Metodologie biochimiche I

Tecniche per la purificazione proteica (Molinari)

Intanto devo sapere a cosa mi serve la proteina e quando la purifico per studiarla o adoperarla, me ne serve in grande quantità. Può essere in forma nativa o denaturata e, comunque, posso usarla in ricerca, industria alimentare, farmacia… e, a seconda del campo d’impiego, una purezza più o meno elevata. Posso anche volerla isolare per analizzarne la struttura e lo posso fare in due modi:

• Risonanza magnetica nucleare (e ne devo mettere tanta in soluzione, in modo tale che tenda a cristallizzare)
• Ne faccio un cristallo e lo analizzo per diffrazione a raggi X

Si conosce bene la loro struttura primaria e questa struttura detta le altre strutture, ma non riesco sempre a vedere dei cristalli regolari, perché l’ho purificata male o comunque, è molto difficile farlo.

Passaggi della purificazione

La purificazione non richiede un unico passaggio, ma una serie di passaggi:

• Ottengo le proteine in soluzione.
• Purificazione grezza
• Rifinitura (usando delle tecniche come la cromatografia di affinità, che toglie ogni impurità)

Ovviamente, se le proteine che voglio sono intracellulari, parto con la lisi cellulare e poi devo centrifugare per separare i detriti cellulari non solubili dalle proteine e dal DNA solubili. Quindi precipito gli acidi nucleici e ottengo tante diverse proteine intracellulari. Faccio una purificazione grezza (semplice ed economica) e quindi procedo con la precipitazione frazionata, che le separa in base alla solubilità (purificazione sommaria); quindi ho dei passaggi intermedi ed, infine, la rifinitura, per lo più tecniche cromatografiche.

Metodi di estrazione delle proteine

Parto dalle cellule e se devo estrarre proteina epatica, parto dalle linee delle cellule epatiche e se ne devo prendere tanta non posso sacrificare il fegatino di topo e uso delle cellule di grossi mammiferi, che da coltivare tuttavia sono difficili, perché hanno peculiari esigenze nutrizionali, sono delicate e le mantengo difficilmente in coltura. Allora, il gene che codifica per quella proteina lo prendo, dopo averlo identificato, e lo faccio sovraesprimere da un batterio, che è molto più comodo da gestire. Devo adoperare un cDNA, poiché ha una sequenza più compatta e sta meglio nel vettore di clonaggio (o di espressione). Faccio produrre al batterio qualcosa di nuovo, senza mettere il promotore del gene di mammifero, perché nel batterio si esprimerebbe poco o nulla.

Classificazione delle proteine

Come le classifico le proteine e perché? Le posso classificare sulla base di queste cose:

• Struttura 3D: fibrose, globulari, transmembrana

In questo modo conosciamo la sua eventuale solubilità e il modo in cui purificarla. Anfinsen disse che è la struttura primaria che determina quella tridimensionale. Se si denatura in modo reversibile una proteina in vitro, questa, in virtù della natura degli amminoacidi che la costituiscono, riprende la sua forma 3D nativa.

Tutto ciò che è apolare è verso l’interno e il polare è a contatto con l’acqua. Questa appena descritte sono proteine solubili. Le proteine globulari sono anch’esse così e sono gli enzimi, per esempio. Quelle fibrose sono differenti e sono insolubili (per lo più proteine del citoscheletro e proteine contrattili) a funzione meccanica, per fornire resistenza. Anche le proteine transmembrana sono insolubili e devo adoperare dei metodi di solubilizzazione (come per le proteine fibrose) e diverse dal punto di vista del legame covalente o meno alla membrana fosfolipidica plasmatica (le prime legate covalentemente, le seconde no) e possono essere, rispettivamente, più o meno difficili da solubilizzare.

Le proteine transmembrana sono 4 categorie a seconda di come sono orientate dentro-fuori le estremità COOH e NH terminale e le 4 categorie hanno 7 domini transmembrana. Le proteine di membrana vere e proprie sono attaccate covalentemente ad un lipide di membrana (per esempio l’acido meristinico, un acido grasso idrofobico), inserito nel doppio strato e con COOH (dell’acido grasso), si lega al gruppo amminico (NH₂) della proteina (a formare un legame ammidico). Oppure abbiamo l’acido palmitico che, con il gruppo COOH, si lega al gruppo tiolico (SH) della proteina, a formare un legame tioestereo. Oppure, ancora, abbiamo una proteina attaccata al glicofosfatidilinositolo (GPI) e si parlerà di miristoilazione; palmitoilazione, pirinilazione.

