Metodologie biochimiche e biomolecolari - riassunto completo + esercitazioni

CROMATOGRAFIA AD AFFINITÀ

Se una proteina non ha affinità per la resina, posso attaccare una coda specifica (es. imidazolo che ha residui di istidina) per fare in modo che abbia affinità. La proteina A Agarose si lega alla regione Fc di IgG da una varietà di specie. Può essere usato per purificare classi, sottoclassi e frammenti di immunoglobuline, nonché per l'isolamento di complessi immunitari. Ha trovato impiego nella ricerca biochimica grazie alla sua capacità di legare le immunoglobuline. Ha cinque domini, ognuno in grado di legare le proteine di molte specie di mammiferi, in particolare le IgG. La proteina G agarosio si lega alla porzione Fc di immunoglobuline (Igs) di varie specie; utile per legarsi alle Ig che non reagiscono bene con la proteina A. Può essere usato per la procedura di immunoprecipitazione anticorpale e per purificare immunoglobuline e frazioni di IgG. Ha trovato applicazione nella purificazione degli anticorpi.

Attraverso il suo legame con la regione Fab e Fc.

CROMATOGRAFIA A FASE INVERSA

Utilizza una fase stazionaria più idrofobica della cromatografia per interazione idrofobica.

La scelta della lunghezza delle code idrofobiche nella resina variano in base all'idrofobicità della proteina di interesse (C18 + idrofobico di C4).

L'interazione idrofobica tra campione e fase stazionaria avviene senza bisogno di utilizzare alta forza ionica (si usa però acido trifluoroacetico 0.1% che facilita l'interazione).

Per eluire il campione si utilizzano fase mobili non polari (solventi organici come l'acetonitrile o il metanolo).

Le proteine si denaturano!

Molto utilizzata per separare peptidi.

3. elettroforesi

Queste tecniche permettono di separare le proteine in base alle dimensioni o alla carica applicando un campo elettrico.

La forza cui è sottoposta la proteina nel campo elettrico dipende dall'intensità del campo elettrico e dalla carica della

proteina. Alla forza si oppone una forza frizionale che dipende dalle dimensioni e forma della molecola e dimensioni dei pori del gel. L'elettroforesi può essere condotta in condizioni native o denaturanti, ossia in presenza di urea o SDS. Il mezzo fluido è un gel, composto da una macromolecola molto idrofilica che trattiene l'acqua. - Di agarosio: forma un gel reversibile stabilizzato da legami H (polimero lineare di D-galattosio e 3.6-anidro-L-galattosio), molto usato per separare molecole di grandi dimensioni come il DNA. - Di poliacrilammide: ottenuto per polimerizzazione radicalica irreversibile di catene lineari di acrilammide, cross-linkate da molecole di bis-acrilammide, molto usato per separare le proteine. Il legame che si forma è covalente e si usa il perosolfato come catalizzatore. Cambiando le proporzioni e le concentrazioni dei reagenti (o il tampone in cui sono sciolti) si può variare sia la porosità del gel, che il pH. Piùacrilammide è presente e più le maglie del gel saranno strette e quindi maggiori saranno le forze frizionali. Tipi di elettroforesi Page nativa L'enzima conserva le sue funzionalità, vengono conservate le strutture quaternarie, senza pre-trattamento. La separazione avviene principalmente in base alla carica, che dipende dal pH del mezzo fluido e dal punto isoelettrico delle proteine. Le proteine con pH acido sono cariche negativamente e si muovono verso l'anodo (carico positivamente che attira anioni) più velocemente se più carica. Visto che anche la massa/forma incide sulla velocità di migrazione, minore è la molecola e meno ingombrante la forma e maggiore è la velocità. A parità di carica si separa in base alla massa. Lo svantaggio è legato al fatto che non si capisce se la corsa è legata alla carica o alla dimensione/forma. SDS (sodio dodecil-solfato) page Le proteine subiscono un

pre-trattamento e perde la sua struttura. La separazione avviene in base alle dimensioni poiché le proteine, per il SDS, sono cariche negativamente.

Il sodio dodecil-solfato è un tensioattivo, formato da una catena alifatica di 12 C, con un gruppo SO ad una estremità, che forma un legame con Na. La proteina viene denaturata con un trattamento termico e alle regioni idrofobiche si legano le code idrofobiche dell'SDS, in numero proporzionale alla dimensione della proteina.

Se le sub-unità di una proteina sono legate tramite ponti S-S che vanno rotti attraverso un riducente, come il β-mercaptoetanolo.

Si assegnano i pesi molecolari alle bande separate caricando proteine con peso molecolare noto, che servono come marker.

