Lezioni: Appunti di Biochimica

Cap 1 - Fondamenti di biochimica

La biochimica cerca di spiegare come le eccezionali caratteristiche degli organismi viventi dipendano dall'interazione di un enorme numero di biomolecole: queste, una volta isolate ed esaminate singolarmente, si adattano a tutte le leggi chimiche e fisiche che regolano il comportamento della materia inanimata. Le molecole, di per sé prive di vita, interagiscono tra loro per perpetuare la vita attenendosi soltanto a quelle leggi chimiche e fisiche che governano l'universo non vivente.

Attributi straordinari degli organismi viventi

• L'alto grado di complessità chimica e organizzativa: molecole con specifiche strutture tridimensionali e specifiche sequenze polimeriche capaci di interagire selettivamente con poche altre molecole.
• La capacità di utilizzare l'energia: ciò permette loro di mantenere l'alto grado di ordine e di compiere diversi lavori. L'ambiente non vivente, al contrario, tende a raggiungere lo stato maggiormente disordinato e con la più bassa energia.
• Ognuna loro componente possiede una funzione specifica.
• Possiedono meccanismi per percepire stimoli esterni e alterazioni dell'ambiente e rispondere adeguatamente.
• Hanno la capacità di autoriprodursi e autorganizzarsi.
• La capacità di evolvere, cioè cambiare nel tempo attraverso modifiche graduali (al fine di sopravvivere alle mutate condizioni ambientali → adattamenti biochimici). Il risultato di anni di evoluzione è l'enorme numero di forme di vita differenti esistenti (biodiversità).

La biochimica esprime in termini molecolari le strutture, i meccanismi e i processi chimici alla base della vita e comuni a tutti gli organismi viventi.

Biologia cellulare

Le cellule sono le unità strutturali e funzionali di tutti gli organismi viventi. Le cellule sono caratterizzate da eterogeneità ma anche uniformità. Tutte sono costituite dalla membrana plasmatica, bilayer lipidico sottile, resistente, flessibile e idrofobico, in cui sono più o meno immerse proteine che svolgono funzioni di trasporto, recettoriali ed enzimatiche. I componenti delle membrane non sono tra loro legati covalentemente → flessibilità. Tutte le cellule possiedono in almeno una parte del loro ciclo vitale un nucleo o un nucleoide dove viene conservato il genoma. All'interno della membrana plasmatica troviamo il citoplasma, costituito da una soluzione acquosa in cui sono dispersi enzimi, metaboliti, coenzimi, ribosomi, proteasomi. Le cellule hanno dimensioni che vanno da 1,2 micron a 100 micron.

Il limite inferiore è dato dalle dimensioni delle particelle elementari che devono essere presenti (per esempio la cellula eucariotica deve essere maggiore di 2 micron perché possiede mitocondri), il limite superiore è dovuto invece all'indice di diffusione di molecole di soluto nei sistemi acquosi (limite teorico alla dimensione della cellula).

Tutti gli organismi viventi si suddividono in 3 grandi domini: batteri, archea e eucarioti. Gli archea sono evolutivamente parlando più vicini agli eucarioti di quanto lo siano i batteri: gli eucarioti infatti si sono sviluppati dalla stessa branca da cui si sono sviluppati gli archea. I batteri e gli archea sono unicellulari. Essi possono essere anaerobi o aerobi. Gli anaerobi possono essere facoltativi o obbligatori. In base alla fonte di energia utilizzata si distinguono fototrofi, chemiotrofi (tra questi i litotrofi utilizzano combustibili inorganici, gli organotrofi molecole organiche). I fototrofi si dividono in autotrofi se utilizzano CO₂ come fonte di carbonio, eterotrofi se richiedono nutrienti organici.

Frazionamento cellulare

La biochimica ha fatto passi da giganti da quando sono state messe a punto le metodiche per separare gli organuli dal citosol e i diversi organuli tra loro (frazionamento cellulare): in primis si ha l'omogeneizzazione delle cellule, i tessuti cioè sono immersi in una soluzione (acquosa tamponata contenente saccarosio in modo da essere isotonica) che disgrega le membrane. L'omogenato viene centrifugato e gli organelli che hanno diverse dimensioni sedimentano a velocità diverse → centrifugazione differenziale. In questo modo (centrifugazione differenziale) si ha una grossolana separazione dei componenti cellulari che possono essere ulteriormente purificati per centrifugazione isopicnica (stessa densità): i diversi organelli vengono separati per centrifugazione in una soluzione a gradiente di densità (densità maggiore dal menisco al fondo della provetta). Durante centrifugazione ciascun organello sedimenta finché non raggiunge nel gradiente la zona con una densità pari alla densità di galleggiamento.