Proteine periferiche e loro estrazione

Le proteine periferiche, possono legarsi non covalentemente con le proteine di membrana integrali o con i fosfolipidi. Le proteine periferiche sono spesso glicosilate, ma questi residui non li trovo in quelle intracellulari o in nelle prototeine integrali di membrana.

Il caso più semplice è quello secondo cui ottengo la mia proteina dall’ambiente extracellulare, meno contaminato rispetto a quelle che dovrei studiare di non secrezione (sicuramente più contaminate). Potrei cercare di farla secernere al batterio, ma non è molto bravo a farlo e, allora, evito di metterci un gene che codifica per un peptide segnale di secrezione. Se la proteina è nel sangue posso concentrarla usando la cromatografia di adsorbimento con colonne di idrossiepatite. Ma spesso ho a che fare con delle proteine intracellulari e devo estrarle velocemente e a basse temperature.

Condizioni di lavoro durante l'estrazione

Perché questo? Spesso devo adoperare dei saggi funzionali, perché i saggi denaturanti sono un rischio per perdere la mia proteina, che, ad alte temperature, potrebbe denaturare. Faccio dei saggi lavorando sempre in cella frigorifera a freddo. Inoltre, il pH deve essere mantenuto (non deve capire la proteina di essere in un ambiente diverso). La proteina deve essere a forza ionica fisiologica e, quando liso la cellula, ci deve essere un tampone che mantiene il pH esterno di 7-8. Se uso NaCl la concentrazione molare deve restare 0,1-0,2 M. Per le proteine citosoliche uso tanto sodio e poco calcio, per quelle plasmatiche uso tanto di entrambi.

Solitamente, le proteine hanno tanti ponti disolfuro, oppure lo possiede la cistina (cisteina + cisteina) extraplasmatica. Quando rompo la cellula le proteine non si devono rendere conto della rottura e non devo farlo a secco, ma con un tampone fisiologico. Le proteine intracellulari sono in un ambiente riducente e il ponte disolfuro ce l’hanno raramente. Quando rompo le cellule devo mantenere un ambiente riducente, se no avrei la formazione di cistine. Ecco allora che posso utilizzare dei mantenitori dell’ambiente riducente come β-mercaptoetanolo o DTT (dititotetirolo) o glutatione.

Inoltre, per inibire proteasi dipendenti da ioni bivalenti (come cofattore), che attiverebbero le proteasi, devo adoperare dei chelanti come EDTA (che chela ioni bivalenti, come calcio, magnesio e ferro) e la sigla sta per acido etilendiamminotetracetico. Ho due COOH da una parte e 2 COOH dall’altra che chelano questi ioni bivalenti. Oltre che attivare proteasi, questi ioni potrebbero legare le proteine e formare addotti che le denaturerebbero. Se la proteina è poco concentrata (molto diluita) è poco stabile e allora uso glucosio, albumina e glicerolo, che la rendono più diluibile. Infatti, le sostanze aggiunte richiamano acqua. Vanno usati anche batteriostatici (sodio azide). Inoltre, c’è da evitare la denaturazione delle proteine all’interfaccia aria-acqua, che formerebbero schiuma. Devo usare dei contenitori siliconati, per evitare che le proteine si attacchino sulle pareti.

Inibizione delle proteasi

Inoltre, se rompo una cellula, rompo anche i lisosomi e ho dei registri per vedere quali sostanze aggiungere per inibire l’azione delle proteasi acide rilasciate. Posso, a tale scopo, aggiungere:

• PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro), che inibisce le proteasi a serina
• Pepstatina, che inibisce la proteasi aspartica

La classificazione delle proteasi, si rifà a seconda dell’amminoacido che possiede nel centro attivo. Il PMSF è un inibitore di alcuni fattori della coagulazione e se respirato in una cappa può essere mortale.

Metodi di rottura delle cellule

Ci sono diversi tipi cellulari che possiamo rompere:

• Lieviti (per lo più unicellulari con delle caratteristiche di economicità e di crescita simili al batterio)
• Batteri (gram +, costituiti da una parete di peptidoglicani e gram- con LPS di superficie)
• Cellule vegetali: molto grosse, con parete costituita di composto fenolici (lignina…), carboidrati e cere
• Cellule di mammifero

Il lievito possiede un nucleo. La cellula di lievito può dare delle modificazioni post-traduzionali ed è molto utile come biofabbrica. Se devo usare un saggio non denaturante posso adoperare lo shock osmotico per rompere le cellule. Il tampone con cui metto in contatto la cellula deve essere, per dare uno shock, iposmotico (forza ionica minore rispetto a quella della soluzione nella cellula) e la cellula tende a scoppiare. Questo è un metodo blando. Oppure posso usare un altro metodo blando, che è quello del congelamento-scongelamento per 3 volte velocemente in azoto liquido e rompo le membrane.

