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Laboratorio di preparazioni estrattive e sintesi dei farmaci - nozioni

Appunti per il Laboratorio di preparazioni estrattive e sintesi dei farmaci della professoressa Monforte su questi temi: riscaldamento con riflusso, cristallizzazione, filtrazione, estrazione con imbuto separatore, anidrificazione, utilizzo dell'evaporatore rotante, preparazione di un campione di analisi.

Esame di Laboratorio di preparazioni estrattive e sintesi dei farmaci docente Prof. A. Monforte

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ESTRATTO DOCUMENTO

2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

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PREPARAZIONE DI UN TUBO NMR

La preparazione del campione e del tubo NMR è fondamentale per ottenere spettri

interpretabili e derivare le informazioni necessarie alla attribuzione dei segnali e alla

identificazione della struttura molecolare.

A questo scopo devono essere osservate alcune istruzioni generali:

1) usare tubi puliti ed asciutti (tracce di acetone o H O

2

vengono rilevate nello spettro NMR)

2) Se possibile, la quantità di campione non deve essere <10

mg. E’ preferibile preparare campioni concentrati, 20-30

mg di campione in 0.5-0.75 ml di solvente deuterato.

3) usare solo solventi deuterati. In laboratorio verrà usato

principlamente il cloroformio deuterato (CDCl )

3

4) Il livello del solvente deuterato nel tubo NMR deve arrivare

a 3-5 cm di altezza come mostrato in figura

5) La soluzione deve risultare omogenea, senza particelle di

solido sospese, fasi acquose separate o altro. Nei due casi

citati sopra, è necessario filtrare la soluzione o anidrificare

il campione (vedi procedura di microanidrificazione)

6) il riferimento TMS sarà già contenuto nella bottiglia di

solvente deuterato.

7) fare attenzione a non inquinare la bottiglia di solvente

deuterato

8) etichettare il tubo NMR con una striscia di carta forata (non usare adesivi, non scrivere

in pennarello sul tubo) dove indicare: nome e cognome, sigla (iniziali-numero

esperienza-pagina del quaderno, tipo di analisi), disegno struttura prodotto atteso. Per

1

esempio: Giulio Natta (GN_esp1_4_ H-NMR), dietilfumarato.

9) trasportare il tubo mettendolo in un beaker o in una beuta.

I tubi NMR sono riutilizzabili e per questo devono essere lavati accuratamente per non

contaminare il campione successivo con residui del campione precedente e tracce di

solvente di lavaggio. Il tubo deve essere quindi svuotato nel recipiente adibito allo

smaltimento di solventi clorurati e quindi lavato almeno 3 volte con acetone e ancora

lavato nella apparecchiatura di lavaggio per tubi NMR sistemata sotto cappa. Il tubo viene

asciugato con un flusso di aria applicato attraverso un capillare in plastica ed

eventualmente messo in stufa a 50 °C per almeno 1 ora.

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PREPARAZIONE DI UN CAMPIONE PER ANALISI IR

La preparazione del campione per l’analisi IR dipende dallo stato fisico del campione:

per campioni liquidi

si utilizzando due dischi di NaCl

- I dischi vanno presi solo dal bordo cercando di non toccare direttamente la supercie

- (immagine 1) Pulire la superficie dei dischi con alcune gocce di cloruro di metilene o

etanolo e un fazzolettino di carta morbida, con attenzione cercando di non graffiarla.

non usare mai acqua per pulire i dischi di NaCl

- appoggiare i dischi su un fazzolettino di carta morbida sotto cappa e applicare sulla

- superficie di uno dei due dischi 1 o 2 gocce del liquido (anidro) (immagine 2).

coprire il disco caricato con il liquido con l’altro disco in modo che il campione si

- distribuisca su tutta la superficie (immagine 3).

quindi posizionare la coppia dei dischi nel contenitore apposito e fermare le viti di

- tenuta (almeno due e opposte) in modo da fissare il sistema ma senza troppa forza per

non danneggiare i dischi.

posizionare la cella così realizzata nello spettrofotometro e registrare lo spettro.

- alla fine pulire i dischi come descritto sopra (immagine 4).

- 1 2 3 4

campione solido

è necessario avere a disposizione: 1 mortaio, 1 pestello, KBr in polvere anidro, 1

- pastigliatore (immagine 1)

pesare 50-100 mg di kBr e 1 o 2 mg di campione e metterli nel mortaio. Trattare la

- miscela solida con un pestello fino a renderla omogenea. (immagine 2)

trasferire la miscela nel pastigliatore e stringere la vite, quindi trasferire il pastigliatore

- nella pressa (immagine 3)

la pastiglia deve essere rimossa con attenzione dal pastigliatore per non romperla e

- non deve essere opaca per registrare uno spettro interpretabile.

lavare tutto con acqua e acetone e asciugare bene.

