Laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

Laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

Il Globally Harmonized System of Classification & Labelling of Chemicals (GHS) è un sistema mondiale armonizzato di classificazione e di etichettatura delle sostanze chimiche che ha l'obiettivo di stabilire una base comune e coerente per il pericolo chimico. Serve a facilitare il crescente commercio internazionale, proteggere la salute umana e l'ambiente, uniformare la regolamentazione diversa tra i vari paesi (es. Europa e Stati Uniti) e infine condividere uno standard internazionale di sicurezza.

Pittogrammi

Indicazioni di pericolo e consigli di prudenza sono espressi con le frasi H e P.

• Indicazione di pericolo (Hazard statements): Lettera H + codice a tre cifre
• Consigli di prudenza (Precautionary statements): Lettera P + codice a tre cifre
• Frasi supplementari per criteri solo UE e non GHS: EU + tre cifre (o + il numero della vecchia frase R)

La vecchia classificazione si basa su frasi R (rischio) ed S (sicurezza).

Scheda di sicurezza (MSDS: Material Safety Data Sheet)

Fornisce informazioni esaustive di una sostanza o miscela per l'uso in luoghi di lavoro in 16 punti obbligatori:

1. Identificazione della sostanza e della società produttrice
2. Indicazione dei pericoli
3. Composizione ed informazione ingredienti
4. Misure primo soccorso
5. Misure antincendio
6. Provvedimenti in caso di fuoriuscita accidentale
7. Manipolazione e stoccaggio
8. Controllo dell'esposizione e protezione individuale
9. Proprietà chimico-fisiche
10. Stabilità e reattività
11. Informazioni tossicologiche
12. Informazioni ecologiche
13. Considerazioni sullo smaltimento
14. Informazioni sul trasporto
15. Informazioni sulla regolamentazione
16. Altre informazioni

Flash point di comuni solventi

In questo laboratorio, al contrario di tutti gli altri, useremo dei solventi che possono essere altamente infiammabili ed è per questo che non ci saranno fiamme in laboratorio. Il punto di infiammabilità è la temperatura più bassa alla quale si formano vapori in una quantità tale da determinare il fenomeno della combustione in presenza di ossigeno e di un innesco. Useremo metodi di riscaldamento alternativi.

Cromatografia su strato sottile (TLC)

È una tecnica molto importante, una cromatografia ad adsorbimento solido-liquido, semplice e veloce, che richiede solo minime quantità di campione (nell'ordine dei 10 g). Da questo processo possiamo ricavare tantissime informazioni. Si basa sulla diversa ripartizione di sostanze tra una fase stazionaria ed una fase mobile, in funzione dell'affinità che ogni sostanza ha per esse.

Fase stazionaria

Materiale granulare omogeneo (spesso gel di silice o allumina).

Fase mobile

Liquido che sale lungo lo strato sottile di fase stazionaria o scende per capillarità. Generalmente nella TLC come fase stazionaria abbiamo il gel di silice (più raramente allumina) addizionata a dei leganti (gesso, amido…) che viene fatta aderire sotto forma di strato sottile su di un supporto piano solitamente di vetro o di alluminio.

Concetto di piatto teorico: sebbene la cromatografia sia un processo in continuo, si può immaginare che la colonna sia divisa in N sezioni, in ciascuna delle quali viene raggiunto l'equilibrio tra fase stazionaria e mobile. Ognuna di queste sezioni è un piatto teorico. Se la lunghezza totale della colonna è L, l'altezza equivalente a un piatto teorico (HETP) è: HETP = L/N. Per convenzione l'efficienza di una colonna è espressa in N piatti teorici, tanto maggiore è il numero di piatti teorici, tanto maggiore è l'efficienza della colonna. L'efficienza di una colonna dipende dal fatto che i picchi siano più o meno allargati, picchi stretti danno una buona separazione.

Abbiamo 3 tipologie di TLC: preparativa, analitica e HPTLC (TLC ad alte prestazioni) e la scelta di una di queste si basa sul diametro delle particelle, cioè più è suddivisa la fase stazionaria come il diametro delle particelle, di conseguenza aumentano i piatti teorici e più diminuisce lo strato sottile. Poiché il numero di piatti teorici è correlato all'area di superficie della fase stazionaria, ne consegue che particelle di dimensioni minori forniranno un grado di risoluzione maggiore.

