Lezioni: Appunti di Biochimica I

Introduzione alla biochimica

Livelli di osservazione e composizione chimica della materia vivente

Unità monomeriche > macromolecole > complessi sopramolecolari > cellula

Biochimica > istologia > anatomia

La biochimica è lo studio della chimica dei sistemi viventi. Gli elementi più abbondanti all'interno della materia vivente sono H, Na, K, Ca, C, N, O, P, S, Cl. Alcuni sono presenti nelle macromolecole, altri come ioni. Altri elementi sono presenti solo in tracce, per esempio Fe, Cu, Zn, Cr, Co.

L'acqua costituisce il 65% del corpo umano; in gran parte si trova all'interno delle cellule e una buona quota si trova esternamente rispetto alle cellule: questa quota va divisa ulteriormente tra liquido interstiziale e plasma. Gli altri componenti della materia vivente sono proteine, lipidi, minerali, carboidrati (in ordine di quantità decrescente). Tra gli ioni inorganici ci sono anche ioni poliatomici.

Ioni inorganici

La distribuzione degli ioni è assolutamente asimmetrica tra cellula e spazio extracellulare. Le membrane hanno l'importante compito di dividere questi due compartimenti, diversi dal punto di vista chimico. Gli ioni non sono all'equilibrio ma ci sono dei sistemi che mantengono questa asimmetria. Ciò determina la formazione di un potenziale di membrana alla base di molti processi di grande rilevanza. Il sodio è fondamentalmente presente nel liquido extracellulare e nel plasma, mentre il potassio si accumula all'interno delle cellule. Altri ioni sono meno rappresentati. Lo ione magnesio è presente maggiormente all'interno ed è importante per la stabilizzazione dell'ATP. Tra gli anioni si considerano anche le proteine protonate.

Principali biomolecole

• Carboidrati: funzioni strutturali ed energetiche (fondamentalmente)
• Amminoacidi: monomeri delle proteine e precursori di biomolecole azotate
• Lipidi: funzione strutturale e energetica
• Nucleotidi e acidi nucleici: ruolo informazionale, strutturale, energetico e catalitico

In biochimica la maggior parte delle molecole sono polifunzionali. Gli amminoacidi possiedono come minimo due gruppi funzionali. L'isomeria cis-trans è molto importante in biochimica: la luce può avere il potere di cambiare la conformazione da cis a trans delle molecole responsabili della visione. Ugualmente importante è l'isomeria ottica.

L'acqua

L'acqua è una molecola polare poiché la carica negativa è addensata sull'atomo di ossigeno, mentre la carica positiva è addensata sui due atomi di idrogeno. La molecola non è lineare quindi possiede un momento di dipolo (se lo fosse non avrebbe un momento di dipolo perché i due dipoli si annullerebbero a vicenda). L'angolo di legame è 104,5° perché le coppie di elettroni non condivise respingono maggiormente gli atomi e comprimono gli angoli di legame.

Due molecole di acqua possono interagire con un alcol attraverso due legami a H. Gli acidi carbossilici sono più solubili in acqua – il grado di solubilità dipende dal numero di legami a H. Le ammine, anche queste, sono solubili. Ma anche i composti solidi cristallini sono solubili, grazie alle interazioni ioniche che si instaurano fra gli atomi e successivamente, quindi, con le molecole di H. Quando si parla dell'acqua bisogna considerare anche la sua autoionizzazione. In acqua si trovano sempre ioni H⁺ (legati a una molecola di acqua) e ioni OH^-. La concentrazione di ioni H⁺ influenza la ionizzazione di molti gruppi funzionali ionizzabili, come il gruppo carbossilico.

Amminoacidi

Molecole che presentano due gruppi funzionali, un gruppo acido (carbossile ma esistono anche altri gruppi acidi) e un gruppo amminico NH₂. Gli alfa amminoacidi sono quelli che ci interessano. Essi presentano il gruppo amminico legato al carbonio legato al gruppo carbossilico. Il carbonio alfa è ibridato sp³ e lega 4 gruppi diversi. I gruppi carbonilici e amminici possono essere rappresentati in forma ionica (forma zwitterionica): NH₃⁺ è una base e acquista un H⁺, viceversa l'acido perde un H⁺.