- 1 2 3

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PREPARAZIONE DI UN CAMPIONE per TLC e GC-MS

Tecniche cromatografiche vengono generalmente utilizzate sia per applicazioni analitiche

per: (i) seguire il decorso della reazione, (ii) determinare l'identita' e la purezza del

prodotto che preparative per: separare miscele di componenti. In laboratorio verranno

la cromatografia su strato sottile (TLC,

utilizzate per scopi analitici due tecniche principali:

thin layer chromatography) e la gas cromatografia (GC) abbinata alla massa (GC-MS). La

prima è adatta a composti solidi o liquidi con punto di ebollizione relativamente elevato; la

gas cromatografia, al contrario, e' particolarmente indicata per composti volatili. La

cromatografia su strato sottile (TLC) e' il metodo piu' comunemente usato per a) saggiare

la purezza di un composto; b) identificare un prodotto noto in una miscela; c) seguire e

verificare l’andamento di una reazione chimica. Verranno utilizzate lastrine di gel di silice

contenenti un indicatore fluorescente che permette la visualizzazione degli eluiti per

esposizione della lastra sviluppata alla luce UV. Alternativamente gli eluiti possono essere

rivelati trattando la lastrina con un opportuno reattivo (iodio, 2,4-dinitrofenilidrazina,

KMnO4, acido fosforomolibdico).

Procedura:

in una provetta da saggio contenente circa 0.5 ml di eluente (o solvente volatile quale cloroformio o

-

cloruro di metilene) introdurre 2 gocce di miscela di reazione, oppure 1 goccia, introdotta con un capillare, di

composto liquido, oppure qualche cristallo di solido preparare nello stesso modo i campioni contenenti i

reagenti di riferimento

sulla lastrina di silice a circa 1-2 cm dal bordo si segna in matita una riga e alcuni punti con sigle di

-

riconoscimento. In corrispondenza di questi punti si caricano le soluzioni di riferimento e quella relativa alla

miscela da analizzare.

la lastrina viene posta nella camera di eluizione contenente l’eluente (10 ml). E' necessario provare

-

alcuni eluenti diversi (solventi puri o piu' comunemente miscele di solventi di diversa polarita', per es. etere

di petrolio/etere etilico, in diverse proporzioni) per poi scegliere l'eluente ottimale per la separazione dei

componenti la miscela di reazione.

Per capillarità il solvente sale sulla lastrina eluendo il composto organico. La diversa interazione del

-

composto organico con il solvente e con la fase stazionaria (silice) determinerà una diversa velocità di

eluizione e una diversa posizione della macchia relativa al composto sulla lastrina di silice, determinata

che per una definita miscela di eluente, è specifico per ogni sostanza organica (Rf =

misurando il valore di R f

distanza percorsa dall'eluito/distanza percorsa dal fronte dell'eluente).

Quando il fronte del solvente ha raggiunto ¾ della lastrina, la TLC può essere tolta dalla camera, il fronte

-

del solvente viene segnato con una riga a matita e la TLC viene asciugata.

le macchie sono generalmente visualizzate sotto la lampada UV (ricordarsi di indossare gli occhiali di

-

protezione) e segnate in matita. Sul quaderno di laboratorio devono essere riportate le condizioni di

eluizione (composizione della miscela di eluenti in percentuale) e il valore di Rf dei vari componenti presenti

nella miscela di reazione analizzata. R = a/b

f

a= distanza dal centro della macchia alla base

-

di eluizione segnata con una riga in matita

- b= distanza percorsa dal fronte del solvente

non troppo concentrati possono

I campioni risultati adatti alla analisi TLC e quindi

essere utilizzati per l’analisi GC-MS. Vedi istruzioni nell’appendice.

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ESPERIENZE

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ESPERIENZA N° 1: ISOMERIZZAZIONE DEL DIETILMALEATO

O

O C

H O

3

O H

CH

H 3 I 2

riscaldamento a

riflusso

H H O C H

O CH 3

3 O

O Dietil fumarato

Dietil maleato

Materiali:

• pallone da 100 mL ad un collo, cono 26

• refrigerante a bolle

• mantello riscaldante piccolo

• materiale per analisi cromatografica su strato sottile (TLC)

• dietil maleato (10 g)

• iodio (0.1 g)

• soluzione al 10% di tiosolfato sodico

• cloruro di metilene

• etere di petrolio

• solfato di magnesio anidro

Procedura

• Prelevare con una pipetta graduata un volume di maleato di etile corrispondente a 10

g (da calcolare nella scheda PRE-LAB), metterlo in un pallone da 100 mL e

aggiungere quindi 0.1 g di iodio (pesato sulla bilancia tecnica)

• Collegato il refrigerante a bolle ed il mantello riscaldante, aprire l’acqua di

raffreddamento e portare all'ebollizione il contenuto del pallone (ATTENZIONE! il dietil

maleato bolle a temperatura elevata, controllare e inserire il dato nella scheda PRE-

LAB). Lasciare a riflusso per 60 minuti

• Predisporre l’occorrente per l’analisi TLC: preparare in un cilindro graduato 10 mL di

eluente (etere etilico:etere di petrolio=50:50), e preparare in provette da saggio i

campioni di riferimento relativi al reagente di partenza ed al prodotto atteso.