Cosa cambia tra una tecnica preparativa o analitica?

È preparativa quando il proposito è quello di separare i componenti di una miscela per poterli poi usare per fare qualcos'altro. In questo caso non posso mettere troppa sostanza perché saturiamo il sistema e quindi creerei un equilibrio che non mi dà quello che volevo. È analitica quando io da quell'analisi voglio solo ricavare delle informazioni che ci interessano, non voglio recuperare e riutilizzare nulla, altrimenti la tecnica sarebbe preparativa. La TLC viene spesso impiegata per:

• Seguire l'andamento di una reazione: scomparsa dei reagenti e/o comparsa dei prodotti (se non vedo più il prodotto di partenza vuol dire che la reazione è completa).
• Controllare il grado di purezza di una sostanza, però per sicurezza mi affido anche ad altre tecniche confermative.
• Riconoscere prodotti incogniti.
• Identificare l'eluente più adatto da impiegare per una separazione cromatografica su colonna (quello che darà origine ad una maggior separazione).
• Seguire l'andamento di una separazione cromatografica su colonna.

Procedure operative

Semina

Il campione per essere seminato deve essere sciolto in un solvente, si preleva la soluzione con un capillare e viene deposto sulla lastrina almeno ad un cm dal bordo finale (che segno con la matita e non con una penna), non stare troppo bassi altrimenti il campione si scioglie già nell'eluente. Cerco di generare delle macchie (spot) che non siano troppo grandi, quindi mentre deposito soffio e ovvio al problema di creare grosse macchie.

Eluizione

La lastrina viene appoggiata verticalmente all'interno della camera di sviluppo contenente la fase mobile assicurandosi che la zona di caricamento sia sempre al di sopra del livello dell'eluente. L'eluente risale la lastrina per capillarità e viene fatto correre fino a circa 1 cm dal bordo superiore. Durante lo sviluppo i vari componenti della miscela migrano e si separano a seconda delle diverse affinità nei confronti della FM e FS. A sviluppo completato, si estrae la lastrina dalla camera di eluizione, si segna il livello raggiunto dal fronte del solvente, si evapora l'eluente e si passa quindi alla fase di rivelazione.

Qualora alcune sostanze non siano state completamente separate è possibile ricorrere ad un ulteriore sviluppo (sviluppo multiplo). Il grado di saturazione della camera è fondamentale per la buona riuscita della separazione cromatografica.

Il gel di silice è una FS polare, quindi gli analiti più polari hanno un'affinità maggiore rispetto a quelli apolari, quindi dal punto di semina quelli più trattenuti e che corrono di meno saranno quelli più polari visto che hanno con la FS affinità più alta, viceversa quelli apolari tendono a passare più tempo con l'eluente e quindi corrono più velocemente.

Le sostanze si spostano in funzione della loro polarità e di quella dell'eluente, ed in presenza di una TLC in fase diretta (adsorbenti più polari rispetto alla fase mobile) le sostanze più polari avanzano più lentamente di quelle meno polari.

Quando la fase mobile sale lungo la silice, i composti in essa disciolti sono in grado di interagire con i gruppi polari della silice. Le interazioni in gioco sono principalmente dipolo-dipolo e legami ad idrogeno e dunque quanto più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase stazionaria.

Fase mobile

È un liquido o una miscela di liquidi, i solventi usati sono una decina e tutti migrano per capillarità ascensionale. Seguono una classificazione in base al potere dell'eluente, cioè il potere di sviluppo. Idrocarburi alifatici come pentano ed esano hanno un basso potere di sviluppo poiché sono eluenti apolari, mentre invece l'acqua ha un alto potere eluente.

La fase mobile dovrà avere caratteristiche tali da competere opportunamente, con il soluto, per l'adsorbimento sulla fase stazionaria. Se la competizione è efficace, il soluto passa più tempo nella fase liquida e scorre di più. L'acqua non si usa mai così come solo l'etanolo che si lega ai siti attivi e disattiva il gel di silice, quindi si usa in prevalenza una sola percentuale di etanolo.

