Lezioni, Anatomia Patologica

Siti antigenici

• Definizione
• Tecniche che li hanno come bersaglio (immunoistochimica)
• Svantaggi
• Unmasking

I siti antigenici, o determinanti antigenici, sono regioni di antigeni costituite o da aminoacidi o da monosaccaridi, che vengono riconosciute dall’anticorpo, a cui esso si lega in modo specifico. Sfruttando la capacità di ogni Ag di reagire con determinato Ab possiamo verificare la presenza di Ag in un tessuto e quindi di fare delle indagini immunoistochimiche. La sola formazione del legame Ag/Ab non basta, bisogna avere dei sistemi di rivelazione e per questo possiamo ad esempio marcare l’anticorpo con un fluorocromo, il quale quando si legherà all’antigene emetterà fluorescenza o utilizzare degli enzimi, quali ad esempio la perossidasi o la fosfatasi, che vanno a reagire con un substrato e permettono al cromoforo a cui sono legati di emettere il segnale. Quindi queste reazioni sono altamente specifiche e sensibili, ma hanno uno svantaggio: spesso a causa del mezzo di fissazione che abbiamo utilizzato (es. formalina) i siti antigenici non sono accessibili all’anticorpo, restano mascherati. Per questo dobbiamo ricorrere a delle tecniche di smascheramento (unmasking) che possono essere ad esempio il trattamento con enzimi proteolitici, quali la tripsina o le pronasi (molto più aggressive e quindi meno indicate) o con il calore.

Ematossilina

• Definizione
• Scopo d'utilizzo
• Tipologie (soluzioni di lavoro)
• Colorazioni ematossilina/eosina
• Colorazione di Van Gieson

L’ematossilina è una sostanza estratta dal legno di Campeggio, si presenta sottoforma di cristalli giallo-bruni solubili in acqua ed alcool ed è utilizzata come colorazione istomorfologica di routine. In realtà il vero colorante è il suo prodotto di ossidazione che si ottiene aggiungendo all’ematossilina un mordente. È un colorante basico e quindi colora in particolar modo i nuclei di viola scuro e viene solitamente abbinata ad un colorante acido, che è l’eosina che invece colora il citoplasma e le altre sostanze intracellulari di un colore rosa. Esistono diverse preparazioni di ematossilina: ematossilina di Carazzi (ha il pregio di colorare in circa 10 minuti), ematossilina di Mayer (si conserva per lungo tempo e colora in pochi minuti) e quest’ultima viene combinata con l’eosina. Oltre che per evidenziare il nucleo della cellula, l’ematossilina Mayer può essere impiegata nella colorazione di Van Gieson per la differenziazione delle fibre connettivali, in cui si combina con fucsina e acido picrico per ottenere nuclei (blu/neri), fibre collagene rosse, fibre muscolari e citoplasma gialli.

Fissazione

• Definizione
• Scopo d’utilizzo
• Fissativi chimici
  • Fissativi semplici
  • Miscele fissative

La fissazione consente la conservazione di cellule e tessuti in modo adatto all’allestimento di preparati istologici e citologici. Gli effetti principali sono: blocco dei componenti cellulari in uno stato il più possibile simile a quello reale, permettere al campione in esame di sopportare tutti gli stress fisici e chimici a cui il campione va incontro durante i processi istologici (disidratazione, inclusione, taglio), mantenere lo stato di reattività e riproducibilità il più ottimale possibile dopo il taglio. I fissativi chimici vengono classificati in semplici e miscele fissative. Quelli semplici si usano da soli, e sono formaldeide (viene usata per la fissazione di proteine e non dissolve i lipidi); glutaraldeide (usata per fissare tessuti per indagini ultrastrutturali); alcol etilico mediocre fissativo perché tende a indurire i tessuti; alcol metilico; tetrossido di osmio; bicromato di potassio; cloruro di mercurio; acido acetico glaciale; acido picrico. Le miscele fissative sono composte da più fissativi semplici, possono essere acquose o alcoliche e comprendono: liquido di Bouin, liquido di Carnoy, liquido di Bouin-Hollande.