• Trascorsi i 60 minuti di riscaldamento, rimuovere il mantello riscaldante e lasciare

raffreddare il pallone ed il suo contenuto. Prelevare quindi con una pipetta Pasteur una

goccia della miscela di reazione e trasferirla in una provetta da saggio contente circa 1

mL dell’ eluente preparato per la TLC.

• Eseguire l’analisi TLC caricando su una lastrina la soluzione della miscela di reazione

preparata al punto precedente e i composti puri di riferimento, cioè il reagente (dietil

maleato) ed il prodotto di reazione.

• Una volta eluita la lastrina cromatografica, visualizzare le macchie mediante lampada

UV, calcolare gli R relativi ai diversi composti, e verificare se la reazione è andata a

f

completezza.

• Trasferire tutta la miscela di reazione in un imbuto separatore da 250 mL, aggiungere

30 mL di cloruro di metilene [ATTENZIONE!, è essenziale che la miscela di reazione

sia a temperatura ambiente prima dell’aggiunta dell’etere etilico] e 30 mL di una

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soluzione al 10% di tiosolfato di sodio. Agitare vigorosamente l’imbuto separatore

ricordandosi di sfiatare spesso.

• Lasciare separare le fasi; trasferire la fase organica in una beuta da 100 mL,

aggiungere solfato di magnesio anidro, tappare e lasciare anidrificare per almeno 15

minuti agitando saltuariamente.

• Pesare sulla bilancia tecnica un pallone da 100 ml ad un collo cono 26 pulito ed

asciutto. Filtrare la soluzione eterea in questo pallone utilizzando un imbuto con filtro a

pieghe. Rimuovere l’etere all'evaporatore rotante. Dopo aver ben asciugato l’esterno

del pallone, pesarlo sulla bilancia tecnica. Il peso del prodotto viene ricavato per

differenza fra le due pesate.

• Calcolare la resa del prodotto. 1

• Caratterizzare il prodotto mediante spettroscopia HNMR, IR, e spettrometria di

massa. Confrontare gli spettri ottenuti con quelli del reagente di partenza.

Analisi GC-MS

Abundance Scan 43 (3.464 min): FUM4.D dietil maleato

99

800000

750000 condizioni cromatografiche:

700000 = 250°C,

T

650000 injector

600000 T = 280°C

550000 detector

500000 T .= 120°C per 3 minuti

450000 iniz

400000 R= 5°/minuto

350000

300000 T = 200 °C

127

250000 finale

200000 .

tempo di ritenzione= 3.46 min

150000

100000 29 82

50000 54 143

45 71

15 117

39

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

m/z-->

Abundance dietil fumarato

Scan 299 (5.950 min): FU2.D 127 condizioni cromatografiche

200000

180000 = 250°C,

T

injector

160000 T = 280°C

detector

140000 99 T .= 120°C per 3 minuti

120000 iniz

100000 R= 5°/minuto

80000 T = 200 °C

finale

60000 tempo di ritenzione= 3.64 min.

40000 29 55 Spettri IR

82

71

20000 45 143

117

18 157

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

m/z--> 30 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

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a . dietil maleato

dietil fumarato

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1

spettri HNMR

dietil maleato in CDCl

3 2.00 4.02 6.65

9.00 8.50 8.00 7.50 7.00 6.50 6.00 5.50 5 .00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00

ppm (t1)

dietil fumarato in CDCl

3

2.05 5.30 8.07

7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0

ppm (t1) 32 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

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ESPERIENZA N° 2: OSSIDAZIONE DEL CALCONE A CALCONE OSSIDO

O O

O

C H O C

2 2

-

OH

Materiali:

• pallone da 100 mL ad un collo, cono 26

• pipetta graduata

• filtro buchner d=5 cm

• beuta da vuoto da 100 ml

• lastrine TLC e camera di eluizione

• calcone (1g)

• acqua ossigenata 36% (1.5 ml)

• metanolo (10 ml)

• idrossido di sodio (0.6 g; 6 pastiglie)

• acqua deionizzata

• cloruro di metilene

• n-esano o etere di petrolio

Procedura

• Pesare in un pallone da 100 ml (cono 26), munito di ancoretta magnetica, 1g di

calcone. Aggiungere 20 ml di metanolo e raffreddare in bagno di acqua e ghiaccio la

soluzione.