Esempio: semino la miscela di reazione, eluisco con diclorometano 100%, aspetto che arriva in alto, estraggo e mi accorgo che tutto è rimasto nel punto di semina, quindi non è l'eluente giusto. Dove mi dirigo per far si che si abbia il cammino? Verso l'acetone perché più voglio avere la corsa maggiore della sostanza, più deve entrare in competizione e più deve essere polare l'eluente che utilizzo.

Ordine di eluizione su gel di silice

Non sempre ottengo quello che mi aspetto in funzione della polarità perché intervengono altre condizioni. La differente affinità che ciascuna sostanza organica ha nei confronti della fase mobile e della fase stazionaria è una caratteristica intrinseca di ciascun composto organico, dipendente da polarità, dimensione e volume delle molecole, ecc. Pertanto alcune sostanze sono trascinate maggiormente ed altre in misura minore a parità di fase mobile, permettendo di effettuare una completa separazione dei composti costituenti la miscela. Solitamente quelli più trattenuti sono gli acidi carbossilici e via via scendendo tutta la scala i composti sono meno trattenuti e quindi servono eluenti più polari per eluire i prodotti.

Rivelazione con lampada UV

Io ho segnato i due punti di semina e di arrivo, a questo punto queste vengono esposte a delle lampade UV per rivelare le sostanze, che inizialmente rivelavano solo sostanze fluorescenti ma c'era poca applicabilità, adesso invece, le TLC vengono fatte posizionando nella FS una sostanza fluorescente, nel punto in cui però ho la sostanza la radiazione non riesce ad arrivare alla sostanza fluorescente ed è per questo che in quel punto vedo una macchia che non mi dà la fluorescenza, ed è in quel punto che ho la mia sostanza. Ottengo macchie scure su fondo fluorescente.

Posso però ricorrere ad altri reagenti:

• Reattivi di uso generale:
  • Iodio: utile per rilevare sostanze che contengono doppi legami e che formano complessi a trasferimento di carica con lo iodio. Spots giallo-marroni.
  • H₂SO₄ in etanolo: spruzzato su lastre che vengono poi carbonizzate. Comparsa di spot scuri su fondo bianco.
  • KMnO₄ in soda: miscela ossidante molto forte, che porta alla formazione di macchie scure (MnO₂). La lastrina appare viola e nel punto in cui il permanganato agisce e si trasforma in biossido di manganato ho delle macchie giallo-marroni. Alcune reazioni però hanno bisogno di condizioni più spinte quindi le scaldo.
  • Sali di molibdeno e di cerio: reattivo ossidante. Le macchie appaiono blu-viola su fondo giallo. Con questo reagente posso anche distinguere due sostanze diverse, ad esempio se con l'UV rilevo due macchie, le metto in questo reagente e vedo che le macchie hanno due colori diversi, da questo capisco che le sostanze sono diverse. Non succede con il permanganato questa cosa!
• Reattivi specifici: per gruppi funzionali o classi di sostanze, ad esempio: ninidrina per amminoacidi, 2,4-dinitrofenildrazina per aldeidi e chetoni.

Fattore di ritenzione (Rf)

La capacità di separare una sostanza di interesse da altri componenti interferenti (selettività) permettendone una identificazione inequivocabile, in una TLC è legata alla mobilità cromatografica dei componenti la miscela, ed è espressa dal fattore di ritenzione (o fattore di ritardo; Rf).

Rf = d_sost. / d_solv.

È il rapporto tra la distanza percorsa dalla sostanza (d_sost.) e quella percorsa dal solvente (d_solv.). Il valore è compreso tra 0 (sostanza completamente trattenuta dall'adsorbente) ed 1 (sostanza non trattenuta che migra con il fronte dell'eluente) e viene espresso fino alla seconda cifra decimale.

TLC: riproducibilità

La riproducibilità del fattore di ritenzione non è elevatissima perché l'Rf è sensibile a vari fattori, per precise condizioni cromatografiche. La riproducibilità dell'Rf, a parità di FS e FM, dipende da diversi fattori:

• Uniformità delle particelle e spessore della FS
• Temperatura che può influenzare la composizione della FM
• Il grado di insaturazione della camera di sviluppo
• Quantità di miscela da separare seminata (per strati di FS di 250–5-10 µm di campione)

Non si fa mai una TLC in cui calcolo l'Rf per poi farne un'altra e comparare i due Rf perché il sistema è influenzato da tanti parametri, quindi quello che si fa è calcolare un fattore di ritenzione relativo (R_rel): cioè utilizzo uno standard ed annullo molti elementi critici in farmacopea.

