Metodologie biochimiche I

MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

Riusciamo a mettere in evidenza una o più strutture intracellulari.

Abbiamo una FONTE di LUCE che illumina con UV nel VISIBILE. Posso vedere contemporaneamente una o più

strutture intracellulari grazie a delle molecole di sintesi chimica, dette FLUOROFORI che, se eccitati ad una certa

lunghezza d’onda, possono emettere ad una lunghezza d’onda maggiore e a minor freqeunza.

Riesco a vedere fino a 3 fluorescenze diverse.

Se adoperassi il DAPI potrei vedere il NUCLEO. In questo caso, avremmo emissione a 410 nm e una colorazione BLU.

Viene eccitato ad una lunghezza d’onda tra 300-400 ed emette a 410 nm. Se mettessimo in evidenza i microtubuli del

citoscheletro vedremo la colorazione ROSSA, in VERDE l’ACTINA F (che forma raggi nel citoplasma).

Possiamo adoperare anche la microscopia CONFOCALE, che usa il LASER, ma indicata solo in alcuni casi, come lo

studio di BIOFILM o MATERIALE FISSATO. Nel caso in cui stessimo lavorando con colture cellulari (che sono

sensibili al LASER), allora adoperiamo la microscopia ad EPIFLUORESCENZA. 19

COMINCIARE A LAVORARE

Una volta valutato lo stato delle cellule, prendo la mia coltura e mi assicuro che tutte le cellule siano cresciute in 10% di

SIERO, affinché la fiasca sia quasi tutta occupata. Potrei dover usare della TRIPSINA (più concentrata di nquella che

ho usato, eventualmente, per staccare cellule tumorali).

Una volta che al microscopio si sono valutate lo stato di confluenza, la morfologia e il fenotipo, il ricercatore decide se

usare le cellule oppure no. Va ricordato che vanno adoperate le colture cellulari al 50-70% in STATO DI

CONFLUENZA, poiché sono nello stato di CRESCITA EPONENZIALE. Dove ho dei buchi intercellulari, significa

che le cellule sono in fase metabolicamente attive e le userò. Nel caso in cui fossero al 100% di confluenza devo

SPLITTARLE o PASSARLE in altri contenitori.

I passaggi delle colture si fanno per tripsinizzazione e uso tripsina a diverse concentrazioni a seconda delle cellule che

tratto. Facciamo due esempi:

• HeLa 0,05% TRIPSINA

• Fibroblasti 1% TRIPSINA

La tripsina la uso, in quanto si tratta di una proteasi che rompe i legami tra le proteine. Deve agire per un tempo non

troppo lungo, altrimenti romperebbe le proteine di membrana. Dopo che ha agito per un tempo sufficiente aggiungo del

siero (che ha inibitore di proteasi) e incubo a 37 °C. La tripsina è stata diluita e inattivata dall’INIBITORE.

Ora che ho la coltura in sospensione, posso decidere di passare le cellule in altre fiasche, PROPAGANDO la coltura.

Potrò denotare le varie colture nelle diverse fiasche, attribuendogli un nome, che può essere il nome delle cellule in

questione e il numero di passaggi (o split eseguiti). Avrò una coltura di quarto passaggio se l’ho ottenuta da una coltura

di terzo passaggio che magari era arrivata al 100% di confluenza.

Solitamente è meglio adoperare colture donotate da passaggi bassi, perché così sono sicuro che le mie cellule hanno

subito poche modifiche fenotipiche e sono ancor ben lontane dalla senescenza. Inoltre le uso di passaggi bassi, perché

quando potrei ritrovarmi a rifare l’esperimento, devo rifarlo su colture di uno stesso passaggio di quella usata

precedentemente o poco più alto/basso. Le cellule EMOPOIETICHE non necessitano di tripsinizzazione.

