Espressione eterologa di proteine - Metodi per l'ingegneria proteica

Produzione di una proteina

La proteina deve essere prodotta in modo che sia stabile, pura (purificata da tutte le altre componenti cellulari) ed omogenea. Il processo di produzione, infatti, comporta l’estrazione della proteina dal suo contesto cellulare e il tentativo di farla funzionare; tuttavia, estrarre una proteina dal suo contesto cellulare la sottopone a uno stress che potrebbe creare un malfunzionamento della proteina.

Metodi di produzione delle proteine

Le proteine possono:

• Essere estratte direttamente dai tessuti o da cellule in coltura. È un metodo che si applica soprattutto per grandi complessi macromolecolari, come il ribosoma o i foto-sistemi delle cellule vegetali, che è molto complesso riprodurre in vitro.
• Essere sovra-espresse come proteine ricombinanti in sistemi eterologhi (sistema più utilizzato).

L’applicazione di quest’ultimo metodo segue un percorso che prevede:

• L’identificazione del gene di interesse
• Il recupero del cDNA dal messaggero maturo
• Inserimento del cDNA in un sistema di espressione adatto (con successivo screening per i cloni positivi)
• La scelta del sistema di espressione adatto e a seconda del sistema scelto si ha un bivio:
• Scale up, isolamento e purificazione della proteina di interesse nel caso di sistemi batterici, lieviti e insetti. In questi sistemi si instaura un’espressione eterologa della proteina stabile.
• Trasfettazione delle cellule ed espansione della coltura trasfettata nel caso di cellule di mammifero. Quando si utilizzano queste cellule, si può sia ottenere un clone stabile (il clone produce sempre quella proteina ottenendo un sistema eterologo che può essere utilizzato per più esperimenti) o un sistema transiente (la cellula produce la proteina solo per il periodo di tempo relativo alla coltura e, ad un nuovo esperimento, bisognerà creare un nuovo sistema eterologo).

Scelta della specie della proteina

Nel momento in cui si identifica un processo biologico da studiare e il target (proteina semplice o complesso macromolecolare) che è il componente principale di quel processo, la progettazione dell’esperimento non è terminata, ma bisogna capire quale proteina studiare/estrarre (cioè da quale organismo) e in che forma esprimerla (full-length o come singoli domini).

Poiché spesso la proteina umana è molto complessa da produrre ed analizzare, spesso la scelta ricade sull’omologo di un’altra specie che generalmente non è perfettamente identico ma condivide con la proteina umana delle porzioni che comunque risultano utili all’analisi e ad iniziare le procedure necessarie a raggiungere l’obiettivo dell’esperimento.

La genomica comparativa può essere utile nello studio di proteine ed in particolare per:

• Identificare domini conservati nel caso di confronto tra genomi molto diversi
• Identificazione di elementi genomici specifici di una specie nel caso di confronto tra genomi evolutivamente correlati
• Identificazione di varianti alleliche, eventualmente patologiche, nel caso di confronto tra genomi di individui diversi ma appartenenti ad una stessa specie.

In che forma esprimere la proteina

Se estraggo la proteina, si ottiene la proteina full length, ma se la produco come ricombinante, posso esprimere anche i singoli domini da studiare singolarmente. Il secondo caso si usa spesso se, da precedenti studi bioinformatici, si sa che la proteina intera non è stabile o perché ci interessa solo la funzione di quel particolare dominio.

Sistema di espressione

Una volta definita la proteina target e il gene da cui deriva, bisogna identificare il sistema di espressione eterologo che si vuole usare. I sistemi di espressione si dividono in due grandi gruppi:

• Batteri (come E. Coli)
• Sistemi eucariotici che comprendono dai lieviti, cellule di insetto o cellule di mammifero.

I sistemi più usati sono batteri e lieviti perché semplici da realizzare in laboratorio e poco costosi, ma non sempre funzionano correttamente soprattutto in caso di proteine complesse che dovrebbero essere sottoposte a diverse modifiche post-traduzionali al fine di farle funzionare correttamente.

Tutti insieme questi elementi prendono il nome di costrutto: definire il costrutto significa definire su quale specie ci si vuole concentrare, in che forma produrre la proteina ricombinante e quale sistema eterologo usare per l’espressione (nonché quale vettore di espressione).