R_rel = R_fA / R_fSt

R_fA = R_f assoluto del componente A.

R_fSt = R_f assoluto di uno standard di riferimento

Dal punto di vista sintetico quello che si preferisce fare è seminare nella stessa TLC la miscela di reazione e avere una TLC in miscela. Per effettuare un'analisi identificativa di una sostanza tramite TLC è necessario seminare, sulla medesima lastrina accanto alla miscela in esame, i componenti puri (standards) che ci si aspetta di trovare, effettuando il riconoscimento per confronto diretto tra gli R_f degli spot incogniti con quelli degli standards seminati. Può essere però non sufficiente, mi possono venire dei dubbi, quindi posso fare una TLC in miscela (double spotting/co-spotting) che richiede tre semine:

1. Il composto da identificare;
2. Il campione di riferimento;
3. Una miscela dei due.

Se dopo lo sviluppo tutte e tre le macchie sono perfettamente allineate, con buona probabilità si tratta della stessa sostanza (oppure non c'è stata risoluzione).

Risoluzione

Esprime la capacità della TLC di fornire al termine dell'eluizione delle macchie ben separate. Dipende dall'efficienza e dalla selettività.

Efficienza

Esprime la capacità della TLC di tenere compatta la macchia evitandone l'espansione durante l'eluizione.

Capacità

Quantità di campione che può essere depositata sulla TLC per ottenere una buona separazione. Quantità eccessive determinano infatti macchie di forma irregolare che possono rendere scarsa la separazione e/o equivoca l'identificazione dei componenti della miscela (può essere dovuto al fatto che ho seminato troppa sostanza).

Effetto bordo

Salita non uniforme della FM dovuta alla non uniformità della FS o alla cattiva saturazione della camera di eluizione, non devo quindi seminare troppo vicino al bordo.

TLC: possibili macchie

Strisciata: la sostanza fa fatica ad abbandonare la FS perché ha affinità maggiore rispetto alla FM oppure ho messo troppo campione.

TLC bidimensionale

In presenza di miscele molto complesse (es. amminoacidi), un'unica corsa non è sufficiente per separare tutte le sostanze, quindi in un angolo semino la miscela, la immergo, eluisco e dal punto di semina ottengo un tot di sostanze, però se non sono sicura che una macchia contenga solo una sostanza, posso girare la lastra di 90°, quindi il punto di arrivo diventa il mio punto di semina, la immergo in un eluente diverso da quello di prima perché se non erano state separate con quel solvente non lo saranno nemmeno adesso, quindi se darà origine ad altre macchie vuol dire che in quella macchia avevo altre sostanze. In questo modo le sostanze che la prima eluizione non è stata in grado di separare possono essere separate con la seconda.

TLC preparativa

È una TLC molto grande, sono disponibili lastre (20 x 20 cm) di vetro con strati di adsorbente più spessi nelle quali è possibile seminare 15-100 mg di miscela a seconda dello spessore della FS (0,5-2 mm). La deposizione non va fatta in un punto ma lungo una linea tracciata a qualche cm dal bordo inferiore della lastra. Dopo lo sviluppo lo strato di adsorbente contenente la sostanza desiderata viene asportato dal supporto di vetro scalfendo il gel di silice contenente la sostanza, ci metto un solvente che scioglie la mia sostanza, filtro e questa sostanza recuperata per estrazione la posso utilizzare per un'ulteriore prova.

Punto di fusione

Il punto di fusione di una sostanza è una costante fisica ed una caratteristica che discrimina in un primo momento la sostanza, ne permette l'identificazione ed una valutazione del grado di purezza. Molte volte è richiesto di determinare il punto di fusione di una sostanza da noi sintetizzata e valutare sempre con questo punto di fusione che la sostanza sia sufficientemente pura. Piuttosto che ad un punto di fusione preciso si fa generalmente riferimento ad un intervallo di fusione.