• O al 36% prelevandoli da una buretta

In un piccolo recipiente trasferire 1.5 ml di H

2 2

posta sotto cappa. Con una pipetta pasteur, aggiungere quindi goccia a goccia l’acqua

ossigenata alla soluzione di reazione costantemente raffreddata in bagno di acqua e

ghiaccio. (ATTENZIONE L’H O è un perossido, usare con cautela)

2 2

• O e aggiungere questa

Sciogliere 6 pastiglie di NaOH (circa 0.6 g) in 2 ml di H

2

soluzione goccia a goccia alla soluzione di reazione tenuta in bagno di acqua e

ghiaccio.

• Dopo 10 minuti eseguire una lastrina TLC (eluente CH Cl :n-esano=9:1) per verificare

2 2

il decorso della reazione e usare una cartina amido-iodurata per controllare l’eventuale

presenza di acqua ossigenata non reagita.

• Quando la reazione è decorsa a sufficienza si aggiungono 30 mL di acqua

deionizzata. Si filtra il prodotto su filtro buchner, si lava con acqua deionizzata (2x5

ml).

• Si esegue una lastrina per verificare la purezza del prodotto, utilizzando il reagente

come riferimento (calcolare gli Rf e riportarli nel quaderno).

• Per anidrificare il prodotto, si trasferisce il solido isolato in una beuta da 100 ml (cono

26) e si aggiungono 25 ml di CH Cl . la soluzione viene anidrificata con MgSO anidro

2 2 4

per 15-20 min. e quindi filtrata e trasferita in un pallone da 100 ml (cono 26)

precedentemente pesato. Il solvente viene rimosso all’evaporatore rotante. Calcolare

la resa e caratterizzare il prodotto con spettri NMR, IR e GC-MS.

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Analisi GC-MS 1,3-difenil-2-

Abundance propen-1-one

Scan 1605 (18.622 min): CALCONE1.D (calcone)

207

60000 condizioni

55000 cromatografiche:

50000 T = 220 °C

45000 injector

T = 280 °C

40000 detector

35000 T .= 180°C

iniz

77

30000 isoterma

25000 t. di ritenzione=

131

20000 .

12.00 min

103

15000 179

10000 51

28 89 165

5000 18 63 152

39 191

115

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210

m/z-->

Abundance Scan 1301 (15.668 min): CALCONEE.D

34000 105

32000 1,3-difenil-2,3-

30000 epossi-1-propanone

28000 (calcone ossido)

26000

24000 condizioni

22000 cromatografiche:

20000

18000 T = 220 °C

injector

16000 77 T = 280 °C

14000 detector

12000 T .= 180°C

iniz

10000

8000 isoterma

28

6000 207 .

89 t. di ritenzione= 12.21 min

224

4000 51

18 165

2000 131 196

63

39 179

152

118

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

m/z--> 34 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

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Spettri IR 35 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

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1

spettri HNMR

1,3-difenil-2-propen-1-one (calcone)in CDCl

3

7.863 7.784 7.575 7.257

1.85 0.80 9.00

8.13 8.00 7.88 7.75 7.63 7.50 7.38 7.25 7.13

ppm (t1)

1,3-difenil-2,3-epossi-1-propanone (calcone ossido) in CDCl

3

2.14 9.43 1.17 1.02

8.00 7.50 7.00 6.50 6.00 5.50 5.00 4.50 4.00

ppm (t1) 36 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

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ESPERIENZA N° 3: SINTESI DELL’ACIDO ACETIL SALICILICO (ASPIRINA)

O

O

COOH COOH

CH C

OH 3 H+ O C CH 3

O

+ + CH COOH

3

CH C

3 O

Reazione collaterale

COOH COOH O COOH

HO C O

OH OH +

H

+

Materiali:

• pallone da 100 mL ad un collo, cono 26

• filtro buchner

• beuta da vuoto da 100 ml

• beaker da 100 ml

• lastrine TLC e camera di eluizione

• acido salicilico (2.15 g)

• anidride acetica (5 ml )

• acido solforico (4 gocce)

• NaHCO (25 ml soluzione satura )

3

• HCl 6N

• cloruro di metilene

Procedura

• Pesare in un pallone da 100 ml (cono 26), munito di ancoretta magnetica, 2.15 g di

SO

acido salicilico. Sotto cappa, aggiungere 5 ml di anidride acetica e 4 gocce di H 2 4

concentrato.

• Chiudere con tubo a cloruro di calcio, agitare fino a soluzione del reagente, quindi

munire il pallone di un refrigerante a bolle e riscaldare in bagno di acqua a 60 gradi per

15 minuti.