Vettori di espressione

Nel momento in cui scelgo il sistema eterologo si sceglie poi anche il vettore di espressione da utilizzare per inserire il gene che codifica per quella proteina all’interno delle cellule scelte come sistema di espressione. Il vettore è diverso a seconda delle cellule usate.

La struttura classica del vettore è generalmente circolare (come plasmidi o cosmidi), ma a volte possono anche essere lineari (ad esempio, i vettori che vengono usati per gli insetti vengono trasformati grazie a baculovirus). Questi vettori sono caratterizzati dalla presenza di un promotore in modo da esprimere la proteina (differenza fondamentale rispetto ai vettori di duplicazione).

Nella produzione di un vettore ricombinante, generalmente, l’inserto è formato da cDNA, ossia la sequenza di DNA complementare all’mRNA ottenuta grazie alla retrotrascrizione di quel filamento di mRNA. Il processo prevede:

• Retrotrascrizione di mRNA a DNA a dare un ibrido DNA-RNA
• Degradazione dell’RNA dell’ibrido da parte di nucleasi specifiche
• Copiatura del filamento di ssDNA a dare una molecola dsDNA
• Amplificazione del frammento
• Inserimento del frammento nel vettore

Generalmente, si retrotrascrivono tutti gli mRNA di una cellula e ciascun cDNA ottenuto viene inserito in un diverso vettore e tutti questi vettori ricombinanti, a loro volta inseriti in una cellula diversa per vettore, danno origine a una libreria di cDNA a cui si può attingere quando si vuole produrre una data proteina ricombinante, usando il cDNA da cui quella proteina deriva.

Utilizzo di enzimi di restrizione per il clonaggio

Nel caso di utilizzo di una libreria di cDNA, spesso occorre spostare l’inserto contenuto nel vettore utilizzato per costruire la libreria (plasmide donatore) ad un vettore che si vuole utilizzare per esprimere la proteina nell’esperimento specifico di interesse (plasmide ricevente):

• Ottenimento dell’inserto che può essere fatto in due modi:
• Digestione del plasmide donatore con enzimi di restrizione che tagliano regioni fiancheggianti l’inserto
• PCR sul template del plasmide donatore usando primer che si appaiano ai lati del frammento, amplificando quindi il solo frammento
• Amplificazione del plasmide ricevente in coltura batterica e taglio con opportuni ER in modo da creare estremità che vadano ad appaiarsi con quelle dell’inserto
• Inserimento dell’inserto nel plasmide ricevente che è più efficace se il taglio dell’inserto e del plasmide avviene con lo stesso ER che dà estremità a singolo filamento e coesive che quindi si appaiano.

Se questo non è possibile (come nel caso che i siti di restrizione ai lati dell’inserto nel plasmide donatore sono diversi da quelli che si trovano nel plasmide ricevente), si può amplificare il frammento di interesse dal plasmide donatore con PCR che utilizza primer particolari per una porzione complementari all’estremità dell’inserto ma che sono legati all’estremità 5’ a delle regioni contenenti i siti di restrizione che permettono il taglio corretto e funzionale alla successiva ricombinazione. Al termine di questa PCR, quindi, non solo il frammento è amplificato, ma risulta allungato ad entrambe le estremità di una porzione aggiuntiva che è stata portata dal primer.

Tecniche di restriction-free cloning

L’utilizzo di enzimi di restrizione può però dare dei problemi (ad esempio, se danno delle estremità nette oppure perché tagliano anche in mezzo al frammento di interesse). Per questo motivo, talvolta, si utilizzano tecniche che non prevedono il loro utilizzo, come il TA cloning. In questa tecnica, l’inserto viene creato per PCR usando una Taq polimerasi che manca dell’attività di 3’-5’ proofreading (attività per cui la polimerasi controlla il lavoro appena fatto) e quindi aggiunge un’adenina a singolo filamento all’estremità 3’ di entrambi i filamenti.

Il vettore ricevente viene, quindi, linearizzato con un taglio blunt (netto) e successivamente trattato con una terminal transferase che aggiunge una T a singolo filamento al 5’ di entrambe le estremità, generando dunque estremità coesive tra di loro complementari. In questo modo si facilita il legame tra l’inserto e il vettore ricevente. Con la ligasi si va poi ad unire tutti insieme.

