Metodologie biochimiche e biomolecolari - riassunto completo + esercitazioni

METODOLOGIE BIOCHIMICHE E BIOMOLECOLARI

1. Metodi e quantificazione delle proteine

La rilevazione di determinate proteine permette di riconoscere marcatori di qualità. Indicatori di provenienza, di

trasformabilità, di trattamento e di sicurezza d’uso.

I metodi considerati hanno l’obiettivo di caratterizzare le proteine da molti punti di vista, sfruttando proprietà

specifiche:

attività biologica

 riconoscimento immunologico

 carica

 anfifilicità

 dimensioni

 solubilità

 accessibilità a proteasi



L’attività biologica si applica ad un enzima. Tutte le restanti proprietà invece si possono applicare a qualsiasi

proteina.

I principi dei metodi analitici trattati comprendono:

metodi che evidenziano la presenza / assenza delle proteine

 aspetto condotto fornendo informazioni qualitative o quantitative.

metodi che evidenziano modificazioni delle proteine

 a. compositive (es. dei gruppi -R come glicazioni, perdita gruppo tiolico cisteina)

b. strutturali (es.. perdita struttura secondaria)

c. proprietà funzionali (es. attività catalitica negli enzimi)

i metodi possono essere raggruppati in tre sulla base del principio su cui si basano:

1. chimici

Kjeldahl, basato sul contenuto di azoto

2. spettroscopici

assorbimento UV o NIR, sono basati su misure di proprietà degli amminoacidi nelle proteine

3. colorimetrici

basati sulla determinazione dell’assorbanza di composti colorati ottenuti dall’interazione con proteina

- coloranti (es. Bradford)

- riduzione / complessazione metalli (es. BCA)

- ione rame (es. Biureto)

metodo KJELDAHL

È un metodo che determina azoto in modo poco selettivo, per cui può derivare da proteine, peptidi, acidi nucleici

ed è quindi sensibile a contaminazioni.

È un metodo ufficiale, ma laborioso e con risultati dipendenti dal materiale in esame.

Es. contaminazione con esametilentetrammina in latte di origine cinese. Con questo metodo il latte sembrava

iperproteico

METODI SPETTROSCOPICI

Si basano sulla misurazione dell’assorbanza nella zona UV

per misure dirette, vicino infrarosso, o della zona visibile

per misure di composti colorati determinati dall’interazione

proteina con specifiche molecole.

Principi teorici metodi spettroscopici:

a) la trasmittanza dipende dal rapporto tra luce

trasmessa (I) e luce incidente (Io) e dipende dalla

concentrazione campionaria e spessore.

È collegata con relazione logaritmica all’assorbanza. ( )

I 0

=I /I

T ( )=log

A=−log T

0 I

b) la trasmittanza è un’iperbole, ossia diminuisce all’aumentare della concentrazione proteica in modo non lineare,

mentre l’assorbanza aumenta linearmente con la concentrazione proteica.

c) Legge di Lambert Beer

permette la determinazione della concentrazione a partire dall’assorbanza

A=εcL

determinata.

C = concentrazione proteina, la cui unità di misura dipende dalle

dimensioni del coefficiente di estinzione della proteina (M o mg/ml)

L = passo ottico della cuvetta, normalmente 1cm -1

= coefficiente di estinzione molare specifico per ogni proteina, espresso come mol o (mg/ml)



Partendo dall’assorbanza di specifici amminoacidi aromatici (triptofano, tirosina, fenilalanina) si nota il massimo

d’assorbanza ad UV 280nm e i coefficienti di assorbanza sono definiti a questa lunghezza d’onda. Maggiore è il

contenuto in aa aromatici e maggiore è il coefficiente .

( ) ( )

= ∗ε + ∗ε +(n° ∗ε ) 0.1 %

ε n ° n ° =ε /

ε MW

proteina tyrosina tyr triptofano trp cisteina cys prot

La determinazione della concentrazione di una proteina mediante misura dell’assorbanza a 280nm è una misura

precisa, accurata, veloce, non distruttiva (il campione si può recuperare e riutilizzare).