DAB

• Definizione
• Caratteristiche chimico/fisiche
• Applicazioni: Istochimica (perossidasi), immunoistochimica
• Vantaggi/svantaggi

La 3-3’-diaminobenzidina (DAB) è un cromogeno che può essere utilizzato in associazione al perossido di idrogeno per dimostrare l’attività dell’enzima perossidasi. In presenza di perossidasi infatti il composto H₂O₂/ DAB, viene ossidato dando luogo ad un precipitato elettrondenso che permette la localizzazione dell’attività delle perossidasi sia al microscopio ottico che a quello elettronico. Altro impiego della DAB è quello di essere utilizzato come rivelatore della perossidasi con cui viene marcato l’anticorpo secondario, nel metodo indiretto per la rivelazione di un antigene. La DAB così ossidata dal perossido di idrogeno che reagisce sempre con la perossidasi, dà luogo a un prodotto insolubile e colorato di bruno. Vantaggi dell’utilizzo della DAB sono che è stabile e che è utile nella conservazione a lungo tempo dei vetrini. Ha però lo svantaggio di dare una colorazione bruna che può sovrapporsi al colore bruno presente naturalmente in alcuni elementi cellulari come ad esempio la melanina. Quindi nel caso ci trovassimo a dover analizzare un melanoma dovremmo ovviare a questo problema utilizzando come cromogeno l’AEC che invece dà un prodotto di ossidazione rosso.

Potere di risoluzione

• Definizione
• Campo di applicazione
• Differenze nei vari microscopi

Il potere di risoluzione di un microscopio è la capacità di farci osservare due punti molto vicini come separati (risolvere=separare), serve quindi per darci un’immagine più nitida. È descritto dalla λ/nα, formula: sen dove λ sta per la lunghezza d’onda, n è l’indice di rifrazione del materiale interposto tra campione e lente ed α è il grado di apertura angolare dell’obiettivo. Quindi il potere di risoluzione è limitato dalla diffrazione. È per tale motivo che i microscopi ottici hanno un potere di risoluzione inferiore rispetto ai microscopi elettronici perché la luce ha una lunghezza d’onda maggiore rispetto a quella degli elettroni e quindi subisce di più il fenomeno della diffrazione.

Sezioni

• Definizione
• Scopo
• Tipi (semifini/ultrasottili)
• Tecniche per ottenerle
• Tecniche di contrasto

Ogni qual volta dobbiamo analizzare un tessuto questo subisce delle operazioni di fissazione, disidratazione e di inclusione in mezzi che poi ci permettono di effettuare dei tagli per ottenere delle sezioni che poi possiamo preparare per l’esame microscopico. A seconda del tipo di esame possiamo aver bisogno di creare sezioni semifini o sezioni ultrasottili. Le sezioni semifini (spessore di un micron) sono ottenute utilizzando lame di vetro che sono provviste di una vaschetta che contiene acqua distillata per facilitare poi la distensione della sezione che verrà raccolta su un vetrino portaoggetto. La sezione viene poi colorata con blu di Toluidina, montata con il balsamo del Canada ed è pronta per l’esame al microscopio elettronico. Per quanto riguarda invece le sezioni ultrasottili (spessore 800-900 Å) queste vengono ottenute a partire da sezioni semifini con base di 2 mm con la lama di diamante. Queste vengono poi raccolte su un retino di nichel o di rame, asciugate in capsula di Petri e colorate con citrato di piombo e acetato di uranile. Le reticelle vengono poi osservate al microscopio elettronico a trasmissione convenzionale.

Tetrossido di osmio

• Definizione
• Principio d'azione
• Conservazione
• Campo d'applicazione

Il tetrossido di osmio (OSO₄) è un fissativo che si presenta sotto forma di cristalli giallo-oro volatili ed idrosolubili, è utilizzato in soluzione acquosa a bassa percentuale. È un fissativo elettivo per la microscopia elettronica ed è impiegato nella post-fissazione dei tessuti trattati con glutaraldeide. L’ossido di osmio prodotto dalle reazioni, è responsabile del colore nero assunto dai tessuti fissati. Con le proteine si comporta come fissatore non coagulante, mentre con i lipidi va a reagire con le molecole dove sono presenti i gruppi etilenici. Ha un potere di penetrazione molto ridotto (0.5 mm in 12 h), ha un’elevata deteriorabilità chimica, è altamente volatile e deve essere utilizzato sotto cappa con filtri di carbone, ha un costo elevato ma è considerato un ottimo fissatore citologico e dei lipidi.