Oppure uso dei solventi, detergenti (SD) e il lisozima nel caso dei batteri. Posso usare delle chitinasi, nel caso dei funghi filamentosi, o la zimolasi nel caso dei funghi veri e propri. Se devo rompere le cellule, dove ho la matrice extracellulare parenchimatosa, posso usare ialuronidasi, collagenasi. Ma un altro metodo è quello di usare il sonicatore, che emette suoni ad alta frequenza e si ha un processo di cavitazione. Il processo di sonicazione consente di mettere un ago nella soluzione in cui ago le cellule e questo fa ingrandire e rimpicciolire il volume delle bolle nella soluzione, che premono sulle cellule e le distruggono (creando sovrapressioni e sottopressioni).

Un altro metodo è quello della pressa francese. Ho la sospensione del batterio e vengono pressati. La pressione aumenta via via e i batteri sono costretti a passare per un piccolo orifizio (che si apre con la pressione) e vanno in una zona a minor pressione. Posso usare dei frullatori con lame taglienti che ruotano, oppure, per le piccole cellule, uso un mortaio e aggiungo della sabbia per aumentare la forza frizionante. Oppure posso usare degli omogenizzatori: ho il recipiente dove muovo un pistone e muovendosi rompe le cellule che sono tra la superficie del mortaio e del contenitore. L’omogenizzatore è detto Dounce o Potter, a seconda che sia, rispettivamente, non automatizzato o sì.

Le proteine di membrana integrali, non quelle periferiche (che posso solubilizzare con tamponi ipotonici o pH molto basici/acidi o, ancora, agenti chelanti), faccio fatica a solubilizzare. Le proteine estrinseche sono facili da solubilizzare. Se sono ancorate o intrinseche, per portarle in soluzione, devo rompere il doppio strato con detergenti forti (SDS), molto usato in elettroforesi delle proteine, Triton X-100, solventi organici o agenti caotropici (piccoli e instabili, per solubilizzare le proteine di membrana). I detergenti possono portare a solubilizzazione formando le micelle, con testa polare fuori e coda idrofobica interna e dentro c’è la mia proteina.

Posso usare SDS oppure detergenti non ionici, come il Triton X-100, o NP40. Abbiamo le proteine in soluzione con le proteine contaminanti (le mie sono poche in confronto). Devo fare in modo che quelle contaminanti diventino meno che le mie d’interesse.

L’attività specifica esprime la percentuale della mia proteina rispetto al totale. Se parlo di enzima, devo dire attività enzimatica (quantità dell’enzima sul totale). Queste due cose le uso, poi, per valutare il fattore di purificazione, ovvero, quanto ho purificato la proteina d’interesse rispetto alle impurità? La indico come attività specifica della proteina della frazione purificata, rispetto all’attività specifica totale. L’efficienza è: quanto materiale d’interesse ho perso nel corso della purificazione? La calcolo come attività totale della frazione/attività totale dell’omogenato iniziale.

Se la proteina è un enzima, è più facile vedere se me ne è rimasta e quanta, ma se ho una proteina non enzimatica, c’è il problema dell’identificazione del saggio per quantificare la mia proteina rispetto al totale (il test deve essere veloce, specifico e quantitativo). Se uso un anticorpo che riconosce la mia proteina, posso fare un saggio immunoenzimatico (ELISA) o RIA. Per vedere le proteine totali ci sono diversi modi: posso farlo con la spettrometria e quantifico le proteine. L’assorbanza di una soluzione (lo dice Beer-Lamber) è data dal coefficiente di estinzione molare di quella soluzione, che moltiplica la concentrazione della soluzione, moltiplicata per la distanza del cammino ottico.

Il coefficiente di estinzione molare è l’assorbanza di quella soluzione ad una concentrazione di 1M, con un cammino ottico =1, quindi: Ads = log I₀/I =c.l.c. Il coefficiente di estinzione molare di una molecola, corrisponde alla sua assorbanza ad una certa lunghezza d’onda. Assorbe sempre quella lunghezza d’onda ad 1M, nelle condizioni suddette.

A 280 nm, le proteine hanno il massimo di assorbimento, per il fatto che possiedono amminoacidi come tirosina, triptofano e ponti disolfuro. La fenilalanina non assorbe. Il fatto che ogni sostanza ha il proprio coefficiente di estinzione molare, dipende dal numero degli amminoacidi suddetti nella loro struttura primaria. Allora, ogni proteina ha un’assorbanza che è diversa da un’altra. È ovvio che non posso usare questo metodo per calcolare l’assorbanza di una proteina che m’interessa, perché, comunque, è sempre un po’ contaminata. Allora uso questo metodo quando ho una soluzione pura (cosa comunque molto rara) e misuro l’assorbanza a 280 nm. Questo è un metodo conservatore.