• Rimuovere il bagno ad acqua e lasciare raffreddare la miscela di reazione a

temperatura ambiente: l’aspirina dovrebbe precipitare spontaneamente. Se questo

non si verifica, grattare le pareti con una bacchetta di vetro non smussata.

• Raffreddare in bagno di ghiaccio e aggiungere 50 ml di H O precedentemente

2

raffreddata in ghiaccio. Filtrare su buchner, recuperare tutto il solido nel pallone con le

acque madri, infine lavare il solido con due porzioni di acqua ghiacciata da 10 ml.

• Aggiungere il solido grezzo a 25 ml di NaHCO soluzione satura in bicchiere da 100

3

ml, con agitazione

• Attraverso un filtro a pieghe ed imbuto filtrare il materiale insolubile (costituito da

dimero e oligomeri dell’acido salicilico) in un bicchiere da 100 ml, quindi con cautela

acidificare a pH 2-3, con agitazione, la soluzione di bicarbonato con HCl 6N.

• L’aspirina precipitata viene recuperata per filtrazione con gooch o buchner, e lavata

con poca acqua deionizzata leggermente acidula con HCl. 1

• Caratterizzare il prodotto con spettri IR e NMR. anidrificare il campione per H-NMR

• Effettuare un’analisi TLC (eluente etere petrolio\acido acetico\etanolo 8\1\1)

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Spettri IR 38 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

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1

spettri HNMR acido o-acetossi

benzoico (acetil

salicilico o aspirina)

in CDCl 3

grezzo di reazione

0.35 2.29 3.00

10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 .0

ppm (t1) acido o-acetossi

benzoico (acetil

salicilico o aspirina)

in CDCl 3

campione purificato

NON anidro

0.80 0.77 0.86 0.65 2.10 3.00

9.00 8.50 8.00 7.50 7.00 6.50 6.00 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00

ppm (t1) 39 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

ESPERIENZA N° 4: RIDUZIONE DEL BENZOFENONE AD ALCOOL

O OH

1) NaBH

C CH

4

2) HCl

Materiali:

• pallone o beuta da 100 mL ad un collo, cono 26

• ancoretta magnetica + agitatore magnetico

• bagno di acqua e ghiaccio

• filtro buchner + beuta da vuoto

• materiale per analisi cromatografica su strato sottile (TLC)

• benzofenone (1.3 g)

• 1 pastiglia NaBH (0.32 g)

4

• metanolo (15 ml)

• soluzione al 10% di HCl (30 ml)

• CH Cl

2 2

Procedura

• Pesare in una beuta da 100 ml (cono 26), munita di ancoretta magnetica, 1.3 g di

benzofenone. Sotto cappa, aggiungere 15 ml di metanolo. Porre la beuta in un bagno

di acqua e ghiaccio e agitare la soluzione fino a dissoluzione del reagente.

• A freddo, aggiungere 1 pastiglia di NaBH mantenendo sotto agitazione la soluzione di

4

reazione. L’agente riducente reagirà lentamente e si noterà evoluzione di gas.

(ATTENZIONE il sodio boro idruro deve essere aggiunto con cautela! la miscela di

reazione non deve riscaldarsi e la reazione con H O produce H !)

2 2

• si è sciolta (impiega circa 30 min.), si rimuove il bagno di

Quando la pastiglia di NaBH 4

acqua e ghiaccio e si lascia sotto agitazione per altri 15 min. Nel frattempo si controlla

il decorso della reazione mediante TLC (eluente CH Cl ). La lastrina viene caricata

2 2

con una soluzione di benzofenone in CH Cl e con una soluzione della miscela di

2 2

reazione realizzata trasferendone 2-3 gocce in una provetta da saggio contenente

CH Cl .

2 2

• Si pone nuovamente la beuta in bagno di acqua e ghiaccio, si lascia raffreddare e si

aggiungono lentamente, con cautela e sotto agitazione 30 ml di HCl al 10%.

• Si filtra il solido che si separa su buchner e si lava con poca acqua fredda .

• Determinare la resa e caratterizzare il prodotto con spettri NMR, IR, GC-MS.

40 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

Spettri IR di reagente e prodotto. (attribuire A e B )

A

B

41 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

Spettri GC-MS

Abundance difenil chetone

(benzofenone)

Scan 444 (7.352 min): BZFEN3.D

105

850000 condizioni

800000 cromatografiche:

750000

700000

650000 T = 220 °C

injector

600000

550000 182 T = 280 °C

detector

500000 .= 150°C x 3min.

T

450000 iniz

77

400000 R= 5°/min.

350000

300000 T = 200 °C

fin.

250000

200000 .

t. di ritenzione= 7.35 min

150000 51

100000

50000 152

28 63

39 126 165

18 91 115 139

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

m/z-->

Abundance difenil metanolo

Scan 448 (7.392 min): BZHYD3.D

105 (benzidrolo)

44000

42000

40000 condizioni

38000 cromatografiche:

36000

34000

32000 T = 220 °C

injector

30000

28000 = 280 °C

T

detector

26000

24000 T .= 150°C x 3min.

iniz

22000

20000 184 R= 5°/min.

