Lezioni, Metodologie Biochimiche

Metodologie Biochimiche

• Corso focalizzato su purificazione proteine e metodi di analisi

Ciclo dell'indagine sperimentale:

1. Consultazione della letteratura scientifica e individuazione di un obiettivo
2. Individuazione di uno o più esperimenti
3. Scelta della metodologia
4. Progettazione dell'esperimento e stesura del protocollo
5. Esecuzione dell'esperimento
6. Analisi e interpretazione dettagliata dei risultati
7. Comunicazione e discussione dei risultati
8. Seguiti da nuovi cicli di esperimento

In un esperimento è sempre necessario un controllo positivo e uno negativo (se il controllo positivo riesce e quello negativo no ➔ risultati dell'esperimento sono accettabili) i controlli positivo e negativo permettono la verifica e l'analisi di eventuali errori commessi durante l'esperimento

Soluzioni

1. 1 L di soluzione 50 mM NaCl

P_mNaCl = 58 ➔ 58 g di NaCl corrisponde a 1 mole di NaCl

non preendo 1 litro di acqua, ma 900 ml perchè aggiungendo NaCl liquido sale

• bilancia tecnica → utilizzata per pesare quantità in grammi (precisione 1/10 g)
• bilancia analitica → utilizzata per pesare quantità infieriori (precisione 2 mg)
• navicella → contenitore per pesare polvere NaCl

metto navicella su bilancia tecnica e "taro" la bilancia per quel peso

se devo pesare sostanza chimica volatile tossica devo farlo utilizzando cappa chimica

presi 58 g verso 0,15 l di acqua (misurati con un cilindro in un becker)

l'acqua deve essere purificata (macchinari specifici deionizzano l'acqua ma è possibile un ulteriore purificazione più fine per ottenere acqua pura)

necessario nel becker polvere e mischio utilizzando un agitatore magnetico (per mescolare si utilizza anche il vetrex)

verso dentro un cilindro e aggiungo acqua per arrivare a 1 l

matraccio → usato sempre per misurare volume di una soluzione ma ha solo il segno del volume preciso, non valori intermedi

prodotta soluzione "madre" → NaCl 1 M in 1 L

devo diluirla per ottenere 50 mM NaCl in 1 L ➔ M₁V₁ = M₂V₂

ma per soluzioni a specifico pH, procedura differente ➔

1. scelta tampone in base all'intervallo di interesse
2. necessario prendere il tampone e scioglierlo in un volume minore
3. con pHmetro controllo pH di questo volume e neutralizzo soluzione aggiungendo piccole quantità di acidi o basi (o "pelette")
4. con "HES" porto soluzione (pH fisso) e poi la porto a volume (pH non cambia entro certi limiti di volume)
5. necessario scrivere sia il tipo di tampone utilizzato che le ioni di bilanciamento

altro modo per misurare pH sono le "cartine" immergo cartina in soluzione e confronto colore ottenuto con scala di riferimento

DILUIZIONI SERIALI

Esempio: per studio della cinetica enzimatica (Michaelis-Menten). Per rapporti 1:2 prelevare un volume dalla soluzione madre e aggiungere un ugual volume di solvente.

• Tamponi riproducono artificialmente il pH intracellulare.
• Non devono interagire con l'esperimento (assorbimento di onde fluorescenti).
• Altre sostanze presenti disciolte nel tampone preservano l'enzima in esso contenuto.
• L'attività degli enzimi è influenzata dal pH.

Centrifughe: servono per eliminare dai campioni gli elementi in sospensione facendoli sedimentare.

• Con centrifughe più potenti si separano anche le molecole in soluzione.

Precipitazione: uscita dallo stato di soluzione. Sedimentazione: uscita dallo stato di sospensione.