Paraffina

• Definizione
• Caratteristiche fisiche
• Scopo d'utilizzo
• Parametri di qualità

È una miscela di idrocarburi saturi ad alto PM; la paraffina raffinata è di colore bianco, traslucido, inodore, untuosa al tatto, insolubile in acqua e alcol. Essa si presenta solida a temperatura ambiente ma ha un punto di fusione compreso tra 40° e 70° anche se viene usata quella con p.f. intorno ai 56°C. La paraffina viene impiegata per includere i campioni di tessuto che poi verranno sottoposti a taglio, proprio allo scopo di rendere il tessuto più compatto così da poter avere sezioni sottili. Possono essere pure o addizionate di DMSO che la rende più elastica al taglio. La qualità della paraffina può essere valutata in base a: tempo di liquefazione, aspetto limpido allo stato liquido, elasticità al taglio, mantenimento dell’integrità se cambia la temperatura (non si devono formare screpolature), stabilità di conservazione nel tempo.

Danno cellulare

• Definizione di danno cellulare
• Classificazione del danno cellulare
• Patogenesi dell'ipossia
• Risposta cellulare all'ischemia

Il danno cellulare è un evento che si verifica quando la cellula subisce uno stress e non riesce ad adattarsi. Può essere distinto in ipossico ed ischemico: ipossico se è dovuto ad una riduzione dell’apporto di O₂ ma con nutrienti invariati, ischemico se si ha mancato apporto sia di O₂ che di nutrienti in un dato tessuto. L’ipossia porta ad un blocco della respirazione cellulare con conseguente squilibrio energetico e si distingue in: ipossica (o respiratoria), anemica, ischemica, stagnante e istotossica. L’ischemia, invece, determina una sofferenza dei tessuti colpiti di entità proporzionale al grado ed alla natura del deficit di irrorazione, nonché alla suscettibilità del tessuto (neuroni e cardiomiociti i più suscettibili); si può distinguere in calda, quando l’organo è privato dell’apporto ematico ma è a temperatura corporea e fredda quando l’organo viene posto e conservato al freddo. La cellula risponde all’ischemia con: una modificazione delle pompe Na+/K+ dovuta ad una deplezione di ATP, che porta all’ingresso di Na+ e H₂O, cui consegue il rigonfiamento cellulare e l’apoptosi, ed un conseguente aumento di Ca²⁺ citosolico, con attivazione delle fosfolipasi e modificazione della permeabilità delle membrane, culminante nella necrosi.

Metallografia

• Definizione
• Scopo del suo utilizzo
• Microscopio elettronico a scansione
• Componenti del microscopio
• Trattamento del campione

La metallografia consiste nel rivestire di uno strato metallico il campione fissato, in modo da renderlo visibile al microscopio. Il microscopio utilizzato è quello elettronico a scansione, il quale sfrutta la generazione di una fascio di elettroni nel vuoto, che viene focalizzato da un sistema di lenti e deflesso fino all’area del campione. Quando il fascio di elettroni colpisce il campione, gli atomi di superficie liberano elettroni e si genera un’immagine tridimensionale in scala di grigio, visibile sul monitor. I metalli utilizzati per rivestire il campione sono soluzioni di sali di metalli pesanti, quali uranio e piombo, i quali vanno a legarsi rispettivamente alle membrane ed al nucleo, aumentando l’elettrondensità.

Ipossia

• Definizione
• Distinzione tra ipossia e ipossiemia
• Tipi di ipossia

Per ipossia si intende una riduzione dell’apporto di O₂ ai tessuti anche se i nutrienti rimangono costanti. Questa situazione avviene nei casi in cui si verifica una diminuita capacità di trasporto di O₂ (intossicazione da monossido di carbonio; anemie ed emorragie gravi) o durante il blocco della catena respiratoria intramitocondriale (ipossia citotossica). Se invece la carenza di ossigeno si riflette nel sangue, è definita ipossiemia. L’ipossia può essere di vari tipi: istotossica se vi è la riduzione della capacità dei tessuti di utilizzare l'ossigeno per inibizione del sistema enzimatico cellulare di ossido-riduzione a causa di avvelenamenti da cianuro o monossido di carbonio; ipossica se si verifica la diminuzione della quantità di ossigeno disponibile per la reazione con l'Hb, quindi ci sarà una diminuita tensione parziale dell'O₂ nell'aria alveolare (ipoventilazione polmonare) con alterazioni della perfusione; anemica nel caso della diminuzione del trasporto di O₂ nel sangue, cioè diminuzione dell'Hb a causa di anemie e alterazioni dello stato di ossidazione dell’Hb. Ischemica/stagnante se la quantità di O₂ che si fissa alle emazie è normale, ma l’O₂ non arriva ai tessuti a causa di un ostacolo al flusso arterioso (ischemica) oppure un ostacolo al deflusso (stagnante).

