contemporaneamente una o più

strutture intracellulari grazie a delle molecole di sintesi chimica, dette FLUOROFORI che, se eccitati ad una certa

lunghezza d’onda, possono emettere ad una lunghezza d’onda maggiore e a minor freqeunza.

Riesco a vedere fino a 3 fluorescenze diverse.

Se adoperassi il DAPI potrei vedere il NUCLEO. In questo caso, avremmo emissione a 410 nm e una colorazione BLU.

Viene eccitato ad una lunghezza d’onda tra 300-400 ed emette a 410 nm. Se mettessimo in evidenza i microtubuli del

citoscheletro vedremo la colorazione ROSSA, in VERDE l’ACTINA F (che forma raggi nel citoplasma).

Possiamo adoperare anche la microscopia CONFOCALE, che usa il LASER, ma indicata solo in alcuni casi, come lo

studio di BIOFILM o MATERIALE FISSATO. Nel caso in cui stessimo lavorando con colture cellulari (che sono

sensibili al LASER), allora adoperiamo la microscopia ad EPIFLUORESCENZA. 19

COMINCIARE A LAVORARE

Una volta valutato lo stato delle cellule, prendo la mia coltura e mi assicuro che tutte le cellule siano cresciute in 10% di

SIERO, affinché la fiasca sia quasi tutta occupata. Potrei dover usare della TRIPSINA (più concentrata di nquella che

ho usato, eventualmente, per staccare cellule tumorali).

Una volta che al microscopio si sono valutate lo stato di confluenza, la morfologia e il fenotipo, il ricercatore decide se

usare le cellule oppure no. Va ricordato che vanno adoperate le colture cellulari al 50-70% in STATO DI

CONFLUENZA, poiché sono nello stato di CRESCITA EPONENZIALE. Dove ho dei buchi intercellulari, significa

che le cellule sono in fase metabolicamente attive e le userò. Nel caso in cui fossero al 100% di confluenza devo

SPLITTARLE o PASSARLE in altri contenitori.

I passaggi delle colture si fanno per tripsinizzazione e uso tripsina a diverse concentrazioni a seconda delle cellule che

tratto. Facciamo due esempi:

• HeLa 0,05% TRIPSINA

• Fibroblasti 1% TRIPSINA

La tripsina la uso, in quanto si tratta di una proteasi che rompe i legami tra le proteine. Deve agire per un tempo non

troppo lungo, altrimenti romperebbe le proteine di membrana. Dopo che ha agito per un tempo sufficiente aggiungo del

siero (che ha inibitore di proteasi) e incubo a 37 °C. La tripsina è stata diluita e inattivata dall’INIBITORE.

Ora che ho la coltura in sospensione, posso decidere di passare le cellule in altre fiasche, PROPAGANDO la coltura.

Potrò denotare le varie colture nelle diverse fiasche, attribuendogli un nome, che può essere il nome delle cellule in

questione e il numero di passaggi (o split eseguiti). Avrò una coltura di quarto passaggio se l’ho ottenuta da una coltura

di terzo passaggio che magari era arrivata al 100% di confluenza.

Solitamente è meglio adoperare colture donotate da passaggi bassi, perché così sono sicuro che le mie cellule hanno

subito poche modifiche fenotipiche e sono ancor ben lontane dalla senescenza. Inoltre le uso di passaggi bassi, perché

quando potrei ritrovarmi a rifare l’esperimento, devo rifarlo su colture di uno stesso passaggio di quella usata

precedentemente o poco più alto/basso. Le cellule EMOPOIETICHE non necessitano di tripsinizzazione.

CONTA DELLE CELLULE

Posso usare la CAMERA DI CONTA e la uso sotto cappa. Ci sono due VITI che tengono fermo un vetrino copri-

oggetto e poi c’è la BASE con 2 scanalature (nonché entrata della camera). In realtà è una camera divisa in due

sottocamere e su ogni rettangolo c’è una griglia e, adoperando una formula particolare, possiamo contare le cellule vive,

usando il colorante TRIPNA BLUE, che entra solo nelle cellule morte e metabolicamente INATTIVE con la membrana

rotta, entrando facilmente. Posso decidere di fare un rapporto tra le cellule bianche/traslucide che vedo, oppure quelle

blu. Questo tipo di conta è il più frequente, ma ci sono anche dei CONTATORI AUTOMATICI, molto usati negli

OSPEDALI. Pescano un po’ di soluzione salina (poiché la macchina ha due elettrodi che misurano il POTENZIALE

ELETTRICO.

Costruisco allora un grafico e metto in ascisse il tempo, mentre in ordinate metto il numero di cellule e valuto se sono in

FASE INIZIALE DI CRESCITA, FASE ESPONENZIALE o in FASE DI PLATEAU.