18000 77

16000 T = 200 °C

fin.

14000

12000 .

t. di ritenzione= 7.40 min

10000

8000 28

6000 165

51

4000 18 152

2000 39 63 115 139

89 128

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

m/z-->

N.B. se la TLC indica la presenza di benzofenone non reagito, e il solido isolato non è

puro, allora il programma di temperatura da impostare al GC-MS è il seguente:

T = 220 °C T = 280 °C T .= 130°C isoterma.

injector detector iniz

t. di ritenzione= 19.35 min (benzofenone); 20.16 (benzidrolo)

42 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

1

Spettri H-NMR

difenil chetone (benzofenone)

difenil metanolo (benzidrolo) in CDCl

3

10.00 0.86 1.78

10.00 9.50 9.00 8.50 8.00 7.50 7.00 6.50 6.00 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00

ppm (t1) 43 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

ESPERIENZA N° 5: CONDENSAZIONE DI KNOEVENAGEL,

SINTESI DI 3-CARBOETOSSI-CUMARINA

O

O O

CH PIPERIDINA

CH

OCH CH

OCH

2 3 2 3

O O

OH O OCH CH

2 3

Materiali:

• pallone da 100 mL ad un collo, cono 26

• refrigerante a bolle

• mantello riscaldante

• filtro buchner + beuta da vuoto

• materiale per analisi cromatografica su strato sottile (TLC)

• aldeide salicilica (1ml)

• dietil malonato (1.6 ml)

• etanolo 95% (5 ml) e al 50% (circa 10 ml)

• piperidina (4 gocce)

• CH Cl

2 2

Procedura

• Sotto cappa in un pallone da 100 ml (cono 26), introdurre nell’ordine, 1 ml di aldeide

salicilica, 1.6 ml di dietil malonato, 5 ml di etanolo al 95% (preparare 10 ml di una

soluzione costituita da 9.5 ml di etanolo assoluto e 0.5 ml di H O e prelevarne 5), 4

2

gocce di piperidina. (ATTENZIONE la piperidina è tossica, usare cautela, occhiali e

guanti di protezione)

• Munire il pallone di reazione di un refrigerante a bolle e riscaldare a riflusso per 2,5

ore.

• Lasciare raffreddare a temperatura ambiente ed eseguire una lastrina TLC (eluente

Cl ) per controllare il decorso della reazione. Caricare la lastrina TLC con una

CH

2 2

soluzione di aldeide salicilica e con una goccia della soluzione di reazione in CH Cl .

2 2

Eseguire una analisi GC-MS della stessa soluzione usata per caricare la lastrina TLC

e controllare le percentuali di conversione di reagenti e di formazione del prodotto

• Lasciare il pallone di reazione a T ambiente fino al giorno successivo

• Raffreddare il pallone di reazione in bagno di acqua e ghiaccio e decantare la

soluzione dai cristalli di prodotto e trasferirla in una beuta, quindi lavare i cristalli con

una soluzione di etanolo al 50% freddo (3x 3 ml)

• Filtrare il prodotto in un filtro buchner e lavarli ancora una volta con una soluzione di

etanolo al 50% freddo.

• Calcolare la resa sui cristalli isolati e caratterizzare il prodotto con analisi GC-MS, IR

ed NMR. 44 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

Spettri GC-MS

Abundance Scan 47 (3.501 min): CUMIX1.D 122

110000 2-idrossi benzaldeide

(aldeide salicilica)

100000

90000 condizioni

80000 cromatografiche:

70000 T = 220 °C

60000 injector = 280 °C

T

50000 detector

T .= 100°C x 3min.

iniz

40000 R= 10°/min.

30000 = 200 °C

T

fin.

65 93

20000 .

t. di ritenzione= 3.50 min

76

39 104

10000 28 50

18 84

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

m/z-->

Abundance acido propandioico-

Scan 65 (3.676 min): CUMIX1.D

115

120000 dietil estere

(dietilmalonato)

110000

100000 condizioni

133

90000 cromatografiche:

80000

70000 T = 220 °C

injector

60000 = 280 °C

T

29 detector

43

50000 .= 100°C x 3min.

T

iniz

40000 R= 10°/min.

88 T = 200 °C

30000 fin.

60 .

t. di ritenzione= 3.68 min

20000 105

10000 70 160

18 122 145

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

m/z-->

Nelle condizioni di anilisi GC-MS descritte sopra, il prodotto 3-carbossietil cumarina ha un

tempo di ritenzione di 14.99 minuti.

Queste condizioni sono utilizzate per l’analisi della soluzione di reazione.