Lo svantaggio di questa tecnica è la possibilità che il frammento si posizioni nel verso opposto; bisogna quindi usare altri metodi per controllare la direzionalità, selezionando quei cloni in cui il vettore è stato inserito in maniera corretta. Un modo per valutare la corretta direzionalità dell’inserto è quello di andare a digerire il plasmide con un ER e, a seconda della direzionalità del frammento, si ottengono dei frammenti di restrizione diversi. Un altro sistema restriction-free cloning sfrutta la ricombinazione omologa tra vettore ricevente e l’inserto. Infatti, se il vettore presenta due sequenze omologhe a due sequenze che fiancheggiano il frammento di interesse, allora il frammento, sfruttando queste regioni di complementarietà, andrà ad inserirsi nel vettore ricevente. Questo va fatto in cellula perché serve un apparato piuttosto complesso che si trova normalmente nelle cellule.

Sistemi di espressione procariotici (batteri)

È stato il primo sistema sviluppato che, ancora ad oggi, è particolarmente sfruttato, anche se il loro utilizzo è limitato per certi scopi. Nel momento in cui si inserisce la molecola di DNA ricombinante nei batteri, questi proliferano in una coltura permettendo quindi di moltiplicare anche il numero di plasmidi ricombinanti.

I vettori di espressione sono in quantità limitata rispetto a quelli di replicazione perché, sebbene si vuole produrre una notevole quantità di proteina, non bisogna produrla in quantità eccessiva perché altrimenti si rischia di "sovraccaricare" il batterio.

Trasformazione

È il processo attraverso cui si inserisce DNA esogeno (come il plasmide) all’interno dei batteri, basandosi su un processo che è già presente in natura favorendo lo scambio di materiale genetico tra i microrganismi. Per aumentare l’efficienza del processo, in laboratorio, si utilizzano cellule competenti, ossia cellule la cui parete cellulare è stata permeabilizzata per facilitare l’entrata del plasmide. Alle cellule competenti si possono quindi applicare due metodi:

• Heat-shock: le cellule competenti (generalmente rese tali per trattamento con cloruro di calcio) e il DNA esogeno vengono messi a contatto per un certo periodo di tempo in ghiaccio (a bassa temperatura); successivamente vengono poste a 42 °C per una decina di secondi per poi essere nuovamente trasferite in ghiaccio. Questo crea uno shock termico che favorisce l’assorbimento del plasmide. Quindi, le cellule vengono messe a crescere in un terreno non selettivo che permette il ripristino della parete cellulare e, solo successivamente, vengono fatte crescere in un terreno selettivo per selezionare le cellule che hanno incorporato il vettore ricombinante.
• Elettroporazione: le cellule vengono sottoposte ad una scarica elettrica che apre dei pori sulla parete cellulare. È un sistema più efficiente ma c’è il rischio di bruciare le cellule.

Per le cellule animali si parla di trasfezione e non di trasformazione perché quest’ultimo termine si riferisce alla formazione cancerosa e a quelle modifiche che portano la cellula a proliferare in modo incontrollato.

Selezione mediante antibiotico

Con il processo di trasformazione, l’efficienza non è del 100% e pertanto non tutte le cellule acquisiscono il plasmide. Pertanto, occorre distinguere le cellule ricombinanti da quelle non ricombinanti utilizzando un terreno addizionato con un antibiotico (crescita su piastra). Su questo terreno cresceranno solo le cellule che hanno incorporato il plasmide poiché su questo è presente un gene che codifica per la resistenza a quell’antibiotico.

Questi passaggi vengono effettuati anche per altri sistemi eterologhi, come i sistemi utilizzati per la replicazione di determinati frammenti di DNA.