Tuttavia questa tecnica richiede soluzioni limpide e proteine purificate (impiegando il coeff di estinzione).

Con una miscela di proteine posso solo fornire informazioni sulla presenza o assenza di proteine.

METODI COLORIMETRICI

Si basano sull’interazione tra gruppi o regioni di proteine con specifici composti, generando complessi colorati.

Un cromoforo è una sostanza colorata che assorbe una o più lunghezze d’onda, in modo proporzionale al numero

di legami coniugati e grandezza della molecola.

Biureto

 Forma, in ambiente alcalino, un complesso blu-porpora, con massimo di assorbanza a 540nm, tra ione rame (II)

e gruppi coinvolti nel legame peptidico.

Il reattivo è una soluzione alcalina di solfato di rame con tartato di sodio e potassio.

Non applicabile in presenza di basi azotate (es. urea, tampone TRIS-base)

È un metodo selettivo e poco sensibile.

BCA

 Si forma, in opportune condizioni, un complesso blu, con massimo di assorbanza a 560nm, tra proteina e rame

ridotto (I), generato da rame ossidato (II).

Non è applicabile in presenza di basi azotate.

Metodo Bradford

 Il metodo si basa sull’interazione tra il colorante Coomassie Brillant Blue, con massimo di assorbanza a 465nm,

e una proteina con la formazione di un complesso avente massimo di assorbanza a 595nm.

Il complesso è stabilizzato da interazioni elettrostatiche e idrofobiche e pertanto varia con la composizione

amminoacidica della proteina.

Il metodo può non funzionare nel caso di proteine piccole o poco idrofobiche o molto acide.

la proteina da utilizzare come standard deve presentare una distribuzione amminoacidica il più

possibile simile a quella delle proteine che si vogliono quantificare.

Gli interferenti, cui il metodo Bradford è insensibile sono gli agenti chelanti (es. EDTA), composti attivi dal

punto di vista redox, denaturanti (es. urea), mentre è sensibile a triton X100 e sodio dodecil solfato

(SDS).

Questo metodo è preciso, non sempre accurato, distruttivo, non necessita di soluzioni estremamente

pulite e può quantificare miscele proteiche, però risente di interferenti della formazione del complesso.

NIR

Metodo spettroscopico industriale.

Lunghezze d’onda tra 2500 e 20000 nm, l’interazione con la radiazione elettromagnetica provoca transizioni

vibrazionali: cambia l’energia della vibrazione di due o più atomi

legati (es.: O-H, N-H, C-H, C=O, C-O, ecc.)

- Consente di ottenere l’“impronta digitale di un composto”

- condotto sia in assorbanza che in riflettanza

- Consente la misura diretta su campioni solidi, liquidi

- Consente la misura simultanea di più famiglie di analiti

(umidità, lipidi, carboidrati)

- Margine di errore ampio

- Valido per screening/accettazione/standardizzazione grossolana

Utilizzo nell’analisi del latte

Grasso

 Due lunghezze d’onda sono utilizzate, definendo:

- grasso A

assorbimento per vibrazione del legame C=O, che permette la conta del numero di molecole di grasso

- grasso B

assorbimento per vibrazione del legame C-H, che definisce sia il numero di molecole che la loro

dimensione.

Lattosio

 Disaccaride il cui assorbimento è legato al legame C-OH

Proteine

 L’assorbimento è dovuto alle vibrazioni nei legami N-H dei legami peptidici

ETSRATTO ARTICOLO

Sono stati adattati i metodi spettrofotometrici e fluorimetrici per la quantificazione dei parametri relativi alla

qualità della farina di frumento come il contenuto di gliadina (GLIA), glutenina (GLUT) e macropolimero di glutenina

(GMP).

Sono stati studiati il test dell'acido bicinchoninico (BCA), il test Bradford, il test fluorescenza, il test Naphthol Blue

Black (NBB) e il test acido arancione 12.