45 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

Spettro GC-MS di 3-carbossietil cumarina

condizioni cromatografiche:

T = 220 °C, T = 280 °C, T .= 180°C x 3min., R= 5°/min, T = 200 °C

injector detector iniz fin.

.

t. di ritenzione= 7.51 min

Abundance Scan 460 (7.506 min): CUMA1.D

146 173

105000

100000

95000

90000

85000

80000

75000

70000

65000

60000

55000

50000

45000

40000 218

35000

30000

25000 89

20000 118

15000 101

63

10000 28

5000 162

39 75 190

51

18 130

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

m/z-->

spettro IR 46 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

1

spettro H-NMR di 3-carbossietil cumarina in CDCl

3

0.77 3.89 2.00 3.04

9 .0 8 .0 7 .0 6 .0 5 .0 4 .0 3 .0 2 .0 1 .0 0 .0

p p m ( t1 ) 47 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

IDENTIFICAZIONE DI UN COMPOSTO INCOGNITO

MEDIANTE ANALISI SPETTROSCOPICA

Lo scopo dell’esperienza finale è la soluzione di un problema spettroscopico relativo alla

identificazione della struttura di un composto incognito avendo a disposizione:

1 13

- la formula molecolare o l’analisi elementare -lo spettro IR - gli spettri H e C NMR - lo

spetrro di massa

Si suggerisce un approccio sistematico al problema, che consideri i seguenti punti:

1) calcolo della formula molecolare dalle % dell’analisi elementare. Calcolo del peso

molecolare e confronto con lo spettro di massa per l’identificazione dello ione molecolare,

se presente

2) calcolo del grado di in saturazione: per una formula generica C H N O X si applica

C H N O X

la formula seguente I=[(2C+2) – (H-N+X)]/2 dove se

I=1, un doppio legame o un cicloI=2 un triplo legame, 2 doppi legami, 2 cicli, 1 doppio legame +

1 ciclo.; I=4, un anello benzenico

se I>0 allora cercare evidenze della presenza di uno degli elementi di insaturazione quali:

carbonile, carbossile, fenile, doppi o tripli legami, negli spettri forniti

Nello spettro IR assegnare possibili gruppi funzionali contenenti ossigeno o azoto.

3)

Cercare evidenze di insaturazione (aromatici, C=C, C≡C, C=O etc.). Vedi flow-chart

riportato di seguito

1

4) Nello spettro H-NMR assegnare. (i) numero e tipo di protoni alifatici, (ii) numero e tipo

di protoni olefinici e aromatici, (iii) strutture iperfini caratteristiche (etile, isopropile etc), (iv)

δ=

numero e tipo di altri protoni caratteristici (CHO, COOH 9-12), (v) accoppiamenti e

costanti 13

5) nello spettro C-NMR assegnare. (i) numero di carboni non equivalenti, (ii) numero di

diversi tipi di CH -, CH -, CH o C (dallo spettro off-resonance o DEPT), (iii) identificare

3 2

gruppi carbonilici, (iv) identificare carboni insaturi

6) Identificare gruppi funzionali attraverso evidenze multiple e coerenti negli spettri forniti

ad esempio: il gruppo aldeidico CHO deve mostrare assorbimenti caratteristici nello

1 13

spettro IR (C=O, C-H); nello spettro H-NMR (C-H) e nello spettro C-NMR (C=O),

7) tenendo conto delle evidenze raccolte scrivere strutture parziali e accoppiarle in modo

da ottenere possibili ipotesi di struttura

8) identificare tra le diverse strutture proposte, quella più probabile consultando le tabelle

per i chemical shifts e i principali cammini di frammentazione nello spettro di massa.

Stiramento Si

SPETTRO IR Str. O-H ? ACIDI

Si

C=O ?

No No Si AMMIDI

Str. N-H ?

ALCOOLI e Str. O-H ?

Si

FENOLI No Si

Str. C-O ? ESTERI

No

Altri gruppi No

funzionali Due segnali ANIDRIDI

Si

C=O ?

No

Str. C-H ALDEIDI

Si

aldeidico ?