Semino una serie di fiasche tutte uguali, su cui mi interessa valutare la curva di crescita; le tripsino e faccio fiasche una

per ogni tempo in cui voglio vedere quante cellule ho in tempi diversi. Ogni fiasca la lascio per un tempo via via

maggiore per i fatti suoi, per la quale valuterò a che fase siamo delle tre disponibili. A questo punto, dopo aver valutato

per ognuna delle fiasche originate (a cui ho dato il nome delle ore che le ho lasciate per i fatti suoi) il numero delle

cellule morte e vive, mi costruisco il grafico. Distinguerò:

• FASE DI LATENZA (dalle 24 alle 48 ore le cellule prendono confidenza don l’ambiente e sono poche in fase

S e preferiscono stare in fase G0 per preparare tutto quello che gli servirà per proliferare)

• ENTRATA in FASE S (dopo 48 ore le cellule replicano e si dividono perché hanno prodotto ciò che gli serve.

• FASE DI PLATEAU: le cellule non replicano più per aumentare le dimensioni della coltura, dal momento

che, avendo raggiunto confluenza 100% e in virtù dell’inibizione da contatto, smettono di proliferare.

Nella fase di Plateu la mia coltura è al 100% di confluenza. Devo decidere se buttarla o passarla.

Se lascassi le cellule della coltura al loro destino, queste andrebbero incontro A CRESCITA

DISCENDENTE e quindi a incontro a MORTE (verso le 110 ore – fino a 100 ore replicano

anche bene). Possiamo contare le cellule, fare una CURVA DI CRESCITA e vedere quanto le

cellule impiegano a DUPLICARE e passare da 100.000 a 200.000.

VEDERE LE CELLULE CHE STANNO DUPLICANDO IL DNA NELLA FASE MITOTICA

Possiamo fare questo adoperando degli ANALOGHI alle BASI AZOTATE e andiamo a misurare il tempo che impiega

il DNA per duplicarsi. Possiamo usare un APPROCCIO RADIOATTIVO, adoperando del TRIZIO sulla TIMIDINA

(TIMIDINA TRIZIATA) e dopo 24-28-72 ore di INCUBAZIONE, portiamo le cellule nello SCINTILLATORE, per

misurare la radioattività. Avrò cellule più colorate o meno colorato rispettivamente sa avranno o no duplicato il loro

DNA.

Oppure posso usare un ANTICORPO legato ad una CODINA REPORTER, oppure ad una MOLECOLA

FLUORESCENTE. Può essere BIOTINILATO in alternativa, con approcci di IMMUNOISTOCHIMICA. 20

Nel caso adoperassi il TRIZIO misuro le CONTE RADIOATTIVE, nell’altro caso valuto direttamente con analisi

qualitativa. Se avessi l’anticorpo marcato che, per esempio, mi riconosce la BROMODEOSSIURIDINA, vedrò

particolari cose a livello delle cellule.

Se andiamo a colorare il NUCLEO con DAPI (BLU) e anticorpo che riconosce la TIMIDINA TRIZIATA marcato in

verde, vedremo alcune zone in corrispondenza del nucleo BLU GIALLE.

VEDERE LA VITALITA’ CELLULARE

Posso adoperare il TRIPAN BLU, che adoperavo anche per fare la conta delle cellule e riesco ad avere un INDICE DI

BENESSERE DELLA COLTURA. Se ne conto l’80% blu e il 20% bianche, devo buttare tutto, perché è indice che ci

può essere contaminazione, oppure non stanno bene le cellule. VICEVERSA.

Se abbiamo una mutazione nel DNA MITOCONDRIALE, che si esplica su una ridotta produzione di ATP. Noi

sappiamo, infatti, che un’alterazione nell’assetto delle proteine della CATENA RESPIRATORIA, può ripercuotersi

sulla quantità di ATP e anche sullo stato funzionale e di benessere cellulare.

Possiamo rilevare la quantità di ATP totale adoperando un approccio di BIOLUMINESCENZA (mediante il

LUMINOMETRO), ma anche usando lo SPETTROFOTOMETRO.

Per vedere la VITALITA’ CELLULARE per SPETTROFOTOMETRIA, si suddivide in 2 saggi, che sono l’SRB e

l’MTT. Questi li usiamo quando vogliamo studiare gli effetti CITOTOSSICI sulle cellule indotti da farmaci o da

sostanze tossiche, altrimenti usiamo il TRIPAN BLU (che è più veloce). Nel caso in cui uno di questi due approcci

interferisse con il farmaco, allora usiamo quello che non interferisce.

SAGGIO MTT (SALE DI TETRAZOLIO) GIALLO. Ci dà una stima delle cellule metabolicamente attive.

 Quando aggiungo il SALE alle cellule, viene ridotto dalle LDH e dalle DEIDROGENASI cellulari (e altre del

complesso primario mitocondriale). Ciò comporta il fatto che le cellule siano vive e viene ridotto a

FRMALZANO (BLU). Il giorno dopo il terreno delle cellule è BLU se le cellule sono vive. Ora sfrutto

l’assorbimento a 570 nm e stacco le cellule e ne misuro l’assorbanza. Con una CURVA DI CALIBRAZIONE

dall’assorbanza, risalgo alle cellule vive in quella precisa fiasca.

