Lezioni, Anatomia Patologica

FISSATIVI CHIMICI

• definizione

• modalità d'impiego

• miscele fissative

• fissativi semplici

Il fissativo chimico è una sostanza capace di preservare la morfologia e la composizione molecolare

di un tessuto. La fissazione è un trattamento chimico che porta all’immobilizzazione e alla

stabilizzazione di componenti tissutali. La scelta di un fissativo dipende dalla velocità di

penetrazione nel tessuto, la temperatura, che può aumentare la velocità di penetrazione, ma troppo

elevata può essere dannosa e il calcolo dell’esatto rapporto volumetrico tra il tessuto e il liquido di

fissazione. I fissativi chimici sono molto utilizzati le modalità d’impiego sono diverse:

fissazione per perfusione: consiste nel far circolare il fissativo direttamente nell’apparato vascolare

del tessuto in esame, metodica utilizzata solo su animali da laboratorio, anestetizzati;

fissazione per immersione: è la metodica più utilizzata, è opportuno immergere il campione nel

fissativo nel minor tempo possibile dalla sua asportazione;

fissazione per vapori: metodica poco utilizzata in quanto sono maggiori le difficoltà e i problemi, si

basa sull’utilizzo di vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata.

I fissativi chimici possono essere semplici, costituiti da un solo fissativo, o miscele fissative, un

insieme di più fissativi. Tra i fissativi semplici: la formaldeide, gas incolore e solubile in acqua, con

le proteine si comporta come un fissatore non coagulante, possiede un elevato grado di

penetrazione, non provoca eccessivo indurimento dei tessuti, non dissolve i lipidi; la glutaraldeide

che ha caratteristiche simili alla formalina, nei confronti dei lipidi ha un’azione conservante e non

fissante e dissolve i glucidi, conserva le strutture cellulari fini come mitocondri o i nuclei, non ha

un’ottimale fissazione delle membrane; l’Alcool etilico che tende ad indurire i tessuti ed è per

utilizzato poco come fissativo e più come elemento disidratante, ha una buona capacità di

penetrazione, dissolve i lipidi e denatura le proteine; il tetrossido di osmio viene utilizzato dopo

aver fissato i tessuti con glutaraldeide, per fissare le strutture lipidiche e le membrane, ha un potere

di penetrazione ridotto ed è volatile, tossico ed irritante. È responsabile del colore nero dei tessuti

fissati. Le miscele fissative possono essere distinte in acquose e alcoliche. Tra le più utilizzate

troviamo il liquido di Bouin (acquoso), formato da soluzione satura acquosa di acido picrico,

formalina e acido acetico, ha un’ottima capacità di penetrazione ed è tra i fissativi idonei per la

fissazione di pezzi voluminosi; il liquido di Carnoy (alcolico), formato da alcool etilico assoluto,

cloroformio e acido acetico, ha buona capacità di conservazione dell’ immunoreattività dei filamenti

intermedi.

REAZIONE PAS

• definizione

• utilizzo

• principio d'azione

La reazione PAS (Acido periodico-reattivo di Schiff) è un metodo che si utilizza per la

dimostrazione del glicogeno, polisaccaride non legato a proteine. È basata sull’azione ossidante

dell’acido periodico sui gruppi 1-2 glicolici presenti nei residui di glucosio dando origine ad aldeidi.

I gruppi aldeidici reagiscono con il reagente di Schiff (fucsina chiarificata), dando luogo a un nuovo

composto rosso magenta. Tale composto può essere osservato al microscopio ottico e le sostanze

che reagiscono vengono dette PAS positive. Poiché nelle cellule sono presenti anche altre sostanze

PAS positive, la presenza di glicogeno può essere accertata trattando sezioni di un medesimo

campione, in parte, direttamente con la reazione PAS, in parte, con enzimi glicogenolitici (amilasi

salivare) e successivamente con la reazione PAS. In caso positivo la ptialina contenuta nella saliva,

come anche gli altri enzimi, inducono negatività della reazione PAS per effetto della scissione del

glicogeno.

INDICE DI RIFRAZIONE

• definizione

• dispersione

• assorbimento

La rifrazione consiste in una deviazione della traiettoria delle onde al passaggio da un mezzo ad un

altro. La variazione di traiettoria è prodotta dalla variazione della velocità di propagazione delle

onde nei due mezzi.

L'indice di rifrazione è una grandezza che indica quanto un mezzo modifica la velocità di un certo

tipo di onde. Nell’accezione più comune il termine si riferisce alla rifrazione delle onde

elettromagnetiche e in particolare della luce. In tutti i sistemi reali l'indice di rifrazione varia con

la frequenza dell'onda incidente, e per la legge di Snell a frequenze diverse corrispondono angoli

di rifrazione diversi. Un esempio ben noto di questo fenomeno è il fatto che la luce bianca

(contenente tutte le componenti spettrali) viene scomposta da un prisma.

SEZIONI SEMIFINI

• utilizzo

• preparazione

• colorante utilizzato

Si tratta di sezioni tagliate con una tecnica che facilita la scelta di aree da utilizzare per le sezioni

fini. Vengono colorate a 40° con il Blu di toluidina ed ottenute utilizzando lame di vetro provvisto

di vaschette contenenti acqua distillata per facilitarne la distensione. La sezione è dello spessore di 1

micron e viene adagiata su di una goccia di acqua distillata posta su un vetrino. La sezione viene

asciugata ponendo il vetrino su una piastra metallica riscaldata a 60°. Dopo la completa

evaporazione dell’acqua, la sezione semifina viene colorata. Per la colorazione una goccia di blu di

toluidina viene posta sopra la sezione e lasciata agire, per circa un minuto, mantenendo il vetrino

sulla piastra riscaldata a 60°C fino alla comparsa dei fumi. Il colorante in eccesso è rimosso lavando

il vetrino in acqua corrente e poi in acqua distillata. La sezione, disidratata per evaporazione su

piastra riscaldata, è montata con il balsamo del Canadà.