Ogni cellula al suo interno presenta un'importante organizzazione dovuta al: sistema membranoso interno (che individua compartimenti chiusi) e al ricco citoscheletro che è allo stesso tempo una struttura portante e organizzativa statica ma anche un elemento in continuo disassemblaggio e riassemblaggio che permette cambiamenti di forma, motilità cellulare e movimenti intracellulari. Le cellule sono costituite da macromolecole a loro volta costituite da monomeri di biomolecole come gli amminoacidi, i nucleotidi ecc.

A loro volta le macromolecole si associano a formare complessi macromolecolari: se i vari monomeri si associavano tra loro a formare macromolecole tramite legami covalenti, i complessi macromolecolari sono tenuti insieme dalla sommatoria delle numerosissime forze intermolecolari (dipolo-dipolo, legami a H, forze di van der Waals).

Fondamenti di chimica

La biochimica si propone di spiegare le forme biologiche e le loro funzioni in termini chimici. Un tempo si divideva la materia vivente da quella non vivente per la sua maggior complessità chimica. Oggi siamo coscienti del fatto che almeno 30 degli elementi (tutti con numero atomico basso) conosciuti fanno parte della materia vivente e che le reazioni che si riscontrano in un batterio sono le stesse che si riscontrano in un elefante (cit Monod 1954). Questa è un'importante prova a sostegno della teoria secondo cui tutti gli organismi viventi abbiano un precursore comune → unitarietà biochimica degli esseri viventi.

I quattro elementi più abbondanti sono l'H, O, N, C (99%): sono gli elementi più leggeri e formano i legami più forti. Gli elementi presenti in tracce sono comunque indispensabili per la vita (grazie ad essi funzionano certi enzimi → vedi emoglobina e ferro). Il C corrisponde alla metà del peso secco della cellula. Il C può formare 4 legami al massimo, può legarsi con altri atomi di C, può formare legami doppi o tripli con N o O: esso può formare scheletri carboniosi e un'infinita varietà di molecole: è per questo che è stato scelto come atomo attorno al quale ruota tutta la chimica del vivente.

Le biomolecole possono essere considerate teoricamente come derivati dagli idrocarburi in cui gli atomi di idrogeno sono sostituiti da una serie di gruppi funzionali: la personalità chimica di un composto deriva dalla chimica dei suoi gruppi funzionali e dalla loro disposizione nello spazio. Tutte le cellule contengono un pool di metaboliti essenziale e universale. In più alcune cellule, come alcune cellule vegetali, contengono sostanze specifiche dette metaboliti secondari che giocano un ruolo specifico nella vita della pianta (es nicotina). L'insieme delle piccole molecole contenuto in ogni cellula è stato detto metaboloma.

Oltre alle piccole molecole che si trovano nel citosol gran parte delle funzioni cellulari è svolta dalle proteine, le biomolecole più versatili: l'insieme delle proteine funzionanti in una cellula è detta proteoma. Altre macromolecole sono gli acidi nucleici che trasmettono l'informazione genetica ma possono avere in alcuni casi funzioni strutturali ed enzimatiche. I polisaccaridi hanno 3 funzioni principali: riserva di energia, componenti strutturali delle pareti cellulari, elementi extracellulari che si legano ad altre cellule o svolgono funzioni di riconoscimento (gli zuccheri semplici come gli amminoacidi possono dar vita a diverse combinazioni).

I lipidi hanno funzioni strutturali, riserva di energia, pigmenti e segnali cellulari. Le proteine, gli acidi nucleici e i polisaccaridi sono molecole di grandi dimensioni mentre i lipidi hanno peso molecolare meno elevato (non si parla per i lipidi di macromolecole). Tuttavia essi si possono associare in maniera non covalente a dare aggregati sovramolecolari molto estesi. Le macromolecole sono costituite da monomeri la cui sequenza può avere un ruolo informazionale: per questo per alcuni oligosaccaridi, per le proteine e per gli acidi nucleici si parla di molecole informazionali.