PURIFICAZIONE PROTEINE

• Per studiare le caratteristiche chimico-fisiche di una proteina la si deve purificare a estrarla da cellula, organo, tessuto, compartimenti cellulari.
• 1. Scelta della fonte.
  2. Distruzione delle cellule e solubilizzazione delle proteine.
  3. Misura delle concentrazioni delle proteine totali e della proteina da purificare (dosaggio). Durante la purificazione la concentrazione della proteina di interesse deve aumentare rispetto alle altre.
  4. Strategia per purificare la proteina.
• La scelta può essere obbligata (es. proteine specifiche per un tessuto) altrimenti scegliere il tessuto che la contiene in concentrazione maggiore (es. emoglobina - globuli rossi).
• Bisogna considerare che una proteina esiste in diverse isoforme in diversi tessuti e le isoforme differiscono nella struttura e hanno proprietà e funzioni differenti.
• Strategia di purificazione: espressione come proteina ricombinante in batterio grazie a plasmide batterico con il gene per quella proteina.
• La distruzione delle cellule deve avvenire in un tampone contenente un antiossidante, degli inibitori delle proteasi, substrati o ligandi o cofattori della proteina (legandola). La stabilizzazione è controllare anche la temperatura per prevenire la denaturazione di alcune proteine - temperatura ambiente.
• Il metodo di rottura è differente per ogni caso.
• • Omoegenizzazione (cellule animali e vegetali) con frullatore o con cilindro dotato di pistone che lacerà (delicatamente) le cellule cresciute in coltura.
  • French press (per lieviti e batteri) cilindro con pistone (ha forza) la sospensione fa passare attraverso un tubicino, sfrutta la differenza di pressione.
• Sonicazione: ultrasuoni prodotti da una sonda che impattano con le cellule facendole esplodere in calice per mantenere bassa temperatura.
• Lisi della parete e shock osmotico (batteri): con lisozima si rompe la parete, in tampone ipotonico, la cellula si gonfia e esplode.
• Congelamento e scongelamento.
• Detergenti che dissolvono la membrana.

2) Cromatografia di adsorbimento

• Cromatografia in cui la fase stazionaria è costituita da molecole idrofobiche (code idrocarburiche o gruppi fenile).
• Sulla superficie (resine) idrofobici, ma tutta proteina circondata da H₂O. Per far interagire fase idrofobiche aggiungo (NH₄)₂SO₄ che fa precipitare le proteine perché sequestra molecole d'acqua e le proteine possono interagire tra loro (→ precipitano).
• Aggiungo un po' di (NH₄)₂SO₄ (non in quantità tale da causare precipitazione) e rimetto campione nella colonna.
• Proteina si attacca alla fase stazionaria, ma non tutte e altre vengono lavate via.
• Per far staccare proteine legate devo effettuare una eluizione.
• Necessario indebolire interazioni idrofobiche → gradiente di (NH₄)₂SO₄
• Deve scendere diminuendo concentrazione, la proteina si stacca.
• Nuovo frazionamento e poi elettroforesi di frazione a mia scelta.

3) Cromatografia ad esclusione molecolare o gel filtrazione

• In questo tipo di cromatografia separazione proteine avviene in base alle loro dimensioni.
• Il supporto è costituito da polimeri polisaccaridici insolubili → particelle gelatinose secche assorbono il tampone e diventano gelatinose.
• Proteine che riescono a attraversare le "maglie" di questo gel faranno un percorso accidentato.
• Proteine più grandi invece non passeranno attraverso le particelle ma le aggirano → proteine più grandi vanno più veloci rispetto a quelle più piccole.
• Le proteine che passano all'esterno escono tutte quante insieme anche se hanno dimensioni differenti: le proteine più piccole invece subiscono un rallentamento proporzionale alla loro dimensione e formano "non escono insieme".
• Proteina secche con bastoncella (anche qui stesso fattore) si comportano in modo diverso.

Formula Equazione:

V_t = V_x + V_o

V_o ≈ 0,35 V_t (circa 1/3)

Volume totale - Volume separato dal gel - Volume escluso (o "vuoto")

V_e/V_o -> eluzione relativa

• Volume eluizione dipende dalla lunghezza della colonna cromatografica (normalizzato il volume di eluizione dividendo per il volume vuoto della mia colonna → volume eluizione relativo (caratteristico della proteina).
• Le proteine di stesse dimensioni escono sempre insieme.
• Se proteine hanno PM molto alta il volume di eluizione sarà pari a 1.0 (appunto V_e/V_o = 1).
• Molto importante anche la selezione di materiali per la gel filtrazione (il substrato deve avere un intervallo di filtrazione adatto).
• Se non conosco peso molecolare di una proteina posso determinarlo mediante curva di calibrazione tra V_e/V_o e log M_w.
• Attraverso tale cromatografia è possibile determinare anche il numero di subunità di una struttura quaternaria.