Le proteine vanno colorate per visualizzarle in gel:

• Coomassie R-250 - 3-4 ore di trattamento. Non è molto sensibile e quindi se una proteina è molto piccola rischio di non colorarla.
• Silver stain - 20-100 volte più sensibile

del coomassie, ma è molto laborioso e lungo come processo. Se le proteine hanno uguale pm SDS page è inutile. Gel di separazione: - stacking gel (gel di impaccamento): è la parte superiore del gel e la sua funzione è quella di concentrare il campione proteico, in modo che tutti i campioni comincino la loro migrazione dallo stesso punto di partenza sotto forma di "righe" sottili. - running gel (o gel di separazione): è la parte inferiore e la sua funzione è quella di separare le proteine dei vari campioni sulla base del loro peso molecolare. È composto dagli stessi componenti polimerici dello stacking gel, ma in quantità diverse: concentrazioni maggiori di acrilammide portano a pori di dimensioni minori. Anche il tampone è diverso. Ogni proteina, al termine dell'elettroforesi, ha percorso nel gel di separazione una distanza inversamente proporzionale al logaritmo del suo peso molecolare, valore che si puòcalcolare in grafico per confronto con le distanze percorse dalle proteine a peso molecolare noto. Esempi di applicazione di SD-page: a. identificazione materie prime basata sulla presenza di proteine specifiche per una specie o sottospecie b. riconoscimento di eventi proteolitici monitorando il decorso della proteolisi, identificando anche le proteine bersaglio delle proteasi c. formazione di nuove specie in conseguenza di processi SDS PAGE in assenza di riducenti consente di evidenziare la formazione di aggregati stabilizzati da ponti disolfuro. L'utilizzo di colorazioni specifiche consente di evidenziare possibili modificazioni chimiche del materiale, quali la glicazione. Iso-elettro-focalizzazione La separazione avviene in un gel nel quale è stato creato un gradiente di pH, in funzione del punto isoelettrico. Le proteine migrano fino a che raggiungono la zona di gel nel quale il pH è uguale al loro pI. Si utilizzano gel a bassa concentrazione di acrilammide per minimizzare.

le forze frizionali. I vantaggi sono alta risoluzione e sensibilità elevata, mentre gli svantaggi sono costi elevati e grande manualità. Nel gel viene creato un gradiente di pH sfruttando anfoline e si utilizza un gel di agarosio con maglie larghe per minimizzare le forze frizionali. Le anfoline sono acidi alifatici poliammino policarbossilici, ossia piccoli polimeri con grande eterogeneità di punto isoelettrico, dotati di alto potere tamponante. Prima di caricare e separare le proteine si caricano le anfoline, si applica il campo elettrico e le anfoline basiche andranno verso il polo negativo e quelle acide andranno verso il polo positivo. Il pH sarà una media dei punti isoelettrici delle anfoline. Questa tecnica separa bene proteine con peso uguale ma con diverso peso isoelettrico. Es. in mozzarella di bufala valuto la presenza di gamma-2-caseina tipici di latte bovino. Se non ci sono frammenti non c'è una frode. I gel già formati contengono

immobiline e non anfoline, poiché queste formano legami covalenti con acrilammide, stabilizzando il gradiente di pH per più tempo. Elettroforesi capillare

• la separazione avviene, basandosi sulla dimensione del rapporto di carica, all'interno di un piccolo capillare di silice fusa rivestito di poliimide (lunghezza 15-100cm e diametro interno 25-100 um), riempito con un elettrolita.
• Il flusso di cationi elevato (6-30 kV) trascina anche il solvente, detto flusso elettro-endo-osmotico.
• Tutte le molecole cariche positivamente sono anche attratte da catodo e sono accelerate, mentre quelle cariche negativamente sono rallentate.
• Un detector prima del catodo crea un cromatogramma.

I vantaggi:

• buona efficienza separativa
• richiesta di piccole quantità di campione (1-10 ul)
• la separazione rapida (da pochi minuti a 45 minuti massimo)
• ripetibilità e riproducibilità, possibilità di fare analisi quantitative.
• Possibilità di interfaccia con

1. spettrometro di massa- Ridotto consumo di reagenti e nessun utilizzo di solventi
2. Svantaggi- difficoltà nell'interpretazione dei risultati (complicato capire un picco a quale proteine corrisponde)- difficoltà nella reperibilità di standard di riferimento- elevato costo

Western blotting

• Trasferisce la separazione elettroforetica su una stampa che mi permette di identificare ulteriormente una specifica proteina nella miscela.
• Rende disponibile una proteina in una miscela di proteine, dopo separazione per elettroforesi (in genere SDS-page) per ulteriore identificazione.
• La separazione elettroforetica viene trasferita su una membrana, evidenziando con colorazione rosso Ponceau, che viene impiegata per le determinazioni successive.
• È un metodo che usa anticorpo primario e secondario quindi a seguito di quello elettroforetico, è immunochimico.

Informazioni che fornisce sono:

• Presenza/assenza di una proteina specifica tra quelle separate (es. identificazione)

con anticorpi)- Identificazione proteina con attività enzimatica (es. misura dell'attività)- Identificazione proteina con modificazione post-traduzionali (es. glicosilate)Non è un metodo facilmente automatizzabile, è molto sensibile ed è semi-quantitativa.Le membrane usate sono di nitrocellulosa o PVDF (poly-vinyl-dene), caratterizzate da una diversa porosità epresentano caratteristiche per consentire l'adesione delle proteine per interazioni idrofobiche.2D elettroforesi Combinazione di iso-elettro-focalizzazione e SDS-page.Si opera prima l'iso-elettro-focalizzazione e successivamente prendo il gel usato e lo tratto con SDS.Dopodiché appoggio fisicamente il gel su un gel per l'SDS-page e applico un campo elettrico con l'anodo(positivo) rivolto verso l'SDS-page (parte inferiore).Le proteine si separeranno, dall'alto verso il basso, in base alla massa.