SAGGIO SRB (SULFORO D’AMINA) FUXIA. Ci dice il contenuto proteico delle cellule che possono

 

essere VIVE o MORTE. Questo tipo di approccio ci mostra la vitalità cellulare come CONTENUTO

PROTEICO, che ci sono anche nelle cellule morte. La sua vitalità sta nel fatto che, va detto prima

Dopo che ho valutato ad occhio nudo cellule morte e vive, devo assicurarmi che il dato sia confermato

dall’osservazione al microscopio. Successivamente, devo nuovamente confermare mediante lo

SPETTROFOTOMETRO. Se ho delle cellule morte al microscopio, dovrò vedere il terreno giallo (perché non riducono

l’MTT). Al contrario, se vediamo cellule vive al microscopio, queste dovranno essere BLU e vedere l’emissione

specifica allo spettrofotometro. CONGELAMENTO DELLE CELLULE

Se le mie cellule stanno bene, posso portarle avanti e farci uno STOCK, perché se perdessi la mia coltura, almeno ho

una BANCA da dove andarle a prendere e ricominciare l’esperimento. Devo passare le cellule e poi congelarle quando

sono al 50-70% allo stato di confluenza. Quando le congelo, devo stare attento di congelare passaggi bassi e senza che

siano rimaste troppo a lungo in INCUBATORE.

Se andassi a CONGELARE le cellule nel freezer a -80 °C (per bloccare tutte le reazioni metaboliche), sono sicuro che

dopo 2-3 giorni le cellule non ripartono se le scongelo. Se, invece, le mettessi prima in freezer e poi in AZOTO

LIQUIDO (-190 °C) potrebbero partire anche dopo anni.

Le cellule non devono danneggiarsi nel processo di congelamento e si deve formare del GHIACCIO AMORFO e non

CRISTALLINO per non spaccare le cellule.

Per evitare che le membrane possano rompersi, è bene aumentare la quantità di proteina nelle cellule (aumento

ARTEFATTUALE), adoperando una elevata concentrazione di SIERO (sempre quello ricco di fattori di crescita). Devo

aggiungere anche AGENTI CRIOPROTETTIVI, come GLICEROLO (più che altro usato per le cellule batteriche) e

DMSO (per congelare le cellule eucariote). Possiamo aggiungere SIERO 50-90% (a dipendere dalle cellule che devo

congelare) con il 10% di DMSO o GLICEROLO e terreno di crescita se uso una concentrazione di siero inferiore al

90%.

Questa elevata quantità di siero contiene una elevata quantità di proteine, che permette di MANTENERE

L’INTEGRITA’ DELLE MEMBRANE CELLULARI. Abbiamo una elevata quantità di proteine nel siero che fanno da

MURO DI GOMMA e le cellule tendono meno a rompersi. Le cellule in questo modo vengono congelate lentamente,

perché quando si dà del siero all’esterno di esse, fa da sorta di MURO DI GOMMA ed è quello che permette la

procedura di congelamento.

Ci sono delle CRYOVIALS da 1-15 ml servono per congelare le cellule e dopo che ho preparato le cellule (staccate,

contate e centrifugate, eliminare terreno dove sono cresciute, tolgo il surnatante e prendo il PELLETT) gliele metto

dentro assieme al TERRENO DI CONGELAMENTO. A seconda che le cellule amino stare più o meno vicine,

metteremo una quantità maggiore o minore di terreno di congelamento.

Mettiamo le VIALS prima in ghiaccio per 10 minuti a -20 °C, poi metterle in ghiaccio a -80 °C Over Night. Da -80 °C

possiamo decidere di tenerle a -80 °C sapendo che possiamo tenerle vitali per 2-3 mesi, oppure possiamo trasferirle il

giorno dopo nel BIDONE DELL’AZOTO, dove potranno restare vitali per molto più tempo. 21

Quando apriamo il bidone dell’azoto c’è da stare attenti ai FUMI d’AZOTO che possono bruciare. Tiriamo su il

coperchio, a cui è attaccato il REC con le SCATOLE in cui poter inserire le MICROVIALS. Il liquido va fatto defluire,

perché quando il liquido da alta pressione passano a bassa pressione dell’ambiente esterno, si ha un fenomeno per cui

possono scoppiare i tappi delle VIALS e c’è da stare molto attenti.

Per scongelare le VIALS che derivano dall’azoto liquido, le mettiamo in ghiaccio a -80 e poi a -20 (facciamo il

procedimento inverso). Poi metto le VIALS in un bagnetto a 37 °C in termostato e appena ho la sospensione cellulare,

metto il tutto in un tubo di centrifuga (così elimino il DMSO che a 37 °C è tossico) e, dopo aver centrifugato ed

eliminato il surnatante, metto il pellett risospeso in terreno di crescita e semino in una fiasca e poi SI SPERA che la

coltura riparta. LE PROTEINE

La fonte che devo avere a disposizione per fare qualunque esperimento sono le cellule e poi posso analizzare le

BIOMOLECOLE.

Cosa faccio per studiare le proteine?

La proteina X ha una certa funzione e voglio vedere se questa proteina è dentro alle cellule che sto studiando.

Studiamo le proteine che sono REGOLATORI, TRASPORTATORI e posso volere isolare quella proteina, magari

perché mi interessa la STRUTTURA, poter PRODURRE ANTICORPI per quella proteina, studiare i MECCANISMI

DI CATALISI e la SEQUENZA AMMINOACIDICA.