Legando quattro gruppi diversi il carbonio alfa è detto asimmetrico, e gli amminoacidi sono per questo molecole chirali (a parte uno che presenta l'idrogeno in R). Quasi tutti gli amminoacidi hanno una configurazione S; solo un amminoacido ha configurazione R. Quindi tutti gli amminoacidi sono della serie sterica L (nella convenzione di Fisher-Rosanoff) e solo uno è della serie sterica D. Gli amminoacidi che costituiscono le proteine sono L alfa amminoacidi. Per classificare i 20 amminoacidi che costituiscono le proteine, bisogna considerare la catena R e osservare la sua idrofilicità o idrofobicità. Sulla base della polarità della loro catena R si classificano gli amminoacidi, ed essa è giudicata dalla facilità di essere solubilizzati in solventi polari. Una metà degli amminoacidi ha una catena laterale idrofobica e un'altra metà ha una catena laterale idrofobica.

Glicina: è l'amminoacido più semplice, la catena laterale è un semplice atomo di idrogeno. Non è una molecola chirale. Su molti libri è classificata tra gli apolari, in realtà va considerata a parte a causa della sua particolarità. Nel codice a tre lettere è Gly, nel codice a una lettera è G.

Apolari alifatici

• Alanina: presenta come catena laterale un gruppo metile CH₃. Esso è un gruppo alchile quindi ha proprietà apolari.
• Prolina (Pro/P): la sua catena laterale chiude ciclicamente con il gruppo amminico. L'azoto del gruppo amminico è legato sia al carbonio alfa che al carbonio della catena laterale. Si tratta quindi di un gruppo amminico secondario. La prolina conferisce caratteristiche particolari alla proteina di cui fa parte.
• Valina: catena idrocarburica ramificata.
• Leucina (Lu, L): ha un atomo di carbonio in più rispetto alla valina a livello della catena idrocarburica.
• Isoleucina: isomero strutturale della leucina, stessa composizione atomica, ma catene laterali che presentano le ramificazioni in punti diversi (C beta nell'isoleucina, C alfa nella leucina). Leucina e isoleucina favoriscono l'accumulo di massa muscolare.
• Metionina (Met, M): la sua catena laterale contiene un atomo di Z (oltre a lei solo la cisteina).

Apolari aromatici

• Fenilalanina (Phe, F): si può immaginare come una molecola di alanina in cui un idrogeno è sostituito da un gruppo fenile. L'anello benzenico conferisce una grande idrofobicità alla catena laterale.
• Tirosina (Tyr, Y): simile alla fenilalanina ma presenta un gruppo OH idrofilo legato all'anello benzenico. A causa di questo gruppo a volte è classificata tra gli idrofili. Nel complesso tuttavia prevale l'idrofobicità dell'anello quindi va inserita fra gli apolari.
• Triptofano (Trp, W): presenta un eterociclo, l'indolo.

Polari (gruppo idrofilo preponderante)

Catena ionizzabile o non ionizzabile.

Polari non ionizzabili

• Serina: presenta un gruppo OH legato a un CH₂. Assomiglia alla Tirosina, ma in essa prevale l'idrofobicità del fenile. In questo caso prevale la polarità dell'OH. L'OH non è ionizzabile.
• Treonina (T): presenta anch'essa un gruppo OH e la catena idrocarburica è troppo breve per poter essere considerata un amminoacido apolare.
• Asparagina: presenta un gruppo ammidico (le ammidi sono il prodotto di un acido carbossilico con l'ammoniaca, non sono basi).
• Glutammina (Gln, Q): anch'esso è un'ammide.
• Cisteina: è il secondo e ultimo amminoacido a presentare lo S. È simile alla serina ma è presente il gruppo tionico al posto del gruppo ossidrilico.

Polari ionizzabili

Catena laterale acida (i primi due) o basica (gli altri tre).

I gruppi ionizzabili hanno una determinata pKa.

• Acido aspartico (Asp, D): assomiglia all'asparagina, la quale è infatti l'ammide dell'acido aspartico. Quando è ionizzato è detto aspartato (a pH fisiologico).
• Acido glutammico (Glu, E): la glutammide è l'ammide dell'acido glutammico. Il glutammato è la forma ionizzata.
• Lisina (Lys, K): catena idrocarburica a 4 atomi di C a cui è legato il gruppo amminico. Pka 10,5 (a pH inferiori a questo valore è dissociato, a valori superiori è indissociato quindi a pH fisiologico è completamente dissociato).
• Arginina (Arg, R): catena idrocarburica a tre atomi di carbonio a cui è legato il gruppo guanidinico (gruppo basico). Pka 12,5.
• Istidina (His, H): presenta un anello imidazolico che può protonarsi. Pka 7: l'equilibrio di dissociazione della catena laterale dell'istidina è molto vicino al pH fisiologico. Tra gli amminoacidi è l'unico che cambia il suo valore di dissociazione e dissociazione a pH fisiologico. È per questo motivo che si ritrova all'interno dei siti attivi degli enzimi ad incrementare il loro ruolo catalitico. Può agire da acido e da base cedendo o acquistando H⁺.