CONTA DELLE CELLULE

Posso usare la CAMERA DI CONTA e la uso sotto cappa. Ci sono due VITI che tengono fermo un vetrino copri-

oggetto e poi c’è la BASE con 2 scanalature (nonché entrata della camera). In realtà è una camera divisa in due

sottocamere e su ogni rettangolo c’è una griglia e, adoperando una formula particolare, possiamo contare le cellule vive,

usando il colorante TRIPNA BLUE, che entra solo nelle cellule morte e metabolicamente INATTIVE con la membrana

rotta, entrando facilmente. Posso decidere di fare un rapporto tra le cellule bianche/traslucide che vedo, oppure quelle

blu. Questo tipo di conta è il più frequente, ma ci sono anche dei CONTATORI AUTOMATICI, molto usati negli

OSPEDALI. Pescano un po’ di soluzione salina (poiché la macchina ha due elettrodi che misurano il POTENZIALE

ELETTRICO.

Costruisco allora un grafico e metto in ascisse il tempo, mentre in ordinate metto il numero di cellule e valuto se sono in

FASE INIZIALE DI CRESCITA, FASE ESPONENZIALE o in FASE DI PLATEAU.

Semino una serie di fiasche tutte uguali, su cui mi interessa valutare la curva di crescita; le tripsino e faccio fiasche una

per ogni tempo in cui voglio vedere quante cellule ho in tempi diversi. Ogni fiasca la lascio per un tempo via via

maggiore per i fatti suoi, per la quale valuterò a che fase siamo delle tre disponibili. A questo punto, dopo aver valutato

per ognuna delle fiasche originate (a cui ho dato il nome delle ore che le ho lasciate per i fatti suoi) il numero delle

cellule morte e vive, mi costruisco il grafico. Distinguerò:

• FASE DI LATENZA (dalle 24 alle 48 ore le cellule prendono confidenza don l’ambiente e sono poche in fase

S e preferiscono stare in fase G0 per preparare tutto quello che gli servirà per proliferare)

• ENTRATA in FASE S (dopo 48 ore le cellule replicano e si dividono perché hanno prodotto ciò che gli serve.

• FASE DI PLATEAU: le cellule non replicano più per aumentare le dimensioni della coltura, dal momento

che, avendo raggiunto confluenza 100% e in virtù dell’inibizione da contatto, smettono di proliferare.

Nella fase di Plateu la mia coltura è al 100% di confluenza. Devo decidere se buttarla o passarla.

Se lascassi le cellule della coltura al loro destino, queste andrebbero incontro A CRESCITA

DISCENDENTE e quindi a incontro a MORTE (verso le 110 ore – fino a 100 ore replicano

anche bene). Possiamo contare le cellule, fare una CURVA DI CRESCITA e vedere quanto le

cellule impiegano a DUPLICARE e passare da 100.000 a 200.000.

VEDERE LE CELLULE CHE STANNO DUPLICANDO IL DNA NELLA FASE MITOTICA

Possiamo fare questo adoperando degli ANALOGHI alle BASI AZOTATE e andiamo a misurare il tempo che impiega

il DNA per duplicarsi. Possiamo usare un APPROCCIO RADIOATTIVO, adoperando del TRIZIO sulla TIMIDINA

(TIMIDINA TRIZIATA) e dopo 24-28-72 ore di INCUBAZIONE, portiamo le cellule nello SCINTILLATORE, per

misurare la radioattività. Avrò cellule più colorate o meno colorato rispettivamente sa avranno o no duplicato il loro

DNA.

Oppure posso usare un ANTICORPO legato ad una CODINA REPORTER, oppure ad una MOLECOLA

FLUORESCENTE. Può essere BIOTINILATO in alternativa, con approcci di IMMUNOISTOCHIMICA. 20

Nel caso adoperassi il TRIZIO misuro le CONTE RADIOATTIVE, nell’altro caso valuto direttamente con analisi

qualitativa. Se avessi l’anticorpo marcato che, per esempio, mi riconosce la BROMODEOSSIURIDINA, vedrò

particolari cose a livello delle cellule.

Se andiamo a colorare il NUCLEO con DAPI (BLU) e anticorpo che riconosce la TIMIDINA TRIZIATA marcato in

verde, vedremo alcune zone in corrispondenza del nucleo BLU GIALLE.

VEDERE LA VITALITA’ CELLULARE

Posso adoperare il TRIPAN BLU, che adoperavo anche per fare la conta delle cellule e riesco ad avere un INDICE DI

BENESSERE DELLA COLTURA. Se ne conto l’80% blu e il 20% bianche, devo buttare tutto, perché è indice che ci

può essere contaminazione, oppure non stanno bene le cellule. VICEVERSA.