La devo estrarre dal modello sperimentale che sto usando. Purificare una proteina significa ottenerla senza altre proteine

del tessuto che sto analizzando. La proteina d’interesse è l’unica presente nel campione e per purificarla posso

adoperare degli approcci biochimici per purificare la proteina ed ottenere la MASSIMA RESA, in poco tempo e pochi

soldi.

Se m’interessa fare una STRUTTURA TRIDIMENSIONALE della proteina, posso voler fare una

BIOCRISTALLOGRAFIA o MNR e devo ottenere la proteina più pura possibile. Se invece devo produrre anticorpi, la

proteina può essere pura al 50% e posso adoperare delle metodologie diverse.

Ovviamente devo partire dalla LETTERATURA per capire qual’è la FONTE più abbondante della proteina che devo

studiare, in che organo o in che tessuto essa è più abbondante.

Devo anche partire dal presupposto se mi accontento della proteina denaturata oppure NATIVA. In altre parole, uso

detergenti o no?

Se voglio vedere i meccanismi di catalisi, la proteina mi serve nativa. La strategia di purificazione la stabilisco a

seconda di quanto più o meno pura io voglio la mia proteina. Mi serve anche capire da quanto materiale partire.

Inizialmente i passaggi di purificazione possono essere grossolani e li affino sempre di più verso la fin, per ottenere

specificamente la maggior parte della mia proteina d’interesse.

Durante la purificazione della proteina ho diverse frazioni:

OMOGENATO o LISATO: poltiglia che mi deriva dalla rottura dell’organo da cui parto per ottenere la

 proteina. Ho un volume in ml molto grande.

Ogni STEP CROMATOGRAFICO migliorerà la purificazione della proteina e il volume totale diminuirà sempre di più.

Ad ogni step cromatografico c’è da vedere la concentrazione proteica, per vedere se l’abbiamo persa oppure nola

purificazione di proteine richiede tecniche principali e devo tenere presente quando la purifico quanto deve essere pura,

quanta me ne occorre e allora devo scegliere una sorgente per purificare la proteina d’interesse.

La proteina mi serve in forma NATIVA (che tiene la sua struttura 3D e funziona in vitro) o la posso usare anche

denaturata. I parametri che un ricercatore deve tenere presente durante la purificazione sono:

ATTIVITA’ SPECIFICA

 FATTORE DI PURIFICAZIONE

 RESA TOTALE (quanta proteina ho ottenuto alla fine della purificazione?)

 FASI DI PURIFICAZIONE PROTEICA

Quanta, come mi serve la proteina?

Oltre a questa devo scegliere se partire da un microrganismo che over-esprima la mia proteina transgenica.

Devo determinare la concentrazione proteica e in ogni fase della purificazione devo avere degli approcci per vedere se

nella mia frazione c’è della proteina di mio interesse, prima di passare allo step successivo, altrimenti è inutile che

procedo con gli step.

Preparo le fasi di purificazione a tavolino, tenendo conto che devo avere il numero minore di passaggi e usare approcci

economici.

Devo usare dei BUFFER IDONEI una volta che ho purificato la proteina, per poterla CONSERVARE. Potrei non usare

il BUFFER DI RISOSPENSIONE, perché potrebbe denaturare la proteina.

E’ importante che il saggio sia eseguibile con una piccola quantità di CAMPIONE PROTEICO, perché se no usa tutta

la frazione per saggiare la presenza della proteina (si fa in modo di prendere un campione di 2-3 μl).

E’ importante ricordarsi di determinare ad ogni step cromatografico la concentrazione proteica. Si tratta di una

ROUTINE nella procedura di purificazione. Questo lo facciamo per approcci di spettrofotometria valutando

l’assorbanza a 280 nm, oppure con METODI COLIRIMETRICI. 22

Setto il BIANCO, inserisco la cuvetta con la proteina e valuto l’assorbanza. Si tratta di una STIMA e non di una

VALUTAZIONE PRECISA. Si tratta di un assorbanza che dipende dal numero di doppi legami che le proteine hanno e

si valuta per PONTI DISOLFURO, TRIPTOFANO e TIROSINA, la FENILALANINA non assorbe.

Essendo le proteine costitute da un numero di questi amminoacidi vari, avrò assorbanze diverse (ma un massimo di 289

nm).

Gli svantaggi di questo metodo conservatore sono per il fatto che la proteina deve essere il più pura possibile, ma anche

non devono esserci RNA/DNA, che assorbono a 260 nm. Possiamo valutare l’assorbanza più simile alla verità,

calcolando la concentrazione della proteina in mg/ml, sottraendo 0,76 (A260) a 1,55 (A280).

Se ho fatto il primo step della purificazione e ho un eppendorf con la frazione, si valuta l’assorbanza a 280 nm.

Se l’assorbimento è maggiore di zero, ho una proteina e posso procedere. Se voglio capire quanta proteina è presente,

perché, ad esempio, devo dividere il campione, devo avere dei metodi più precisi per quantificare la concentrazione.

I metodi più precisi sono i METODI COLORIMETRICI, come quello del BIURETO.

Che cos’è il reattivo del Biureto?