Tra i test studiati, solo i test Bradford, fluorescamina e NBB hanno fornito risultati utili.

Il saggio Bradford ha avuto successo nel quantificare le frazioni GLIA e GLUT, ma non era adatto per la frazione

GMP a causa della presenza di SDS.

Tutte le frazioni proteiche rilevanti potrebbero essere quantificate con i dosaggi di fluorescamina e NBB.

Mentre il primo mostrava coefficienti di variazione più elevati, il dosaggio NBB era più affidabile.

I dati NBB e HPLC, nonché i dati NBB e i test di cottura micro-scala sono stati fortemente correlati.

Il dosaggio NBB è una buona alternativa ai metodi cromatografici, che richiedono tempo e attrezzature sofisticate.

Può essere adattato come metodo facile da usare e ad alto rendimento che consente lo screening di un gran

numero di campioni di farina per parametri di qualità in breve tempo per campione.

4. Conclusioni

Il presente studio ha dimostrato che il dosaggio NBB è adatto per la rapida quantificazione delle concentrazioni di

GLIA, GLUT e GMP nella farina di frumento. Questi parametri di qualità possono essere utilizzati per prevedere le

prestazioni di cottura. Il saggio sembra essere una buona alternativa ai metodi RP e GP-HPLC, che richiedono

tempo e attrezzature sofisticate. Sarebbe quindi un metodo adatto per l'assicurazione della qualità nei laboratori di

fresatura. Il dosaggio NBB può essere adattato come metodo ad alto rendimento che consente lo screening di un

gran numero di campioni di farina in breve tempo per campione. Ciò sarebbe particolarmente utile nei programmi

di riproduzione, in cui è necessario analizzare un numero elevato di linee. Il dosaggio della fluorescamina avrebbe

anche un potenziale come metodo di screening a causa del suo tempo di analisi ancora più breve e dei costi dei

materiali più economici rispetto al dosaggio NBB, ma sarebbe necessaria un'ulteriore ottimizzazione del metodo

per una migliore riproducibilità.

1. introduzione

Gli spettrofotometri potrebbero essere utilizzati per determinare i contenuti di GLIA, GLUT e GMP come parametri

relativi alla qualità della farina di frumento, se fossero disponibili metodi spettrofotometrici adeguati per la

quantificazione.

Wieser (2000) ha riportato un approccio che utilizza la turbi-dimetria per quantificare le frazioni GLIA e GLUT in uno

spettrofotometro. Lo svantaggio principale di questo metodo era che i precipitati richiedevano il controllo esatto

della temperatura nel fotometro per ottenere letture riproducibili.

I metodi spettrofotometrici e fluorimetrici per la quantificazione delle proteine includono il test dell'acido

bicinchoninico (BCA) (Smith et al., 1985; Sorensen e Brodbeck, 1986), il test Bradford (Bradford, 1976), il test

fluorescenza (Udenfriend et al., 1972; Lorenzen e Kennedy, 1993) e il saggio Naphthol Blue Black (NBB) (Schaffner

e Weissmann, 1973). Un saggio che utilizza acido arancione 12 (Udy, 1954) è stato approvato dall'American

Association of Cereal Chemists International (2000) come metodo n. 46-14.02 per determinare il contenuto

proteico grezzo della farina di frumento.

Rosell et al. (2013) sono stati i primi a descrivere l'uso del test BCA per determinare il contenuto di proteine del

grano nell'1,5% di SDS. Nel test BCA, gli ioni Cu2þ sono ridotti dalle catene laterali di aminoacidi delle proteine

(cisteina, triptofano e tirosina) che producono un complesso viola tra Cuþ e due molecole BCA, con una massima

assorbanza a 562 nm. Il saggio Bradford utilizza Coomassie Brilliant Blue G-250, che si lega a catene laterali

caricate positivamente delle proteine a basso pH causando uno spostamento dell'assorbimento da 465 a 595 nm.