Ovviamente, non posso avere il coefficiente di estinzione molare preciso e, allora, faccio una curva di taratura, per vedere il massimo di concentrazione proteica. Potrei usare BSA (Bovin Serum Albumin) e la uso perché costa poco ed è abbastanza pura. Va diluita, la misuro e misuro l’assorbanza a 280 nm e faccio una curva. Ma purtroppo anche gli acidi nucleici assorbono vicino a 280 nm (260 nm) e potrebbero interferire con l’assorbanza delle proteine. Comunque, il metodo spettrofotometrico è diretto e conservativo.

Metodi indiretti di rilevazione delle proteine

Oppure posso rilevare indirettamente la mia proteina, legandola a molecole che assorbono nel visibile: in ambiente alcalino (con ioni OH-) applico il metodo del Biureto e faccio reagire la proteina con ioni uranilici (Cu²⁺) che lega gli amminoacidi della proteina. Questa molecola assorbe a 550 nm e il legame tra Cu²⁺ e gli amminoacidi è a prescindere alla composizione amminoacidica e l’assorbimento a 550 nm è uguale per tutte le proteine (dipende allora dalla molecola legante).

Lo ione uranilico forma legami con i gruppi amminici, indipendentemente dalla composizione amminoacidica. Tuttavia, la proteina deve essere più di 1 mg/ml, se no non riuscirei a vederla. Devo tenere conto dei sali d’ammonio, che possono interferire, assorbendo a 550 nm. Tuttavia, il metodo visto non è conservativo e, se prendo del materiale d’interesse, perdo di efficienza. Se aggiungessi acido bicinconinico, che porta alla formazione di un complesso che assorbe a 562 nm, migliorerei la sensibilità fino a 0,2-10 mg/ml e si migliora la sensibilità di 10 volte. Però costa molto.

Oppure c’è il metodo di Lowry, usando degli ioni uranilici (2+), proteina e il reattivo di Folin (costituito di acidi misti di fosfomolibdotungstato) a pH 10 alcalino. Oppure posso usare il metodo di Bradford, dove sfrutto il legame delle proteine al Coassie Brilliant Blue G-250, aspecifico e colora tutte le proteine, conferendo un massimo d’assorbimento a 595 nm. Da solo assorbirebbe a 465 nm. Questo colorante possiede 3 anelli aromatici, che formano delle interazioni idrofobiche con le proteine. I gruppi carichi positivamente delle proteine si legano a gruppi solfonati, formando legami ionici. Devo adoperare quel metodo poco costoso, veloce, sensibile, preciso e tenere conto delle proteine contaminanti.

Metodi di purificazione delle proteine

Come la purifico la proteina? Devo usare diverse metodiche per selezionare le proteine sulla base delle loro diverse caratteristiche:

• Solubilità (per precipitazione frazionata)
• Taglia: in base alla grandezza (ultracentrifugazione, filtrazione su gel, tecnica cromatografica, elettroforesi e ultrafiltrazione)
• Carica: isoelettrizzazione o cromatografia a scambio ionico
• Residui idrofobici (con cromatografia idrofobica)

In questo modo, le differenzio in base alle caratteristiche chimico-fisiche, ma mai ottengo purezza al 100%. Posso operare con le metodiche nell’ordine visto e otterrò, via via, delle proteine accomunate da peculiari caratteristiche (e tolgo quelle contaminanti). Di gran lunga, il metodo che porta alla maggior purezza è la cromatografia di affinità e abbiamo 2 fasi:

• Fase stazionaria (liquida, supportata da un solido o solida)
• Fase mobile, che passa sulla fase stazionaria

A seconda dell’affinità tra le due diverse parti faccio in modo che le molecole reagiscono per un tempo diverso e per più o meno tempo con la fase stazionaria. Le molecole trattenute più a lungo escono dopo un tempo maggiore, quelle altre escono prima (hanno meno o nulla affinità). Ovviamente, nella fase stazionaria, metto dei ligandi specifici per il recettore (proteina). Devo sfruttare qualcosa che ha la mia proteina e non le altre. Dovrei fissare un substrato covalentemente alla colonna, se volessi isolare l’enzima, quale interazione biospecifica. Questa sfrutta le caratteristiche 3D proteiche.

Precipitazione frazionata

Precipito le proteine aggiungendo delle quantità crescenti di sale. Questa metodica è anche...