METODO DI GOMORI

• scopo principale

• componenti della soluzione

• rivelazione del precipitato

• impiego

Il metodo Gomori viene utilizzato per dimostrare l’attività della fosfatasi acida. Per fare ciò le

sezioni vengono fissate in formalina in una soluzione che contiene sodio glicerofosfato e nitrato di

piombo. Se la fosfatasi è attiva essa idrolizza il glicerofosfato, si liberano ioni fosfato e questi

reagiscono con il nitarto di piombo. Si va così a formare un precipitato elettrondenso di fosfato di

piombo,non colorato. Per permettere la visualizzazione di questo precipiatato lo immergiamo in una

soluzione di solfuro di ammonio che reagisce con il fosfato di piombo dando un precipitato nero.

Questo metodo viene applicato ad esempio per individuare i lisosomi che contengono la fosfatasi

acida.

TAMPONI

• Definizione

• Caratteristiche

• Impieghi

Il tampone è una soluzione che si oppone alla variazione del pH per aggiunta di acidi o di basi. Può

essere usato come diluente (PBS o tris-HC1 con aggiunta di una proteina o di un siero non immune

per bloccare o stabilizzare la soluzione di Ab), tampone lavaggio (PBS o Tris-HC1) e tampone di

risciacquo. I 3 tamponi più comuni sono: il tris 0,05M pH 7.6, il PBS che secondo le nostre

esigenze può essere preparato con diverse molarità o pH e la soluzione salina fisiologica (0.9%).

Questi possono essere usati in combinazione come diluizione 1:10 di Tris in soluzione fisiologica o

tris in PBS. È importate considerare nella scelta di un tampone, se questo contenga o meno azide

(NaN3), un agente antibatterico impiegato per conservare tamponi commerciali. Ad elevate

concentrazioni l'azide sodica può prevenire il legame con l'enzima perossidasi al suo substrato e

inibire così lo sviluppo della reazione immunoistochimica, quindi potremmo avere una positività

dell’antigene debole o assente.

PREPARATI PER MICROSCOPIA

• Esecuzione

• Sparaffinazione

• Colorazione

• Montaggio vetrini

Per poter studiare un campione al microscopio abbiamo bisogno di prepararlo alla lettura al

microscopio, i passaggi sono tanti e complessi e saltarne anche solo uno comporterebbe la lettura

sbagliata o la non lettura del campione. Dopo la fissazione, la disidratazione, l'inclusione in

paraffina il campione è pronto per essere sezionato. La sezione di uno spessore di pochi micron

posta sul vetrino deve subire un processo di sparaffinatura che serve a eliminare la paraffina e a

idratare nuovamente il campione, sarebbe altrimenti impossibile colorarlo. La sparaffinatura

avviene immergendo il vetrino in scale discendenti di alcool e infine sotto acqua corrente, a questo

punto il campione è pronto per la colorazione: la colorazione è un procedimento che aumenta il

contrasto presente fra le diverse strutture cellulari, tale da permettere il riconoscimento delle sezioni

istologiche. La colorazione dei tessuti viene utilizzata usando miscele di coloranti che colorano più

o meno selettivamente i vari componenti del tessuto. La maggior parte dei coloranti, usati negli

studi istologici si comportano come composti acidi o basi ed hanno la tendenza a formare legami

elettrostatici con i radicali reattivi dei tessuti. I componenti tessutali che si colorano facilmente con i

coloranti basici vengono detti basofili al contrario di quelli che si colorano con coloranti acidi che

vengono chiamati acidofili. Tra tutti i coloranti la miscela Ematossilina- Eosina è la più usata. Molti

altri coloranti sono utilizzati nelle differenti procedure istologiche. Il campione, una volta colorato

dovrà essere coperto con un vetrino copri-oggetto con interposta una goccia di alcune resine

naturali. È quindi pronto alla lettura.

GLUTARALDEIDE

• definizione

• campo di applicazione

• vantaggi (conservazione mitocondri, nuclei e alcuni enzimi)

• svantaggi (costo, poca fissazione delle membrane)

La glutaraldeide (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO) si trova in commercio in forma liquida, in soluzione

al 25% o al 50%. È di consistenza oleosa e di odore dolciastro e viene impiegata nella fissazione di

tessuti destinati ad indagini ultrastrutturali. Spesso in combinazione con la formina o la

paraformaldeide essa, ha sulle proteine un’azione analoga alla formalina. È utilizzata nella

fissazione per vapore poiché è piuttosto volatile e nella fissazione per la microscopia elettronica.

Nei confronti dei lipidi ha un'azione conservante non fissante. Le soluzioni di glutaraldeide, devono

essere conservate in frigorifero a 4° C e al riparo dalla luce, diluite in tampone fosfato a pH 7,2-7,4.

I frammenti di tessuto di dimensioni ridotte, devono essere fissati per periodi non superiori alle 4

ore. Il vantaggio di questo fissat