Questo composto forma legami covalenti con gruppi amminici primari delle proteine che producono un derivato

fluorescente di pirrolidone in un tempo molto breve

Paragonabile a Coomassie Brilliant Blue, il colorante NBB interagisce con catene laterali di aminoacidi caricate

positivamente delle proteine a basso pH. Contrariamente al metodo Bradford, il complesso proteico NBB precipita.

Il complesso è nuovamente dissolto dopo l'isolamento e il lavaggio aumentando il valore del pH.

La quantità di NBB liberato è proporzionale alla concentrazione proteica e può essere misurata

spettrofotometricamente a 620 nm.

L'acido arancione 12 è un colorante specifico per proteine che forma un complesso ionico insolubile con catene

laterali di aminoacidi basiche delle proteine. La quantità di colorante non legato (assorbimento a 480 nm) è

inversamente correlata alla quantità di proteine nel campione (Udy, 1954).

Complessivamente, i dosaggi e i coloranti sopra menzionati reagiscono in modo diverso con le proteine. Pertanto,

la composizione aminoacidica di una proteina è una proprietà importante e determina la risposta di un colorante

con una data proteina. Wieser et al. (1983) hanno dimostrato che GLUT contiene quasi il doppio della quantità di

catene laterali caricate positivamente rispetto a GLIA. Ciò significa che è necessaria un'adeguata calibrazione per

ottenere concentrazioni proteiche affidabili. Pertanto, la rispettiva frazione proteica stessa sembra essere il miglior

riferimento per la calibrazione. Di conseguenza, adeguate proteine di riferimento o frazioni proteiche devono

essere preparate in quantità sufficienti come parte dello sviluppo del metodo.

Lo scopo di questo studio era di sviluppare metodi facili da usare per valutare i parametri di farina di grano basati

sulla proteina e sulla qualità basati su spettrofotometria o fluorimetria. È necessario determinare i parametri GLIA,

GLUT e GMP. I nuovi metodi dovrebbero mostrare almeno una pari correlazione con le prestazioni di cottura rispetto

ai metodi cromatografici utilizzati finora. I punti cruciali erano la fattibilità semplice e rapida e la disponibilità di

proteine di riferimento adatte per una corretta calibrazione.

2. Materiali e metodi

2.1. Campioni di grano

I cereali venivano macinati in farina con un mulino Quadrumat Junior (Bra-bender, Duisburg, Germania). La farina è

stata setacciata (dimensione della maglia 0,2 mm) e lasciata riposare per due settimane prima dell'uso. Sono stati

determinati i contenuti di umidità, cenere e proteine (N 5,7) secondo gli standard ICC 110, 104 e 167 (1978a, b, c),

rispettivamente. Il contenuto di umidità variava dal 13,9 al 15,4%, il contenuto di ceneri dallo 0,42 allo 0,59% e il

contenuto di proteine dal 7,6 all'11,6%. Tutti i dati sulla concentrazione sono forniti "così come sono".

2.2. Sostanze chimiche

La qualità di tutte le sostanze chimiche era "pro analysi" o dichiarata diversamente.

Acetone (LiChrosolv), acetonitrile (ACN) (LiChrosolv), acido L-tre-ascorbico, Coomassie Brilliant Blue G-250, acido

sodio-genofosfato diidrato, etanolo, acido acetico glaciale (100%), acido hy-drochloric (32% , p / p), metanolo,

acido o-fosforico (85%, p / p), acido ossalico diidrato, pentano, diidrogenofosfato di potassio, 1-propanolo, acido

propionico, cloruro di sodio, dodecil solfato di sodio (SDS), tris (idrossimetil) -ammino-metano (TRIS) e urea

provenivano da VWR Merck (Darmstadt, Germania). Arancio acido 12, fluorescamina (Fluram®), Naphthol Blue