Caratteristiche comuni a tutti gli amminoacidi

Punto isoelettrico: Un amminoacido che non ha gruppi protonabili può esistere in 3 forme: gruppo carbossile dissociato ed amminico non dissociato, forma zwitterionica, gruppo carbossile indissociato e gruppo amminico dissociato (il gruppo COOH ha una pKa 2,2 il gruppo amminico 9.4). Esiste un valore di pH al quale l'amminoacido ha carica netta 0. Se non ci sono altri gruppi ionizzabili per ottenere il valore del pH al punto isoelettrico si fa la media tra le due pKa. Per gli altri è la media delle pKa dei due gruppi carbossilici (amminoacidi acidi): il pH al punto isoelettrico è acido. Viceversa per i basici. Così come esiste il punto isoelettrico di un amminoacido esiste anche il punto isoelettrico delle proteine.

Ingombro sterico: alcuni amminoacidi hanno un ingombro sterico importante, come quelli che possiedono un gruppo aromatico.

Essenzialità: una molecola è detta essenziale se non può essere sintetizzata ma può solo essere assunta con la dieta. Alcuni amminoacidi sono essenziali, 8 nell'uomo: i tre amminoacidi ramificati Valina, Leucina, Isoleucina (catena ramificata), Fenilalanina e Triptofano (Anelli Aromatici), Treonina, Metionina (perché hanno catene di 4 C) e Lisina (gruppo NH₂ in epsilon). Arginina e istidina sono essenziali nella prima infanzia.

Reattività degli amminoacidi

Legame peptidico: reazione di condensazione tra il gruppo carbossilico e l'amminico.

Le catene laterali sono in genere poco reattive, soprattutto quelle idrofobiche. Gli amminoacidi polari hanno una certa reattività. La cisteina è abbastanza reattiva: due gruppi SH possono reagire attraverso una reazione di ossidazione in cui vengono eliminati due atomi di carbonio. Si forma un ponte o legame disolfuro (tra due atomi di S). Questo legame è frequentemente presente nelle proteine. Se due molecole di cisteina si legano tra loro si forma un dimero detto cistina. Le catene laterali della lisina possono reagire con funzioni aldeidiche (per esempio di zuccheri). In questo caso si formano le basi di Shiff. Queste reazioni non sono sempre desiderate.

Triptofano e la tirosina hanno proprietà spettroscopiche: assorbono l'ultravioletto con un picco massimo alla lunghezza d'onda di 280 nm. L'entità dell'assorbimento (la radiazione eccita gli elettroni di legame della molecola, in questo caso dell'anello aromatico) di questa radiazione è proporzionale alla quantità di specie assorbente nella proteina. La legge di Lambert-Beer mette in relazione l'assorbimento con la concentrazione della specie che assorbe.

Oltre ai 20 amminoacidi ci sono alcuni amminoacidi che non rientrano nella costruzione delle proteine o che sono stati modificati post-traduzionalmente (4-idrossiprolina, 5-idrossilisina si ritrovano nel collagene, 6-N-metil lisina si trova nella miosina, carbossiglutammato si trova nella protrotrombina, la desmosina che si ottiene quando 4 residui di lisina si legano fra loro si trova nell'elastina). Esistono anche modificazioni reversibili come la fosforilazione implicata nella regolazione dell'attività degli enzimi, la metilazione che svolge funzioni regolatorie negli istoni.

Gli amminoacidi che non rientrano nelle proteine sono la citrullina (rientra nel ciclo dell'urea), omoserina (hanno la tendenza a formare lattoni, molecole cicliche che non possono esistere all'interno di una proteina).

Legame peptidico

Il legame peptidico è rigido e planare in quanto ha caratteristiche di doppio legame (ibridazione sp²). La distanza tra C e N infatti è minore rispetto a quella che ci si dovrebbe aspettare se il legame fosse semplice. Esiste perciò una configurazione cis e una trans del legame. Nella cis i carboni alfa si trovano dalla stessa parte e non è consentita per questioni di ingombro sterico. Le catene laterali si verrebbero a trovare troppo vicine tra loro. Il legame peptidico è sempre in configurazione trans. Fa eccezione la Prolina che si chiudeva ciclicamente sull'atomo di N. Nei legami X-Pro (dove la Prolina fornisce il gruppo amminico per il legame peptidico) la forma trans è comunque favorita, tuttavia si può trovare anche la forma cis (10-20% delle molecole: le due configurazioni sono inconvertibili: alcuni enzimi (prolil peptidil isomerasi) catalizzano questa che sarebbe una lentissima reazione. La prolina ha una configurazione tale da non rendere impossibile la configurazione cis.