Vettore di espressione batterico

Un tipico vettore di espressione batterico è composto da:

• Origine di replicazione
• Gene per la resistenza ad un antibiotico
• Multiple cloning site in cui inserire il frammento di interesse
• Promotore fondamentale per la trascrizione del gene di interesse

I diversi vettori si differenziano per il tipo di promotore e quindi per come viene indotta la produzione della proteina ricombinante. Il primo modello sviluppato, ed ancora molto utilizzato, è quello dell’operone lac. Per operone si intende un sistema di geni controllati da un unico promotore a cui, però, si frappone una sequenza, definita operatore, a cui viene legata una proteina (il repressore) che blocca fisicamente la RNA polimerasi, impedendo la trascrizione dei geni contenuti nell’operone. In particolare, l’operone lac è composto da 3 geni che servono al batterio per utilizzare il lattosio come fonte di carbonio, in quanto il lattosio è una molecola più complessa del glucosio e deve essere prima metabolizzato per poter essere usato. Questo operone è organizzato in modo tale che questi tre geni vengano trascritti solo in presenza di lattosio; infatti, il gene lacI, che si trova a monte di tutto l’operone, produce il repressore lacI (proteina tetramerica le cui subunità modificano la conformazione in base alla presenza o meno di lattosio) il quale, in assenza di lattosio, assume una conformazione tale da legarsi all’operatore, impedendo la trascrizione. Quando la concentrazione di lattosio aumenta, questo va a legarsi al repressore che cambia conformazione, staccandosi dall’operatore e attivando la trascrizione dei geni contenuti nell’operone. Si dice quindi che il sistema è inducibile.

Questo sistema viene sfruttato in laboratorio per controllare strettamente la produzione della proteina di interesse, evitando che questa sia prodotta durante la fase di crescita ma solo in fase esponenziale.

È stato quindi ingegnerizzato un ceppo di E. Coli, definito BL21-DE3, privo dei geni che determinano la patogenicità e contenente il gene della T7 polimerasi (una polimerasi del batteriofago T7) sotto il controllo del promotore lac. Poiché a valle dell’inserto che esprime la proteina di interesse è presente un promotore che lega con elevata affinità la polimerasi T7 e non la normale polimerasi di E. Coli, controllare l’espressione della polimerasi T7 significa controllare anche l’espressione della proteina di interesse. In particolare, il controllo avviene grazie a IPTG, una molecola analoga del lattosio (nel senso che è in grado di legare il repressore ed indurne il cambio conformazionale), ma che, a differenza di questa, non è idrolizzabile. Quindi, non è necessario aggiungere l’induttore in grande quantità o in maniera continua, ma si può aggiungere IPTG in piccole quantità (anche perché IPTG ad alte concentrazioni risulta tossico per il batterio).

Inoltre, anche l’inserto stesso è sotto il controllo dell’operone lac, perché altrimenti, sebbene il promotore abbia una maggiore affinità per la T7 polimerasi, l’RNA polimerasi batterica in condizioni basali potrebbe comunque legarsi al promotore e trascrivere il gene. In questo modo quindi si ha un doppio controllo della trascrizione del gene di interesse.

C’è anche un ceppo ancora più specifico, definito pLysS, ossia un batterio ulteriormente ingegnerizzato a contenere un altro plasmide con il gene per un lisozima che inattiva temporaneamente la polimerasi T7. Questo serve perché la produzione massiva della proteina ricombinante, quando si aggiunge IPTG, potrebbe essere deleteria per il batterio e, quindi, essere relegata da esso all’interno dei corpi di inclusione, in cui la proteina viene sfoldata. In questo modo si limita la quantità di proteina prodotta, permettendo di ottenere una quantità seppur limitata di proteina attiva (molto meglio di avere tanta proteina ma non attiva).

Codon optimization

Il codon usage è leggermente diverso tra procarioti ed eucarioti. Quindi, a volte, alcune proteine eucariotiche potrebbero non essere prodotte nel batterio perché il batterio non ha l’apparato traduzione sufficiente per tradurre l’mRNA relativo alla proteina di interesse. Questo problema viene quindi ottimizzato grazie al codon optimization, per cui l’inserto eucariotico, prima di essere inserito nel batterio, viene leggermente modificato in modo da inserire i codoni che il batterio, usato per l’espressione, utilizza maggiormente, pur mantenendo invariata la sequenza finale della proteina.

Un altro modo è quello di utilizzare dei ceppi con dei plasmidi extra con geni per amminoacil-tRNA tipici degli eucarioti. In questo modo, si dà al batterio la possibilità di inserire il corretto amminoacido anche in corrispondenza di un codone che è usato preferenzialmente dagli eucarioti e non dai batteri.

Nella mappa del plasmide viene indicata il multiple cloning site, il sito per il gene per la resistenza all’antibiotico da usare per la selezione, il promotore e l’origine di replicazione del plasmide.