Espressione eterologa di proteine - Metodi per l'ingegneria proteica

DNA

Un tipico vettore di espressione batterico è composto da:

• origine di replicazione
• gene per la resistenza ad un antibiotico
• multiple cloning site in cui inserire il frammento di interesse
• promotore fondamentale per la trascrizione del gene di interesse

I diversi vettori si differenziano per il tipo di promotore e quindi per come viene indotta la produzione della proteina ricombinante.

Il primo modello sviluppato, ed ancora molto utilizzato, è quello dell'operone lac. Per operone si intende un sistema di geni controllati da un unico promotore a cui, però, si frappone una sequenza, definita operatore, a cui viene legata una proteina (il repressore) che blocca fisicamente la RNAp, impedendo la trascrizione dei geni contenuti nell'operone. In particolare, l'operone lac è composto da 3 geni che servono al batterio per utilizzare il lattosio come fonte di carbonio, in quanto il lattosio è una molecola più complessa del glucosio e deve.

essere prima metabolizzato per poter essereusato. Questo operone è organizzato in modo tale che questi tre genivengano trascritti solo in presenza di lattosio; i infatti, il gene lacI, che si trovaa monte di tutto l'operone, produce il repressore lacI (proteina tetramerica lecui subunità modificano la conformazione in base alla presenza o meno di lattosio) il quale, in assenza dilattosio, assume una conformazione tale da legarsi all'operatore, impedendo la trascrizione. Quando laconcentrazione di lattosio aumenta, questo va a legarsi al repressore che cambia conformazione,staccandosi dall'operatore e attivando la trascrizione dei geni contenuti nell'operone. Si dice quindi che ilsistema è inducibile.Questo sistema viene sfruttato in laboratorio per controllare strettamente la produzione della proteina diinteresse, evitando che questa sia prodotta durante la fase di crescita ma solo in fase esponenziale.E' stato quindi ingegnerizzato

Un ceppo di E.Coli, definito BL21-DE3, privo dei geni che determinano la patogenicità e contenente il gene della T7 polimerasi (una polimerasi del batteriofago T7) sotto il controllo del promotore lac. Poiché a valle dell'inserto che esprime la proteina di interesse è presente un promotore che lega con elevata affinità la polimerasi T7 e non la normale polimerasi di Coli, controllare l'espressione della polimerasi T7 significa controllare anche l'espressione della proteina di interesse. In particolare, il controllo avviene grazie a IPTG, una molecola analoga del lattosio (nel senso che è in grado di legare il repressore ed indurne il cambio conformazionale), ma che, a differenza di questa, non è idrolizzabile. Quindi, non è necessario aggiungere l'induttore in grande quantità o in maniera continua, ma si può aggiungere IPTG in piccole quantità (anche perché IPTG ad alte concentrazioni risulta

tossico per il batterio). Inoltre, anche l'inserto stesso è sotto il controllo dell'operone lac, perché altrimenti, sebbene il promotore abbia una maggiore affinità per la T7 polimerasi, l'RNAp batterica in condizioni basali potrebbe comunque legarsi al promotore e trascrivere il gene. In questo modo quindi si ha un doppio controllo della trascrizione del gene di interesse.

C'è anche un ceppo ancora più specifico, definito pLysS, ossia un batterio ulteriormente ingegnerizzato a contenere un altro plasmide con il gene per un lisozima che inattiva temporaneamente la polimerasi T7. Questo serve perché la produzione massiva della proteina ricombinante, quando si aggiunge IPTG, potrebbe essere deleteria per il batterio e, quindi, essere relegata da esso all'interno dei corpi di inclusione, in cui la proteina viene sfoldata. In questo modo si limita la quantità di proteina prodotta, permettendo di ottenere una

utilizzando i codoni specifici degli eucarioti. Questo permette di ottenere una maggiore produzione di proteine eucariotiche funzionali nel batterio. Inoltre, è possibile utilizzare dei promotori specifici per l'espressione genica nel batterio. I promotori sono sequenze di DNA che controllano l'inizio della trascrizione del gene e quindi l'espressione della proteina corrispondente. Utilizzando promotori specifici per il batterio, si può ottenere una maggiore produzione di proteine funzionali. Infine, è importante considerare anche la scelta del sistema di espressione. Esistono diversi sistemi di espressione genica nel batterio, come ad esempio l'utilizzo di vettori plasmidici o l'integrazione del gene nel genoma batterico. La scelta del sistema più adatto dipende dalle caratteristiche della proteina di interesse e dagli obiettivi dell'esperimento. In conclusione, per ottenere una corretta espressione di proteine eucariotiche nel batterio è necessario considerare diversi fattori, come la codon optimization, l'utilizzo di ceppi con plasmidi extra e l'utilizzo di promotori specifici. Queste strategie permettono di ottenere una maggiore quantità di proteina attiva nel batterio.