L'unità peptidica è un dipolo proprio a causa della configurazione trans che assume. Quando si forma una catena tuttavia rimangono liberi solo il gruppo carbossile terminale e il gruppo amminico iniziale. La catena polipeptidica di una proteina costituisce la struttura primaria. La catena ha una sua polarità in quanto le estremità sono diverse: amminoterminale, il primo amminoacido e carbossiterminale, l'ultimo amminoacido. Gli amminoacidi all'interno di una catena polipeptidica non si chiamano più amminoacidi ma più esattamente residui. La catena polipeptidica è costituita da uno scheletro o backbone costituito dai piani dei legami peptidici. Dallo scheletro lateralmente si dipartono le catene laterali. L'ordine degli amminoacidi che costituiscono una proteina è preciso e codificato dall'informazione genetica.

Classificazione delle catene polipeptidiche

• Proteine: AA > 50
• Polipeptidi: AA < 50
• Oligopeptidi: Dipeptidi, tripeptidi ecc.
• Proteine semplici: costituite solo da una componente polipeptidica
• Proteina coniugata: costituita da una catena polipeptidica e un gruppo prostetico
  • Lipoproteine
  • Glicoproteine (o glicoproteina)
  • Fosfoproteine
  • Emoproteine: presentano il gruppo prostetico eme
  • Flavoproteine: nucleotidi flavinici
  • Metalloproteine: ferro, zinco, rame...

Le proteine

Funzioni, dimensioni e composizione

Molecole estremamente polivalenti.

• Azione catalitica > enzimi
• Ruoli di regolazione > ormoni
• Regolazione dell'espressione genica
• Proteine di trasporto > emoglobina, transferrina, proteine carrier della membrana
• Riserva energetica > caseina, ovalbumina, ferritina (accumulano all'interno della cellula sostanze rilevanti per la cellula)
• Strutturale
• Contrattile
• Difesa > anticorpi
• Offesa > non tanto nell'uomo ma più in certi animali o batteri
• Adattatrici > proteine che interagiscono con altre proteine sulla membrana plasmatica di cellule
• Recettoriale
• “Esotiche”

Le proteine possono avere diverse dimensioni. L'insulina è costituita da 51 residui. La Glutammina sintetasi per esempio è composta da 5616. Le dimensioni tuttavia di queste due proteine non sono tanto più diverse da quel che ci si immaginerebbe. Le proteine solubili sono quasi spesso globulari e anche queste le solo.

È possibile conoscere quali sono gli amminoacidi costitutivi delle proteine. È necessario purificare ed isolare una proteina e sottoporla all'analisi della composizione amminoacidica: è necessario idrolizzare la proteina, rompere tutti i legami peptidici presenti in modo da ottenere una miscela di tutti gli amminoacidi che la compongono. Per farlo bisogna sottoporre la proteina ad acido cloridrico 6M a temperatura elevata (oltre 100°C) e in assenza di ossigeno (che andrebbe ad ossidare alcune molecole). Questo drastico processo deve durare circa 48 ore (incubazione prolungata). A questo punto gli amminoacidi possono essere separati e si può risalire alla composizione amminoacidica della proteina in esame. Certi amminoacidi come il triptofano (il più voluminoso) si trovano molto raramente; gli amminoacidi che ricorrono più frequentemente sono la lisina, l'arginina, gli amminoacidi idrofili in genere, il glutammato e l'aspartato. Il collagene è formato in gran parte (1 residuo su 3) da glicina. Un'analisi di questo tipo non dice nulla sull'ordine con cui si susseguono gli amminoacidi, ci informa solo delle sue composizione. Indica per esempio se la proteina è acida, basica o neutra: consente di individuare il punto isoelettrico della proteina che stiamo analizzando. Le proteine basiche hanno un punto isoelettrico basico e a pH fisiologico mostrano cariche positive (polioni). Le proteine acide a pH a fisiologico sono dei polianioni. Per studiare la successione degli amminoacidi si può o studiare la sequenza del gene che codifica per la proteina (oggi più utilizzato perché più semplice) o staccare un amminoacido alla volta.

Livelli strutturali delle proteine

Essendo costituite da 20 amminoacidi diversi si ha una grande variabilità strutturale. Questi amminoacidi possono essere in sequenza in qualsiasi ordine quindi si possono avere molti ordinamenti differenti.