Parliamo di IONI RAMEICI (CuSO4), che contiene del TARTRATO di POTASSIO e SODIO. In un buffer a pH

alcalino, gli ioni rameici formano dei legami con i legami peptidici e il Cu2+ diventa Cu+ e la soluzione diventa

VIOLA e posso misurare l’assorbanza a 550 nm.

Quali sono i vantaggi e gli svantaggi del metodo?

Vediamo i VANTAGGI:

POCO COSTOSO, perché ho delle concentrazioni basse dei reattivi

 RIPRODUCIBILE, per i legami coinvolti

 NON E’ ADATTO A SOLUZIONI con un contenuto proteico inferiore a 1mg/ml.

Vediamo gli SVANTAGGI:

Devo usare una SOLUZIONE BUFFER con pH ALCALINO circa 10. Posso avere delle interazioni se nella soluzione

frazione per purificare possiedo EDTA, TRIS (presenti nella solzuzione di eluizione della proteina) e possono

interferire con la miscela fatta per il METODO DEL BIURETO. Per fare il dosaggio con il reattivo mi preparo la

CURVA STANDARD. Mi preparo una serie di provette dove metto una serie molto grande di proteine (BSA) con 1/10

mg/ml, poiché questo approccio è insensibile a meno di 1mg/ml.

Aggiungo ACQUA, BIURETO, s’incuba per 15 minuti a 37 °C per fare avvenire la reazione e misuriamo l’assorbanza

a 520 nm.

Usando l’assorbanza misurata dalla serie di cuvette si costruisce una CURVA STANDARD, su cui si guarda

l’assorbanza e il volume del campione che contiene la proteina X e, per INTERPOLAZIONE, ottengo la concentrazione

della proteina X sull’asse delle ASCISSE. METODO DI LOWRY

Usiamo il REATTIVO Del BIURETO e il REAGENTE DI FOLIN. Mescolo la sostanza con questi 2 reattivi e vediamo

un BLU PORPORA con un picco d’assorbimento a 660 nm.

La reazione non si sa come avviene. Non si sa bene come questi 2 reattivi permettano di valutare la quantità di proteina.

Si presuppone che il reattivo di LOWRY agisca andando a ridurre gli amminoacidi POLARI TRIPTOFANO e

TIROSINA.

SVANTAGGI:

Si ha interferenza con i SALI DI AMMONIO, che rendono inutilizzabili il metodo di LOWRY. Il sale di ammonio è

importante in certe fasi di purificazione perché, interagendo con il colorante, può falsare il risultato. Procedo come nel

caso del reattivo del BIURETO, ma aggiungo il reattivo di FOLIN, incubo per 30 minuti e valuto l’assorbanza a 600

nm. METODO DEL BRADFORD

E’ il metodo più usato per valutare spettrofotometricamente la concentrazione delle proteine. Devo usare il COMASSIE

BLU che, legandosi alle proteine, sposta il massimo di assorbimento del colorante (normalmente rosso in assenza di

proteina 465 nm) a 595 nm in una soluzione acida (ACIDO CLORIDRICO) dove sciolgo il BLU di COMASSIE e

vedrò BLU.

Il BLU DI COMASSIE si lega con interazioni elettrostatiche NON COVALENTI ai gruppi COOH ed NH2 delle

proteine in soluzione.

Quesrto colorante non colora più o meno intensamente a dipendere dalla composizione amminoacidica proteica, ma con

legami elettrostatici (anche Van der Walls) ai gruppi suddetti proteici. Si lega solo in base all’abbondanza di proteine.

Devo fare una CURVA STANDARD. Si prende una provetta con acqua en altre provette dove metto BSA in

concentrazione crescente. Aggiungo il BRADFORD e la colorazione aumenta man mano che aumenta la

concentrazione della mia proteina. Quindi si prepara la soluzione con la proteina incognita in cui vado a misurare la

concentrazione. Se la concentrazione della proteina è compresa tra certi valori, la vedo anche ad occhio nudo.

Ci sono certi SVANTAGGI:

Vanno buttati i CONTENITORI che uso dove coloro, per il semplice fatto che il colorante li macchia irreversibilmente.

Potrebbero formarsi delle interazioni elettrostatiche con amminoacidi BASICI, ma è raro comunque.

Quale metodo uso allora per determinare la concentrazione proteica?

Devo sceglierlo in base a quello che devo fare, anche se il metodo migliore è quello del BRANDFORD. 23

Posso rilevare la mia proteina con saggi funzionali, per esempio usando un SAGGIO IMMUNOLOGICO, come usare

un ANTICORPO, ma il saggio è talmente specifico che ne deriva l’elevato costo. Si tratta di un saggio anche molto

sensibile, come DOTBLOT, RIA ed ELISA. METODO RIA

Si tratta di un SAGGIO IMMUNOCHIMICO/IMMUNOLOGICO, dove abbiamo l’antigene nell’eppendorf che va

purificato. L’anticorpo è marcato con un ISOTOPO RADIOATTIVO e i saggi con isotopi radioattivi sono sensibili e

specifici e vedo delle quantità nell’ordine dei psicogrammi/ml di proteina.