Black 10B (NBB), kit acido bicinchoninico per la determinazione delle proteine (BCA1) (incluso riferimento

all'albumina sierica bovina), boroidruro di sodio, idrossido di sodio (98%), acido trifluoroacetico (TFA,98) e Tris (2-

carbossietil) fosfina cloridrato (TCEP) sono stati forniti da SigmaeAldrich (Steinheim, Germania). Il ditio-treitolo

(DTT) era di Serva (Heidelberg, Germania), acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) di Leco (Moenchengladbach,

Germania), fecola di patate di Carl Roth (Karlsruhe, Germania) e lievito di panetteria (fresco, compresso) di

Wieninger Hefe (Passavia, Germania). L'acqua è stata deionizzata da un sistema di purificazione dell'acqua Arium

611VF (Sartorius, Gottinga, Germania).

2.3. Solventi di estrazione

Per l'estrazione sono stati utilizzati i seguenti solventi: (A) NaCl 0,4 mol / L / Na2HPO 4 / KH2PO4 0,067 mol / L (pH

7,6); (B) 60% (v / v) etanolo; (C) 50% (v / v) 1-propanolo / urea 2 mol / L / TRIS-HCl 0,05 mol / L (pH 7,5) / 1% (p / v)

DTT sotto azoto; (D) 50% (v / v) 1-propanolo / Na2HPO4 / KH2PO4 0,05 mol / L (pH 7,5) / 1% (p / v) DTT sotto azoto;

(E) 50% (v / v) 1-propanolo / Na2HPO4 / KH2PO4 0,05 mol / L (pH 7,5) / 1% (p / v) TCEP sotto azoto; (F) 50% (v / v)

1-propanolo / Na2HPO4 / KH2PO4 0,05 mol / L (pH 7,5) / 1% (p / v) NaBH4 sotto azoto; (G) 1% (p / v) SDS /

NaH2PO4 0,05 mol / L (pH 6,9).

2.4. Estrazione analitica delle frazioni proteiche

2.4.1. Frazioni GLIA e GLUT

La farina (100 mg) è stata estratta in sequenza con solvente (A) (2 1,0 mL) per 10 minuti a temperatura ambiente

(RT, circa 22 ° C) (frazione di albu-min / globulina, scartata), con solvente (B) (3) 0,5 mL) per 10 minuti a

temperatura ambiente (GLIA) e con solvente (C) (2 1,0 mL) per 30 minuti a

60 C sotto azoto (GLUT) (Wieser et al., 1998). Ogni fase di estrazione è stata iniziata con vortice per 2 minuti e ha

continuato con l'agitazione magnetica. Nell'estrazione della soluzione GLUT per il dosaggio della fluorescamina il

solvente (C) è stato sostituito dal solvente (D). Il

le sospensioni sono state quindi centrifugate per 20 minuti a 3750 ge RT (Heraeus Multifuge 3L-R; Thermo Fisher

Scientific, Dreieich, Ger-many). I supernatanti corrispondenti (GLIA, GLUT, rispettivamente) sono stati combinati,

diluiti a 2,0 mL con il rispettivo solvente e filtrati attraverso una membrana da 0,45 mm. Per ogni campione di

farina sono stati effettuati almeno tre esperimenti di estrazione separati.

2.4.2. Frazioni SDS-solubili (SDSS) e GMP

La farina (100 mg) è stata estratta in sequenza con solvente (G) (2 1,0 mL) per 30 minuti a temperatura ambiente

(SDSS) e con solvente (D) (2 1,0 mL) per 30 minuti a 60 ° C sotto azoto (GMP). Ogni fase di estrazione è stata

iniziata con vortice per 2 minuti e ha continuato con l'agitazione magnetica. Le sospensioni erano

centrifugato per 25 minuti a 3750 ge RT. I corrispondenti pernatanti sono stati combinati, diluiti a 5,0 mL (SDSS) e

2,0 mL (GMP) con i rispettivi solventi e filtrati attraverso una membrana da 0,45 mm. Per ogni campione di farina

sono stati effettuati almeno tre esperimenti di estrazione separati. Per la quantificazione di GMP con il dosaggio