Lezioni, Metodologie Biochimiche

Metodologie Biochimiche

• Corso focalizzato su purificazione proteine e metodi di analisi

Ciclo dell'indagine sperimentale:

1. Consultazione della letteratura scientifica e individuazione di un obiettivo
2. Individuazione di uno o più esperimenti
3. Scelta della metodologia
4. Progettazione dell'esperimento e stesura del protocollo
5. Esecuzione dell'esperimento
6. Interpretazione dell'esperimento
7. Comunicazione e discussione dei risultati
8. Se si ricomincia

In un esperimento, sempre necessario un controllo positivo e uno negativo

• Se il controllo positivo riesce e quello negativo no ⟶ risultati esperimento sono accettabili
• Controllo positivo e negativo permettono la verifica e l'analisi di eventuali errori commessi durante l'esperimento

Soluzioni

1 L di soluzione 50 mM NaCl

• Pmolecolare = 58 ⟶ 58 g di NaCl corrisponde a 1 mole di NaCl
• Non prendendo 1 L d'acqua ma 900 ml perché aggiungendo NaCl liquido sale
• Bilancia tecnica: utilizzata per pesare quantità in grammi (precisione 1/10 g) Bilancia analitica: utilizzata per pesare quantità inferiori (precisione 2 mg)
• Navicella: contenitore dove versare polvere NaCl

Metto navicella su bilancia tecnica e "taro" la bilancia per quel peso

1. Se devo pesare sostanza chimica volatile tossica devo farlo utilizzando cappa chimica
2. Presi 58 g verso 0,9 L di acqua (misurati con un cilindro in un Becker)

L'acqua deve essere purificata (macchinari specifici). Deionizzazione l'acqua ma è possibile un ulteriore purificazione per fine per ottenere acqua pura

• Nel Becker polvere e miscuglio utilizzando un agitatore magnetico (per mescolare si utilizza anche il vortex)

Verso dentro il cilindro e aggiungo acqua per arrivare a 1 L

• Matraccio: usato sempre per misurare volume di una soluzione ma ha solo il segno del volume preciso, non valori intermedi
• Prodotta soluzione "madre" NaCl 1 M in 1 L
• Devo diluirla per ottenere 50 mM NaCl in 1 L ⟶ M₁V₁ = M₂V₂

Ma per soluzioni a specifico pH procedura differente

• Scelta tampone in base all'intervallo di interesse
• Necessario prendere il tampone e scioglierlo in volume minore
• Con pHmetro controllo pH di questo volume e neutralizzo soluzione aggiungendo piccole quantità di acidi o basi (= "pellet")
• Con "mesh" porto soluzione (pH e poi la porto a volume (pH non cambia entro certi limiti volume)
• Necessario scrivere sia il tipo di tampone utilizzato che lo ione di bilanciamento
• Altro modo per misurare pH sono le "cartine immergo cartina in soluzione e confronto colore ottenuto con scala di riferimento

METODOLOGIE BIOCHIMICHE

• CORSO FOCALIZZATO SU PURIFICAZIONE PROTEINE E METODI DI ANALISI

CICLO DELL'INDAGINE SPERIMENTALE:

1. CONSULTAZIONE DELLA LETTERATURA SCIENTIFICA E INDIVIDUAZIONE DI UN OBIETTIVO
2. INDIVIDUAZIONE DI UNO O PIÙ ESPERIMENTI
3. SCELTA DELLA METODOLOGIA
4. PROGETTAZIONE DELL'ESPERIMENTO E STESURA DEL PROTOCOLLO
5. ESECUZIONE DELL'ESPERIMENTO
6. INTERPRETAZIONE DELL'ESPERIMENTO
7. COMUNICAZIONE E DISCUSSIONE DEI RISULTATI IN SEDI RICONOSCIUTE

• IN UN ESPERIMENTO SEMPRE NECESSARIO UN CONTROLLO POSITIVO E UNO NEGATIVO
• SE IL CONTROLLO POSITIVO RIESCE E QUELLO NEGATIVO NO RISULTATI POSSONO ESSERE ACCETTABILI
• CONTROLLO POSITIVO E NEGATIVO PERMETTONO LA VERIFICA E L'ANALISI DI EVENTUALI ERRORI COMMESSI DURANTE L'ESPERIMENTO

SOLUZIONI

• 1 L DI SOLUZIONE 50 mM NaCl

1. NaCl = 58 g 58 g NaCl CORRISPONDE A 1 mole DI NaCl
2. NON PRENDO 1 L D'ACQUA MA 900 ml PERCHÉ AGGIUNGENDO NaCl LIQUIDO SALE
3. BILANCIA TECNICA: UTILIZZATA PER PESARE QUANTITÀ IN GRAMMI (PRECISIONE 1/10 g)
4. BILANCIA ANALITICA: UTILIZZATA PER PESARE QUANTITÀ INFERIORI (PRECISIONE 1/2 mg)
5. NAVICELLA: CONTENITORE PER VERSARE POLVERE NaCl

1. METTO NAVICELLA SU BILANCIA TECNICA E "TARO" LA BILANCIA PER QUEL PESO
2. SE DEVO PESARE SOSTANZA CHIMICA VOLATILE TOSSICA DEVO FARLO UTILIZZANDO CAPPA CHIMICA (PRESO 58 g VERSO 0,9 L DI ACQUA) (MISURATI CON UN CILINDRO IN UN BECKER)
3. L'ACQUA DEVE ESSERE PURIFICATA DA MACCHINARI SPECIFICI DEIONIZZATA L'ACQUA MA E' POSSIBILE UN ULTERIORE PURIFICAZIONE PIÙ FINE PER OTTENERE ACQUA PURA
4. VERSO NEL BECKER POLVERE E MISCLO UTILIZZANDO UN AGITATORE MAGNETICO (PER MESCOALRE SI UTILIZZA ANCHE IL VORTEX)
5. VERSO DENTRO UN CILINDRO E AGGIUNGO ACQUA PER ARRIVARE A 1 L

• MATARRACCIO: USATO SEMPRE PER MISURARE VOLUME DI UNA SOLUZIONE MA HA SOLO IL SEGNO DEL VOLUME PRECISO, NON VALORI INTERMEDI
• PRODUZIONE SOLUZIONE "MADRE" NaCl 1 M IN 1 L DEVO DILUIRLA PER OTTENERE 50 mM NaCl (M₁V₁ = M₂V₂)
• MA PER SOLUZIONI A SPECIFICO pH PROCEDURA DIFFERENTE
• SCELTA TAMPONE IN BASE ALL'INTERVALLO DI INT