Gli svantaggi sono che devo lavorare in una CAMERA IDONEA, il fatto che il RADIOATTIVO costa. Ecco, allora,

che potrei usare il TEST ELISA, un saggio IMMUNOENZIMATICO, dove devo adoperare un LETTORE DI

PIASTRA per vedere il prodotto cromogeno originato dall’azione dell’enzima coniugato all’anticorpo secondario che

riconosce l’anticorpo primario. RECUPERO DELLE PROTEINE

Potrei avere proteine INTRACELLULARI, DI MEMBRANA PLASMATICA, MITOCONDRIALE o sui TILACOIDI

nei CLOROPLASTI. Se sono interne spacchiamo la cellula, se sono sulla membrana, basta usare TRIN X 100 o NP40,

che solubilizzano le proteine. Se dobbiamo prendere quelle sui mitocondri, dobbiamo prima rompere le cellule e poi,

mediante centrifugazione ottenere i mitocondri ISOLATI.

Oltre ad usare il NONIDENT P40, il TRITON X 100, possiamo adoperare anche il CHAPS, un detergente

ZWITTERIONICO, con carica positiva e negativa e lo si usa spesso quando la proteina deve mantenere il suo PUNTO

ISOELETTRICO INIZIO DELLA PURIFICAZIONE

SOLUBILITA’ DIFFERENZIALE

Devo avere il LISATO CELLULARE con tutto quello che c’è e il primo passaggio è grossolano e devo separare tutto

quello che è separabile. Posso adoperare la SOLUBILITA’ DIFFERENZIALE.

Ottenuta la frazione cellulare dopo aver ottenuto in soluzione la proteina di membrana, la solubilizzazione differenziale

e poi, per step cromatografici. In questo modo, la proteina viene selezionata in base alle sue caratteristiche chimico-

fisiche.

La SOLUBILITA’ DIFFERENZIALE sfrutta la presenza di GRUPPI ACIDI/BASICI e che permette alla proteina di

essere solubilizzata in base alla FORZA IONICA, TEMPERATURA, pH e la POLARITA’ del SOLVENTE.

Cosi separo la proteina in base a queste 4 caratteristiche (una delle 4), alcune proteine precipitano e altre no, restando

solubili.

La proteina, nella solubilità differenziale, possiede dei gruppi carichi positivamente o negativamente polari e apolari.

La proteina nell’OMOGENATO è in acqua e i gruppi della proteina sono SOLVATATI dall’acqua. Allora una proteina

sarà più o meno solubile in base alla quantità di amminoacidi polari che la costituiscono. Posso usare la solubilità

differenziale nei 4 metodi: precipitazione isoelettrica, precipitazione con ACETONE-ALCOOL, SALTING IN e

SALTING OUT.

Si tratta di un metodo di purificazione grossolano e sfrutta il fatto che le proteine con più gruppi polari sono più solubili

delle altre, che precipiteranno più velocemente.

SALTING significa precipitazione per aggiunta di Sali e ho una provetta in cui ho il lisato cellulare. Quello che succede

è che in pratica il sale dissocia (per esempio NaCl Na+ e Cl-), che sottraggono ACQUA D’IDRATAZIONE alla

proteina. Vicino la proteina ho un numero maggiore di Na+, che sono maggiori rispetto al numero di IONI NEGATIVI.

A maggior distanza, invece, il numero di ioni positivi e negativi sono circa nello stesso numero e formano uno

SCHELETRO ELETTROSTATICO. Quando alle proteine viene sottratta acqua di idratazione, queste tendono a

precipitare. Se la proteina è nota, posso cercare su protocolli la diversa concentrazione di diversi Sali con alla quale

quella proteina precipita. Altrimenti procedo per tentativi. Per eliminare il sale che min resta alla fine della solubilità

differenziale, uso un approccio per DIALISI. Spesso si usa l’AMMONIO SOLFATO per fare il SALTING-OUT,

perché è un sale ad elevata solubilità (500 gr di sale in 1 litro di acqua) e velocizza il SALTING OUT. Questo sale non

denatura le proteine. PRECIPITAZIONE ISOELETTRICA

Per la solubilizzazione o la precipitazione della proteina si sfrutta il pH. Se abbiamo una soluzione che ha un pH che

corrisponde al punto isoelettrico la solubilità delle proteine è minore e tendono subito a precipitare.

Se la carica netta della proteina è 0, non ho più la solvatazione, quindi la proteina non è più carica e non può essere più

IDRATATA e precipita.

La concentrazione del sale che uso per precipitare la proteina per SALTING OUT sono elevate, mentre sono

concentrazioni INTERMEDIE quando precipito dal punto di vista ISOELETTRICO (per far raggiungere alla proteina il

suo punto isoelettrico). Il sale, però, non fa molto bene alle successive fasi di purificazioni e devo rimuoverlo, mediante

DIALISI.

L’acqua scioglie i Sali e la proteina nel SACCHETTO si pulirà dai Sali e potrà uscire dal sacchetto (escono solo le

proteine con un CUTOFF SPECIFICO).

PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI

I solventi sono delle molecole organiche e quelle più usate per la precipitazione sono ETANOLO, ACETONE e

BUTANOLO. Le proteine non sono più solvatate e precipitano grazie ai solventi. 24

Quando uso i solventi devo tenere conto del mio fine ultimo e se la mia proteina mi serve NATIVA o meno.