Se abbiamo una mutazione nel DNA MITOCONDRIALE, che si esplica su una ridotta produzione di ATP. Noi

sappiamo, infatti, che un’alterazione nell’assetto delle proteine della CATENA RESPIRATORIA, può ripercuotersi

sulla quantità di ATP e anche sullo stato funzionale e di benessere cellulare.

Possiamo rilevare la quantità di ATP totale adoperando un approccio di BIOLUMINESCENZA (mediante il

LUMINOMETRO), ma anche usando lo SPETTROFOTOMETRO.

Per vedere la VITALITA’ CELLULARE per SPETTROFOTOMETRIA, si suddivide in 2 saggi, che sono l’SRB e

l’MTT. Questi li usiamo quando vogliamo studiare gli effetti CITOTOSSICI sulle cellule indotti da farmaci o da

sostanze tossiche, altrimenti usiamo il TRIPAN BLU (che è più veloce). Nel caso in cui uno di questi due approcci

interferisse con il farmaco, allora usiamo quello che non interferisce.

SAGGIO MTT (SALE DI TETRAZOLIO) GIALLO. Ci dà una stima delle cellule metabolicamente attive.

 Quando aggiungo il SALE alle cellule, viene ridotto dalle LDH e dalle DEIDROGENASI cellulari (e altre del

complesso primario mitocondriale). Ciò comporta il fatto che le cellule siano vive e viene ridotto a

FRMALZANO (BLU). Il giorno dopo il terreno delle cellule è BLU se le cellule sono vive. Ora sfrutto

l’assorbimento a 570 nm e stacco le cellule e ne misuro l’assorbanza. Con una CURVA DI CALIBRAZIONE

dall’assorbanza, risalgo alle cellule vive in quella precisa fiasca.

SAGGIO SRB (SULFORO D’AMINA) FUXIA. Ci dice il contenuto proteico delle cellule che possono

 

essere VIVE o MORTE. Questo tipo di approccio ci mostra la vitalità cellulare come CONTENUTO

PROTEICO, che ci sono anche nelle cellule morte. La sua vitalità sta nel fatto che, va detto prima

Dopo che ho valutato ad occhio nudo cellule morte e vive, devo assicurarmi che il dato sia confermato

dall’osservazione al microscopio. Successivamente, devo nuovamente confermare mediante lo

SPETTROFOTOMETRO. Se ho delle cellule morte al microscopio, dovrò vedere il terreno giallo (perché non riducono

l’MTT). Al contrario, se vediamo cellule vive al microscopio, queste dovranno essere BLU e vedere l’emissione

specifica allo spettrofotometro. CONGELAMENTO DELLE CELLULE

Se le mie cellule stanno bene, posso portarle avanti e farci uno STOCK, perché se perdessi la mia coltura, almeno ho

una BANCA da dove andarle a prendere e ricominciare l’esperimento. Devo passare le cellule e poi congelarle quando

sono al 50-70% allo stato di confluenza. Quando le congelo, devo stare attento di congelare passaggi bassi e senza che

siano rimaste troppo a lungo in INCUBATORE.

Se andassi a CONGELARE le cellule nel freezer a -80 °C (per bloccare tutte le reazioni metaboliche), sono sicuro che

dopo 2-3 giorni le cellule non ripartono se le scongelo. Se, invece, le mettessi prima in freezer e poi in AZOTO

LIQUIDO (-190 °C) potrebbero partire anche dopo anni.

Le cellule non devono danneggiarsi nel processo di congelamento e si deve formare del GHIACCIO AMORFO e non

CRISTALLINO per non spaccare le cellule.

Per evitare che le membrane possano rompersi, è bene aumentare la quantità di proteina nelle cellule (aumento

ARTEFATTUALE), adoperando una elevata concentrazione di SIERO (sempre quello ricco di fattori di crescita). Devo

aggiungere anche AGENTI CRIOPROTETTIVI, come GLICEROLO (più che altro usato per le cellule batteriche) e

DMSO (per congelare le cellule eucariote). Possiamo aggiungere SIERO 50-90% (a dipendere dalle cellule che devo

conge