Molto importante nell'interazione tra le componenti chimiche cellulari è la forma, la stereochimica delle molecole. Le interazioni tra biomolecole sono stereospecifiche. La conformazione molecolare è diversa dalla configurazione: essa rappresenta la disposizione spaziale che i gruppi funzionali sono liberi di assumere grazie alla possibilità di ruotare attorno ai legami semplici. La conformazione può essere cambiata con una semplice rotazione, la configurazione con rottura di legami. La struttura tridimensionale delle biomolecole, cioè la combinazione tra configurazione e conformazione, è di massima importanza per le interazioni biologiche. La stereospecificità cioè la capacità di distinguere fra i vari stereoisomeri è una caratteristica peculiare di ormoni, enzimi ecc. se il sito attivo di una proteina è complementare a un certo stereoisomero non lo è per l'altro: sarebbe equivalente a dire che la mano destra può indossare sia il guanto destro che il sinistro.

Fondamenti di fisica

Le cellule devono compiere un lavoro e utilizzare energia per rimanere in vita e per mantenere la loro organizzazione interna. Anche la conservazione e l'espressione dell'informazione genetica richiedono energia. Gli organismi viventi utilizzano l'energia solare come fonte di energia. Anche se la composizione tipica di ogni organismo varia pochissimo nel corso del tempo essa non è affatto statica: le molecole vengono degradate e nuovamente sintetizzate (le molecole di emoglobina che trasportano l'ossigeno nel sangue in questo momento sono state sintetizzate 1 mese fa). Nella cellula c'è un continuo equilibrio tra sintesi e degradazione di biomolecole definito equilibrio stazionario.

Quando un organismo muore comincia a tendere verso l'equilibrio dell'ambiente circostante. Gli organismi viventi sono sistemi aperti perché scambiano sia energia che materia con lo spazio circostante. Essi assumono l'energia attraverso due fonti: la luce solare e i combustibili chimici organici come il glucosio (→ li ossidano per estrarre energia). La quantità totale di energia dell'universo rimane costante anche se le forme in cui si presenta cambiano. Le cellule sono eccellenti trasduttori di energia. Le piante (autotrofi) utilizzano l'energia solare per strappare elettroni dall'acqua e ridurre la CO₂ a formare glucosio e ossigeno molecolare: gli organismi che non dipendono dalla luce (eterotrofi) invece ossidano i prodotti della fotosintesi ricchi di energia (glucosio) trasferendo poi gli elettroni all'O₂. Tutte le trasduzioni energetiche dipendono da un flusso di elettroni in discesa (reazioni di ossidoriduzione).

La cellula ha un'entropia molto bassa rispetto all'ambiente circostante. L'ossidazione di glucosio per esempio è una reazione che non richiede ma libera energia e difatti è entropicamente favorita: le molecole che si liberano sono in numero maggiore di quelle presenti inizialmente. Le molecole informazionali sono esempi di entropia negativa: per custodire l'informazione la cellula deve impiegare energia chimica nell'assemblaggio dei monomeri a formare polimeri e per ordinarli nella giusta sequenza. La variazione di entropia ha un valore positivo quando questa aumenta.

Nella cellula avvengono reazioni che hanno un delta G negativo, cioè favorevoli sia quelle che necessitano l'accoppiamento a reazioni esoergoniche (sintesi di proteine e acidi nucleici). La sorgente di energia libera maggiormente utilizzata dalla cellula è quella rilasciata dalla rottura del legame fosfanidridico dell'adenosinatrifosfato e della guanilinatrifosfato. Grazie a questa strategia di accoppiamento la cellula può compiere un gran numero di reazioni chimiche. L'accoppiamento energetico unisce le reazioni biologiche fra loro. Dell'energia liberata da una reazione esoergonica solo una parte viene utilizzata per compiere lavoro, una parte viene sempre dissipata in calore e aumenta l'entropia.

Le macromolecole nella cellula sono instabili: tuttavia la loro demolizione se non catalizzata richiederebbe tempi talmente lunghi da poterle considerare stabili nella cellula. La catalisi delle reazioni cellulari è a opera di enzimi, biocatalizzatori che non vengono consumati dalla reazione: essi aumentano la velocità di reazione abbassando l'energia di attivazione. Gli enzimi essendo specifici per la reazione che catalizzano ed essendo regolabili dirigono l'attività cellulare in ogni momento. Le vie metaboliche sono sequenze ordinate di reazioni chimiche in cui il prodotto di una reazione diventa il reagente di quella successiva.