Fissativi fisici

• Definizione
• Tipi di fissativi fisici
  • Calore
  • Congelamento
  • Essiccazione
• Vantaggi e svantaggi

La fissazione consente di conservare le cellule ed i tessuti in modo idoneo per l’allestimento di preparati citologici ed istologici. Gli effetti della fissazione sono quelli di bloccare tutti i costituenti cellulari e tessutali del campione biologico in uno stato che si avvicini il più possibile a quello vitale e consentire al campione in esame di sopportare gli stress fisici e chimici necessari per i processi istologici, pur mantenendo un buon grado di reattività. Tra i tipi di fissativi troviamo quelli fisici rappresentati da: calore, essiccazione e sistemi di congelamento. La fissazione mediata dal calore si ottiene utilizzando il calore come agente principale o come coadiuvante. La più semplice fissazione con il calore è la bollitura che non preserva alcuna struttura e quindi non è utilizzabile in istologia oppure il passaggio del vetrino col il preparato sulla fiamma. L'utilizzo del calore come coadiuvante di liquidi fissativi è molto frequente poiché agevola la penetrazione dei fissativi chimici nei tessuti biologici. L’essiccazione è un metodo di fissazione che consiste nel lasciare essiccare all'aria a temperatura ambiente i vetrini citologici strisciati che vengono poi colorati con il metodo di May-Grunwald. La criopreservazione si può ottenere in diversi modi che vanno dall’abbassamento della temperatura, all’utilizzo di CO₂ o gas liquidi, o addirittura miscele di raffreddamento. È necessario trovare la temperatura ideale perché il congelamento non alteri le membrane. La fissazione eseguita con il semplice abbassamento della temperatura si usa soprattutto nel congelamento di biopsie per esami intraoperatori: il congelamento viene eseguito ponendo i frammenti in camere fredde, a temperature che variano generalmente tra i -15 e i -30 °C. Oggi il congelamento si ottiene usando in vario modo l'azoto liquido, semplicemente immergendovi i frammenti, o mediando la penetrazione del freddo con l'utilizzo di alcool inerti.

Microscopio ottico

• Definizione
• Potere di risoluzione
• Componente ottica
• Componente meccanica

Il microscopio è uno strumento che permette di rendere visibili dettagli più piccoli che il nostro occhio non può vedere. Compie quindi 2 azioni fondamentali. Prima di tutto c’è l’ingrandimento che è dato dalla presenza di un obiettivo, che è una lente posta vicino l’oggetto e di un oculare, che è una lente vicino all’occhio. L’obiettivo proietta un’immagine intermedia ingrandita e l’oculare la ingrandisce ulteriormente. Quindi l’ingrandimento totale è dato dall’obiettivo e dall’oculare. Oltre all’azione di ingrandimento il microscopio compie l’azione di risoluzione: separa due punti molto vicini. Il potere risolvente del microscopio è infatti misurato dalla minima distanza che separa due punti o due linee vicine ma ancora distinguibili ed è influenzato dall’apertura numerica (n sin α) dove n è l’indice di rifrazione del materiale presente nello spazio tra campione e lente ed α è il grado di apertura angolare dell’obiettivo. Per quanto riguarda il MO il suo potere di risoluzione è di 0.2 micrometri. Altro componente essenziale del MO è il condensatore che ha il compito di raccogliere la luce proveniente dal sistema di illuminazione e concentrarla a raggi paralleli sul campione e può essere controllato attraverso un diaframma. La parte meccanica invece serve sia da sostegno (tavolino portaoggetti) e sia per regolare ad esempio la messa a fuoco perché è provvista di manopole macro- e micrometriche.

Miscele fissative

• Definizione
• Utilizzo
• Fattori che influenzano la scelta del fissativo
• Tipi di fissativo

Si definiscono miscele fissative quelle soluzioni composte da due o più fissativi primari, che interagendo tra loro favoriscono la penetrazione del fissativo nel tessuto o aiutano a smascherare o esaltare alcuni elementi cellulari. Nella composizione delle miscele fissative è necessario tenere in considerazione il pH della soluzione definitiva. Le miscele fissative possono essere acquose o alcoliche, le prime sono le più utilizzate, in quanto garantiscono una più facile penetrazione e fissazione degli elementi cellulari rispetto alle seconde.