No

CHETONI

48 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

APPENDICE

49 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

Istruzioni per l’uso dello spettrometro NMR Bruker 200 MHz

Per inserire il campione:

togliere il tappo

premere il pulsante arancione e LIFT

inserire il tubo nello spinner misurando l’altezza (18 mm)

appoggiare tubo + spinner sul cuscinetto di aria

premere LIFT OFF per introdurre il campione nel probe

rimettere il tappo

Controllare che il pulsante grigio (in basso a destra) sia su FINE

Premere SPIN

Premere FIELD e centrare la sweep

Premere LOCK

CTRL/D si vede o si toglie la griglia

CTRL/L si può vedere il solo segnale del lock o solo lo spettro o entrambi

OMOGENEITA’

E’ possibile richiamare un file di omogeneità digitando RSH + nome file.SHIM + RETURN

(es. RSH giulio201.SHIM RETURN)

2

Migliorare l’omogeneità con z e z portando il segnale del LOCK quanto più alto possibile

con la manopola. Se il segnale esce dal display abbassarlo con LOCK POWER e/o LOCK

GAIN (lock gain diminuisce il rumore di fondo)

Premere STDBY

L’omogeneità si può ottimizzare sul FID nel modo seguente:

eseguire RGA + RETURN e poi RG + RETURN per valutare la concentrazione del

campione. 2

GS+ RETURN per eseguire scansioni a vuoto e fare l’omogeneità con Z e Z verificando

se il decadimento del FID migliora e se l’area indicata in alto sullo schermo aumenta

Per visualizzare meglio il FID si può agire sui tasti del vertical display + - a sx sulla console

Premere STDBY

Premere CRTL H per terminare le scansioni a vuoto

ACQUISIZIONE

N.B.Si può lavorare indifferentemente su uno dei tre JOB: 1.; 2.; 3.

Se si sbaglia a scrivere un comando usare il pulsante DEL sulla tastiera in basso a destra.

Se si è fatto partire un comando che non si voleva si può provare con CTRL/Q o CTRL/K

(ferma istantaneamente qualsiasi operazione). Se proprio non c’è più rimedio schiacciare

sul PC nell’ordine STOP + CLEAR + DISK. In questo modo rimane il FID dell’ultimo

spettro acquisito.

Premere ESC

Compare la finestra di ACQUISITION PARAMETERS e impostare generalmente:

O1 = 3200 (per CDCl )

3 50 2 0 0 7 - 2 0 0 8 )

C H I

M

I

C A O R G A

N I

C A I

I

I

- M

O D U L O C : l

a b o r a t

o r i

o ( a .

a .

TD=SI = 16K

SW = 2450

PW = 14.2

RD = 1

NS = 8 (o multipli di 8)

RG = tra 1 e 400 (più è diluito il campione e più grande deve essere RG) Si può procedere

ad un calcolo automatico di RG digitando RGA

-----------------------------------------------------------------------------------------------------

N.B. Il valore di NS viene impostato considerando RG (parametro legato alla concentrazione del campione)

RG = 1-8 NS = 8

RG = 8-20 NS = 16

RG = 20-40 NS = 32

RG = 40-80 NS = 64

RG = 80-160 NS = 128- -1(infinito)

-------------------------------------------------------------------------------------------------------

Battere ESC più volte fino a ritrovare il FID

Per acquisire lo spettro digitare ZG RETURN

Quando l’acquisizione è finita compare in alto sul monitor il n° di scansioni eseguite (es.

8/8) Per interrompere l’acquisizione in qualunque momento premere CTRL/H

PROCESSING

Mentre si sta acquisendo lo spettro sul JOB 1 è possibile trasferire le scansioni nel JOB 2

ed elaborarle con la sequenza dei comandi:

TR RETURN 2 RETURN

FT RETURN (si opera la trasformata di Fourier)

EP RETURN) (viene eliminata la parte immaginaria) e compare uno spettro GIALLO

(N.B. In EP usare solo lettere maiuscole, Alfa Lock inserito)

In questa subroutine si usano le quattro manopole in alto a sinistra, A, B, C, D

A: permette di spostare lo spettro da destra a sinistra

B: permette di allargare o restringere lo spettro

C: fa muovere il cursore velocemente verso destra o sinistra

D: fa muovere il cursore lentamente verso destra o sinistra

Inoltre col VERTICAL DISPLAY si aumenta (+) o si diminuisce (-) l’intensità dello spettro

correzione di FASE

con CRTL R si visualizza tutto lo spettro

Per operare la correzione della fase digitare P (o BP). il cursore automaticamente si mette

sul picco più intenso e correggere la fase con la manopola C.

Controllare poi il resto dello spettro ed eventualmente portarsi sull’altro lato e correggere la

fase con la manopola D.

Se con C o D si arriva a fine corsa battere CTRL/C o CTRL/D

Memorizzare la correzione della fase con M.

per allargare nuovamente lo spettro digitare CRTL B

SCALA DI CHEMICAL SHIFT

Assegnare il chemical shift del solvente deuterato o del riferimento TMS

Quindi con C e/o D portare il cursore sul picco del solvente deuterato (es. CHCl )

3

G=7.26) RETURN

Digitare G e assegnare il valore (es. per CHCl

3

Uscire da EP premendo RETURN 51


PAGINE

62

PESO

2.35 MB

AUTORE

Moses

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Moses di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Laboratorio di preparazioni estrattive e sintesi dei farmaci e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Monforte Anna Maria.

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