Dopo che ho applicato il metodo grossolano di purificazione proteica, dopo vado per approcci di CROMATOGRAFIA

a purificare le mie proteine, ma anche le BIOMOLECOLE in generale (ACIDI NUCLEICI, ZUCCHERI, LIPIDI…

CONCENTRAZIONE E CONSERVAZIONE DELLA BIOMOLECOLA

Dopo tutti i passaggi di solubilità differenziale e di cromatografia devo concentrare la proteine e conservarla. Si

conservano a -20 °C e a -80 °C e se volessi conservare per alcuni anni le biomolecole posso adoperare dei

CRIOCONSERVANTI.

Quando eluisco la proteina dalla colonna, mediante BUFFER SPECIFICI, questi devo poi rimuoverli e inserirla in una

soluzione il più naturale possibile, con il pH adatto per il tipo di biomolecola purificata. Posso concentrarla usando il

SALTING OUT, oppure mediante la ULTRAFILTRAZIONE con FILTRI DI CELLULOSA di 0,2 μm.

CENTRIFUGAZIONE

Spesso c’è la necessità di adoperare la centrifuga. Nella purificazione proteica, tra i passaggi, c’è il bisogno di

utilizzarla. Se ho a che fare con delle proteine di MEMBRANA, INTRACELLULARI o EXTRACELLULARI.

Dobbiamo separare le membrane da i resti cellulari, o dal mezzo extracellulare da quello intracellulare, se le proteine

che m’interessano sono extracellulari.

Se la proteine che m’interessa appartiene ad un ORGANELLO, devo separare prima l’organello dalle restanti strutture

cellulari.

La CENTRIFUGAZIONE è un approccio PREPARATIVO per purificare, tramite separazione, solo alcune componenti

cellulari dal resto del lisato cellulare o OMOGENATO.

O delle molecole in sospensione e non precipitano perché non ho accelerazione di gravità. Sono in CONTINUO

MOVIMENTO TERMICO, che le tiene in sospensione.

Per farle precipitare devo aumentare l’accelerazione di gravità. Se ho un movimento accelerato in campo

CENTRIFUGO, le particelle con massa e o densità diversa, sedimentano sul fondo con velocità diverse.

Esistono due tipologie di CENTRIFUGAZIONE:

PREPARATIVA: che separa le cellule e le strutture subcellulari (organelli) o delle VESCICOLE.

 Quando si fa il lisato cellulare e rompo le cellule, le membrane intracellulari e extracellulari possiedono un

doppio strato fosfolipidico e in soluzione acquosa esse si chiudono, formando delle MICELLE (insolubili).

Se rompo le cellule, tutte le membrane plasmatiche, organelli, Reticolo endoplasmatico e Golgi si

riorganizzano a formano i MICROSOMI, ovvero delle piccole vescicole di Reticolo endoplasmico e Golgi per

lo più, che si formano in sospensione quando liso le cellule. Se sono interessato a proteine che stanno

all’interno di questi compartimenti subcellulari, possono ottenerli tali, appunto, mediante centrifugazione

preparativa.

ANALITICA: la uso per separare dal lisato cellulare dei COMPLESSI PROTEICI. Posso separare dal

 LISATO CELLULARE anche dei COMPLESSI dalla catena RESPIRATORIA e solubilizzare le proteine

della membrana interna MITOCONDRIALE tra cui quelli appena visti della catena respiratoria.

Questa tipologia di centrifugazione fa separare COMPLESSI MACROMOLECOLARI o

SOVRAMOLECOLARI.

Mi trovo con una MISCELA di vari componenti di forma sferica e questi possono essere separati in base alla 1)

DENSITA’, 2) TEMPO DI SEDIMENTAZIONE, 3) LIVELLO DI SEDIMENTAZIONE RAGGIUNTO dopo un

CERTO TEMPO, 4) DIMENSIONE delle PARTICELLE.

PARAMETRI FISICI DI UNA CENTRIFUGA

Una qualsiasi particelle è fatta ruotare in una CENTRIFUGA con un ROTORE. La centrifuga possiede un CAMPO

CENTRIFUGO (definito G), che è:

All’interno della centrifuga c’è l’alloggiamento per il campione e c’è l’ASSE Attorno a cui ruota la CENTRIFUGA. Il

RAGGIO può essere MASSIMO (va dall’asse del ROTORE al CAMPIONE), MEDIO o MINIMO, questi ultimi due

espressi in centimetri.

W è la velocità angolare del rotore, espressa in angoli su radianti.

Il campo centrifugo riportato nella formula poco su, può essere descritto come la velocità per la distanza del contenitore

che contiene la sospensione dall’ASSE DI ROTAZIONE.

Il campo centrifugo può essere espresso come una formula che permette di esprimere la velocità angolare del rotore in

RIVOLUZIONI al minuto.

Facendo delle sostituzioni opportune, il CAMPO CENTRIFUGO può essere espresso come RCF, Campo Centrifugo

Relativo, che è:

dove rpm sono le rivoluzioni per minuto. Quando si va a centrifugare, la velocità della centrifuga può essere espressa in

g (campo centrifugo) RCF da cui posos calcolare gli rpm. 25

Quando si compra una centrifuga, viene fornita una tabella detta NOMOGRAMMA, nonché una tabella con i valori

della DISTANZA RADIALE, del CAMPO CENTRIFUGO RELATIVO e la VELOCITA’ MASSIMA DEL

ROTATORE in rpm.