Incorrispondenza di un codone che è usato preferenzialmente dagli eucarioti e non dai batteri. Nella mappa del plasmide viene indicata il multiple cloning site, il sito per il gene per la resistenza all'antibiotico da usare per la selezione, il promotore e l'origine di replicazione del plasmide. Insieme alla mappa, quando si compra un plasmide, viene anche fornita la sequenza dell'intero plasmide, ma la sequenza che interessa maggiormente è il sito di clonaggio che contiene nell'ordine:

• il promotore T7
• l'operatore lac
• RBS: ribosome binding site. È la zona in cui, nel trascritto maturo, va a legarsi il ribosoma.
• eventuale tag usato per effettuare una cromatografia di affinità che facilita la purificazione dell'enzima ricombinante
• multiple cloning site

A livello del multiple cloning site, si possono identificare tre forme di vettori (a,b,c) che differiscono tra di loro per una o due basi tra di loro poste tra la Gly (cerchiata in verde,

quella che segue la Met) e il sitoBamH1. Questo serve per mantenere il corretto open reading frame del gene che viene inserito nel vettore.Quando, infatti, inserisco la sequenza genica, questa verrà letta sempre a triplette a partire dalla Met(quella che precede la Gly) ma il suo schema di lettura deve essere rispettato perché altrimenti si produrrebbe un'altra proteina. Quindi, viene scelta la forma di vettore che permette di mantenere il normale frame del gene.

Protocollo per le crescite batteriche

In seguito alla trasformazione del batterio (E. Coli) con il plasmide, si procede alla crescita dei batteri trasformati su terreno selettivo.! A volte, i cloni trasformanti ottenuti vengono congelati in freezer e propagati quando servono, ma più comunemente si va a trasformare ogni volta il batterio con il frammento genico di interesse. Questo perché a lungo andare i batteri possono perdere alcune copie del plasmide ricombinante e, inoltre, quando si riattivano

le cellule che contengono da tanto tempo un plasmide, non è detto che non si accumulino delle mutazioni.! La crescita batterica prevede alcune fasi:

La coltura prevede:

• pre-inoculo: si stempera la colonia in una piccola quantità di terreno e si lascia in incubazione a 37 °C overnight e in agitazione
• inoculo: si pone la coltura ottenuta precedentemente in una quantità di terreno maggiore a 37°C solo per qualche ora. Generalmente si controlla la densità a 600 nm di lunghezza d'onda vengono attentamente controllati poiché indicano la densità batterica: valori intorno a 0,6 di OD significa che la coltura è ancora in fase di crescita esponenziale, mentre valori oltre 1 indicano che la coltura sta finendo la fase stazionaria e sta andando incontro alla fase di morte
• induzione della produzione di proteina con IPTG (induttore) e attraverso il controllo della temperatura. Infatti, se la proteina non è tossica per i batteri,

Allora si usa una T di 37 °C a cui i batteri comunque continuano a replicarsi un pochino, ma se la proteina è tossica per la cellula che la produce, allora è consigliabile diminuire la T, rallentando le funzioni vitali della cellula, ma permettendo di produrre la proteina in una forma stabile e funzionale. Facendo varie prove si va a vedere in quale fase la proteina ricombinante viene prodotta meglio. Tuttavia, se si induce la proteina nella fase esponenziale, significa che le cellule si stanno ancora dividendo e, quindi, oltre ad usare energia per dividersi, devono anche usarla per produrre la proteina; per questo spesso si aspetta la fase stazionaria.

Curve di crescita in presenza/assenza dell’induttore e/o del plasmide:

• viola: coltura senza niente. Normale crescita batterica
• rossa: coltura con plasmide. Normale crescita batterica
• verde: coltura con induttore. Normale crescita batterica ma le cellule tendono a morire un po’ prima perché IPTG

comunque è tossico- blu: coltura con plasmide e induttore. Si ha una fase lag molto lunga in cui il batterio deve abituarsi alle nuove condizioni (uno dei motivi per cui IPTG è aggiunto solo quando la densità cellulare ha raggiunto un certo livello). Scale-up: inizialmente si fanno delle prove per capire le condizioni ottimali per la crescita della coltura ma non sempre lo scale-up funziona, nel senso che i dati che ottengo con 10 mL, se li traspongo a quantità maggiori come 10 L, non si ha un aumento proporzionale di proteina come ci si aspetta. Metodo autoinducing: è un sistema che si può adottare con lo stesso clone di cellule contenente il plasmide usato anche nell'induzione con IPTG. Ciò che differisce è il terreno e alcuni parametri di crescita. Infatti, se normalmente si usa il luria broth (LB), nell'autoinducing, sebbene contenga anche triptone e altre componenti che si ritrovano in LB, il terreno ha un pH diverso.

contiene in aggiunta:

• glicerolo (60%)
• glucosio (10%)
• lattosio (8%): questo va ad indurre la produzione della proteina (come avviene fisiologicamente) e quindinon viene aggiunto IPTG

Il protocollo prevede:

1. trasformazione di E. Coli BL21-DE3 con il plasmide
2. pre-inoculo a 37 °C, overnight in agitazione
3. inoculo e crescita a 37 °C per 3 ore che usa glucosio come fonte di carbonio per la crescita (in generale, sec'è presente glucosio, il batterio tende ad utilizzare questa molecola come fonte di C rispetto a tutte le altrefonti); in questa fase, quindi, lacI risulta legato all'operatore e la trascrizione del gene è repressa perchè il glucosio ha proprio un'attività inibente nei confronti della degradazione del lattosio. Infatti, il glucosio agisce in maniera negativa sull'uptake del lattosio da parte della cellula, ma anche sull'espressione stessa delle proteine che producono il lattosio.
4. induzione a 17 °C overnight

senza utilizzo di IPTG. In questa fase perché il batterio ha utilizzato tutto il glucosio disponibile.