Le vie cataboliche liberano l'energia per la produzione di ATP: la sua concentrazione è molto elevata e molto al di sopra della concentrazione di equilibrio, per questo la sua demolizione ad ADP e Pi inorganico è molto favorita. Le reazioni di sintesi rientrano nelle reazioni anaboliche. Reazioni anaboliche e cataboliche, cioè l'insieme di reazioni catalizzate da enzimi in una cellula, viene detto metabolismo. ATP, GTP, UTP, CTP sono la principale connessione tra componenti anabolici e catabolici. Come è regolato il metabolismo? Per esempio, per quanto riguarda la produzione di isoleucina, quando questo amminoacido è prodotto in quantità sufficienti esso si accumula e inibisce l'attività del primo enzima della via: inibizione retroattiva. Le cellule regolano anche direttamente la loro produzione di enzimi. Il metabolismo cellulare può essere visualizzato come un'intricata rete di reazioni nella quale un metabolita può partecipare a più vie metaboliche e la sua assenza può avere diverse reazioni a cascata.

Fondamenti di genetica

Forse la proprietà più rilevante degli organismi è la loro capacità di riprodursi all'infinito e in modo così fedele. La molecola di DNA con la sua caratteristica struttura è la perfetta modalità tramite la quale l'informazione genica si è trasmessa per così tanto tempo. La struttura a doppia elica è importante nei processi di replicazione e riparazione. La molecola di DNA contiene l'informazione per la produzione di proteine lineari che tuttavia si devono ripiegare, talvolta con l'ausilio di chaperoni molecolari.

Fondamenti di biologia dell'evoluzione

"Niente in biologia ha un senso se non alla luce dell'evoluzione". Gli organismi attuali derivano da un precursore comune grazie al presentarsi di una serie di mutazioni favorevoli che hanno conferito ad alcuni gruppi di organismi la capacità di adattarsi a certe nicchie ecologiche → sopravvivenza del migliore sotto la pressione selettiva. Le molecole di DNA sono documenti che recano impresso il lungo cammino della storia evolutiva, dalle prime cellule agli organismi attuali.

La frequenza di errori nella duplicazione del DNA rappresenta un compromesso tra un numero eccessivo di errori e un numero troppo basso di errori. Alcuni milioni di anni hanno prodotto organismi sempre più perfetti a utilizzare le fonti dall'ambiente per ottenerne il massimo vantaggio ed hanno prodotto diverse varietà di individui che si sono adattati a varie nicchie ecologiche.

Al di fuori della loro presenza negli organismi viventi, i composti organici sono presenti solo in piccole tracce sulla crosta terrestre, nel mare e nell'atmosfera. Questi composti si sono formati miliardi di anni fa sotto la spinta di forti scariche di energia (radiazioni ultraviolette, scariche elettriche, eruzioni..) a partire da molecole che si trovavano nell'atmosfera o nei mari in formazione (correnti oceaniche surriscaldate) → teoria dell'origine abiotica della vita.

È stato inoltre ipotizzato che l'RNA inizialmente svolgesse la duplice funzione di custodire l'informazione genica e catalizzare reazioni chimiche. In questo modo esso poteva catalizzare la sua stessa replicazione (poi questa attività sarà affidata alle proteine). DNA e proteine sarebbero apparsi nello stesso tempo, l'RNA avrebbe preceduto entrambi. La prima tappa dell'evoluzione biologica fu quindi la formazione casuale in un brodo primordiale di una molecola di RNA che aveva la capacità di catalizzare la formazione di nuove molecole di RNA → RNA autoreplicante.

La fedeltà della replicazione non era ottimale e quindi si sarebbero formate molecole sempre più efficienti che avrebbero soppiantato le altre. Da questo primo mondo a RNA le funzioni furono poi divise tra DNA e RNA: si svilupparono RNA in grado di catalizzare la formazione di polipeptidi. In alcuni casi questi polipeptidi rinforzavano la capacità autoreplicativa delle molecole di RNA. Le coppie così generate formavano dei primi sistemi molto efficienti. La scoperta che sono le molecole di RNA a catalizzare la formazione del legame peptidico e non altre proteine supporta questa tesi. Il DNA, molecola più stabile dell'RNA con struttura complementare all'RNA autoreplicanti, divenne il custode dell'informazione genica. I lipidi formarono degli strati impermeabili, delle "bolle" all'interno delle quali acidi nucleici e proteine poterono interagire a formare sistemi sempre più complessi. I composti organici ancora molto stabili per l'assenza di ossigeno vennero incorporati nelle cellule. Tutto questo avvenne 3,5 miliardi di anni fa, la terra si è formata 4,6 miliardi di anni fa.