Se devo fare una centrifugata a 3000, ma la centrifuga va in rpm, devo convertire G in rpm. Avendo la distanza radiale

della centrifuga, si può passare da g a rpm con una linea che passa per il punto G che possiedo (3000) e sull’altra riga

corrisponde al valore di rpm.

La velocità con cui le particelle sedimentano dipende dalla DIMENSIONE DELLA MASSA, dalla FORMA, dalla

DENSITA’ e dalla VISCOSITA’ del MEZZO (in cui ci sono sempre le molecole d’interesse) e il CAMPO

CENTRIFUGO APPLICATO.

La velocità di sedimentazione è espressa da:

dove S è il coefficiente di sedimentazione della particelle, che viene moltiplicato per il campo centrifugo G.

Il coefficiente di sedimentazione di una particelle indica la TENDENZA di una particella a sedimentare se sottoposta ad

un CAMPO CENTRIFUGO. Dipende dalla forma della particella. Più essa è tonda e più sedimenta velocemente, perché

si creano meno forse di attrito col mezzo circostante. S viene espresso in SWEDBERG.

Il coefficiente standard di sedimentazione dei MICROSOMI va da 100 a 1000.

Le proteine solubili hanno un coefficiente di sedimentazione che va da 1 a 10. I NUCLEI da 1.000.000 a 10.000.000.

Sfruttando il fatto che le diverse molecole biologiche hanno coefficienti di sedimentazione differenti, è posibile separare

le diverse componenti tra loro con la centrifugazione.

MECCANICA DELLA CENTRIFUGA

La centrifuga è una scatola di metallo con dei ROTORI e ci sono dei DISCHI che si possono mettere o togliere e che

hanno degli alloggiamenti per i campioni. Ci sono dei contenitori per eppendorf che vanno da 0,5 ml, fino a contenitori

per le FIASCHE.

Le CENTRIFUGHE sono diverse per:

VELOCITA’ MASSIMA RAGGIUNGIBILE (non tutte hanno la stessa velocità).

 PROVVISTE o SPROVVISTE DI

 REGOLAZIONE DELLA TEMPERATURA

 ASSE DI ROTAZIONE per il ROTORE

 NUMERO DI ALLOGGIAMENTI DISPONIBILI 8alcune ne hanno 4, altre 24)

 TIPOLOGIE DI CENTRIFUGHE e APPLICAZIONI

• MICROCENTRIFUGHE: vanno bene solo se il campione da centrifugare ha volume inferiore ai 2ml. C’è la

possibilità di regolare la temperatura (posso centrifugare a temperatura ambiente o a FRESCO – 4 °C), con la

possibilità di raggiungere 10.000 g. Se la particelle sedimenta a velocità superiori, non posso usare questa

centrifuga.

• CENTRIFUGA PREPARATIVA DA BANCO: per tubi da 15 a 50 ml. Possono avere temperature diverse e

arrivano a 7000 g.

• CENTRIFUGHE GRANDI PREPARATIVE AD ALTISSIMA VELOCITA’: arrivano fino a 100.000 g. Le

uso per sedimentare NUCLEI, MITOCONDRI, CLOROPLASTI e COMPLESSI PROTEICI.

• ULTRACENTRIFUGA PREPARATIVA: è una tipo di centrifuga PREPARATIVA, che arriva fino a 600.000

g (30.000 rpm), per sedimentare BIOMOLECOLE, ma anche ORGANELLI, VESCICOLE e RIBOSOMI.

• ULTRACENTRIGHE ANALITICHE: si usano per VALUTARE la massa molecola di una biomolecola

isolata. ROTORI

Possono essere di tipologie diversa:

AD ANGOLO FISSO: il rotore ha un alloggiamento rispetto all’asse, inclinato di un certo angolo che è fisso.

 Si utilizza per precipitare le cellule o nella CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE per ottenere organelli

dal LISATO CELLULARE.

ROTORE ad ALLOGGIAMENTO VERTICALE: il campione è verticale rispetto all’asse del rotore. Si usano

 per fare CENTRIFUGHE su GRADIENTE.

ROTORE con BRACCIO OSCILLANTE. Hanno una posizione verticale quando è fermo e quando il rotore

 inizia a ruotare, il braccio assume direzione orizzontale per avere una separazione molto fine.

CENTRIFUGAZIONE PREPARATIVA

La centrifugazione preparativa può essere di due tipologie differenti:

CENTRIFUGA DIFFERENZIALE

o CENTRIFUGA IN GRADIENTE DI DENSITA’, quest’ultima suddivisa in ZONALE e ISOPICNICA.

o CENTRIFUGA DIFFERENZIALE

Fa una centrifugazione che permette di separare diversi componenti cellulari (membrana e organelli), sfruttando

differenti velocità e diversi tempi. 26


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia molecolare e cellulare
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher paolo.morandi.1987 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Metodologie biochimiche e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Porcelli Annamaria.

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