Metodi per l'ingegneria proteica - corso completo

PROTEICHE

Risonanza magnetica nucleare (NMR)

Così come per la cristallografia, questa tecnica è stata sviluppata inizialmente per le piccole molecole e poi è stata traslata anche per lo studio della struttura della proteina. Per struttura si intende come sono disposti gli atomi in termini di distanze ed angoli di legame; pertanto, determinare la struttura significa creare un modello che, basandosi su dati sperimentali, si avvicina il più possibile alla realtà.

È una tecnica analitica che permette di ottenere informazioni sulla struttura di una molecola, misurando l'assorbimento di radiazione elettromagnetica (in particolare nel campo delle radiofrequenze) da parte del campione immerso in un forte campo magnetico. Questa proprietà è normalmente presente in questi atomi ma viene esaltata dal campo elettromagnetico forte. Infatti, alcuni atomi hanno determinate proprietà quando si trovano in questa situazione, ossia sono in grado

Questo è importante perché si è scoperto che, anche a parità di composizione in atomi, lo spettro è diverso perché dipende dalla struttura in quanto l'assorbimento di radiazione elettromagnetica è influenzata dalla vicinanza tra particolari atomi.

È importante quindi capire come interpretare questo spettro.

Esempio di piccole molecole: etanolo

Si osservano diversi picchi a diversi valori di frequenza per gruppi diversi della molecola in quanto parti diverse della molecola risuonano a valori diversi. Ogni picco, inoltre, è splittato e ha una forma diversa: queste costituiscono informazioni ulteriori che permettono di determinare una struttura.

Gli spettri monodimensionali, però, per le proteine sono piuttosto incomprensibili perché ci sono molti picchi tra

(che comunque si basa sui dati sperimentali di distanze ed angolazioni di legame + vincoli geometrici dovuti al fatto che la struttura è quella di una proteina -> il software ricerca possibili strutture compatibili a questi fattori) e quindi quello che si ottiene è un insieme di strutture probabilistiche, generalmente sovrapponibili perché molto simili (se l'esperimento è stato condotto correttamente e la proteina ha una struttura omogenea). 18/04/19

I punti in cui le diverse strutture di una stessa molecola differiscono maggiormente sono il C, l'N terminale e altre regioni di maggiore variabilità e flessibilità. Oltre che essere uno svantaggio perché non si ottiene una struttura unica ma un insieme di strutture, questo è anche un vantaggio dell'NMR rispetto alla cristallografia perché permette di trovare zone mobili perché proprio la loro funzione è associata a questa flessibilità (ad esempio,

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loop che si apre e si chiude); in cristallografia, invece, queste porzioni non sono visibili perché è necessaria una struttura fissa e cristallizzata affinché la tecnica. L'NMR quindi dà anche informazioni di tipo dinamico.

Si basa sul fatto che i nuclei degli atomi sono caratterizzati da una proprietà che è il momento magnetico di SPIN, dovuto al fatto che i nuclei degli atomi si comportano come dei dipoli. I nuclei sono infatti costituiti da protoni e neutroni e hanno una carica positiva, ma, a seconda del numero di protoni e neutroni, in alcuni nuclei si crea una certa polarità generando un dipolo magnetico che fa sì che se il nucleo viene posto in un campo magnetico, questo si allinea in un certo modo.

Lo spin è una proprietà fondamentale della materia e una grandezza quantizzata (si manifesta in multipli) e può essere + o -.

Se il numero di protoni è pari ed è uguale al numero di neutroni (come

Negli isotopi naturali di carbonio e ossigeno, non si ha nessun segnale NMR perché i (spin) = 0.

Se il numero di protoni è diverso da quello di neutroni e la loro somma è dispari, il nucleo non è neutro da un punto di vista magnetico (i=1/2) e quindi dà un segnale NMR. È il caso del protone (H -> atomo su cui si basa maggiormente la tecnica NMR) perché ha un solo protone e nessun neutrone; la stessa cosa accade anche con altri atomi che però non si trovano normalmente nelle molecole (come C, P, F -> usati nelle marcature).

Infine, se il numero di protoni più il numero di neutroni dà un numero pari e sono uguali in numero (numero dispari), si ha un segnale NMR perché i = 1. Questo accade con N e H.

Con il termine μ si indica il vettore momento magnetico che fa sì che il nucleo di un atomo dotato di spin si comporti come un magnete, nel senso che si allinea in maniera parallela o antiparallela (alcuni nuclei).

in un modo e altriin un altro) al campo magnetico (B ) in cui0sono immersi e la situazione cambia neltempo. La situazione quindi non è costantema si ha un continuo cambiamento dellapolarità secondo un moto di precessione checorrisponde ad una variazione di energia:

• c'è uno stato a minore energia dove lo spin è parallelo al campo magnetico esterno. (spin = - 1/2)
• c'è uno stato a maggiore energia dove lo spin è antiparallelo rispetto al campo magnetico esterno. (spin = + 1/2)

Se si aumenta l'intensità del campo magnetico in cui i nuclei sono immersi, aumenta il gap di energia tra i nuclei posti in maniera antiparallela e parallela rispetto al campo magnetico stesso.

L'NMR implica la necessità di usare un grosso magnete che applichi un grosso campo magnetico in un punto della macchina in cui viene inserito il campione perché così si aumenta notevolmente la disparità energetica tra i due.

La risonanza del protone legato all'ossigeno è differente e quindi si osserverà un picco diverso. Questo è dovuto al fenomeno del chemical shielding, nel senso che il campo magnetico effettivo che ogni nucleo dotato di spin sente non è B (campo magnetico applicato) ma B = B (1-σ) dove σ è la costante di schermo. Questo fenomeno è dovuto al fatto che ogni nucleo dotato di spin risente di una costante di schermo che dipende da tutti gli atomi dotati di spin presenti nella molecola che appunto schermano parte di B e dunque per ciascun nucleo a cui è applicato un campo magnetico, la radiofrequenza in cui si verificano le condizioni di risonanza dipende dall'intorno chimico del nucleo (sia per legame chimico per pervicinanza spaziale).

Apparato sperimentale

Prevede un potente magnete che generi B elevato; il fenomeno avviene lo stesso anche se il campo magnetico è più limitato ma l'energia rilasciata