Istologia e embriologia - preparazione del campione istologico

! I S T O L O G I A

La materia vivente è dotata di forme e dimensioni definibili. Essa è dotata di adattabilità e le sue

principali proprietà sono:

1. Irritabilità;

2. Motilità (compiere piccoli movimenti);

3. Assorbimento;

4. Secrezione;

5. Catalisi;

6. Generazione di fenomeni elettrici (differenza di potenziale).

La materia vivente ha capacità riproduttiva e va incontro ad un continuo rinnovamento. Essa è

dunque molteplice ma anche varia, in quanto può dar vita a materia vivente identica a se stessa o

modificata dall’originale, secondo il processo dell’evoluzione.

L’istologia nasce con il primo allestimento dei microscopi ottici, che portò, grazie a varie

osservazioni a delle scoperte sorprendenti. Ad esempio Hooke, osservando un tappo di sughero, si

rese conto della presenza di piccole celle cui diede il nome di cellule. Il sughero però è un tessuto che

non rappresenta materia vivente, ma ci si rese ben presto conto della possibilità di estendere la

scoperta anche nell’ambito dei viventi. Grazie a Schawnn e Schleiden si ha, nella prima metà del

seicento, la prima teoria cellulare, mentre successivamente con Virchow si aggiunge che ogni cellula dà

origine ad una nuova cellula.

La cellula è l’unità morfologica e fisiologica fondamentale degli organismi, e possiede le proprietà

di riproduzione, nutrimento, respirazione, accrescimento, capacità di sintesi, reattività agli stimoli e

movimento. Esse sono dotate di grande variabilità e capacità di adattamento. Dal punto di vista fisico-

chimico, sono costituite da un sistema colloidale eterogeneo e polifasico.

La forma più semplice di materia vivente sono i virus, anche se non possono essere considerati

come vera e propria materia vivente perché possiede le proprietà delle molecole. Seguono i

procarioti, rappresentate da batteri ed alghe, ed infine gli eucarioti, che possono essere organizzati in

organismi unicellulari e pluricellulari.

Le unità di misura di lunghezza usate in biologia sono il micrometro ed il nanometro, dunque per

poter osservare le cellule, è necessario uno strumento che abbia un elevato potere risolutivo. Si

definisce potere risolutivo la distanza minima alla quale due oggetti possono essere distinti.

Le cellule degli eucarioti sono caratterizzati da una complessa struttura interna e dalla

suddivisione del protoplasma in due compartimenti distinti separati dall’involucro nucleare, uno

chiamato nucleo e l’altro citoplasma. Il nucleo è delimitato da una membrana nucleare costituita in

realtà da due membrane, una interna ed una esterna, tra le quali è presente uno spazio definito spazio

internucleare. Il citoplasma è invece solitamente più periferico ed è delimitato dalla membrana

plasmatica. Il nucleo contiene la cromatina, mentre il citoplasma contiene una serie di organuli

specializzati.

Gli eucarioti possono essere organismi unicellulari, e prendono il nome di protofiti e protozoi, o

pluricellulari come ad esempio gli animali, compreso l’uomo, e i vegetali. Le cellule che compongono

questi organismi si specializzano per svolgere delle funzioni specifiche e determinate proprietà

morfologiche e fisiologiche. Questa specializzazione prende il nome di differenziamento. Cellule che

presentano morfologia simile possono associarsi insieme in una matrice extracellulare. Le cellule che

possiedono medesima forma, funzione e matrice embrionale, viene definito tessuto. Il tessuto è una

porzione di materia vivente con un aspetto omogeneo, origine e funzione, e queste caratteristiche le

ripresenterà in tutte le parti del corpo. Ogni tessuto ha un’ architettura caratteristica, finalizzata a

svolgere in maniera ottimale le specifiche funzioni alle quali le cellule che li costituiscono sono

dedicate. Si possono avere cellule piatte, cubiche, cilindriche, prismatiche, provviste di prolungamenti

ecc. La maggior parte delle cellule quando sono sospese in un liquido assumono una forma sferica, ma

non sempre l’ambiente circostante soltanto può determinare la forma di una cellula. Ad esempio gli

eritrociti, che sono immersi in una soluzione con alta percentuale di acqua, hanno una forma di lente

biconcava, che permette loro di svolgere al meglio la loro funzione. Le dimensioni delle cellule inoltre

sono perlopiù tutte simili tra di loro, infatti ciò che differenzia un organismo da un altro è il numero di

cellule e non la grandezza di queste. L’istologia non è altro che lo studio dei tessuti.

Oggi si ha la possibilità di prelevare parti di tessuto da tutte le parti del corpo. Le cellule possono

essere studiate da un punto di vista morfologico (studio delle parti componenti e dei vari costituenti

extracellulari) o da un punto di vista funzionale. Si può effettuare uno studio a fresco, ovvero su un

tessuto vivente, oppure un’osservazione di tessuti fissati e colorati, e quindi di un tessuto morto. Lo

studio a fresco può presentare non poche difficoltà. Infatti se si vuole far vivere un tessuto bisogna

nutrirlo e metterlo nelle condizioni migliori di vita. Per fare ciò il materiale da osservare risulterà

parecchio spesso rispetto agli standard della microscopia ottica. Inoltre l’abbondante presenza di acqua

e la mancanza di un colore, rende difficile il riconoscimento delle varie parti. La maggior parte delle

informazioni si può trarre invece da cellule e tessuti fissati e colorati in cui si è cercato di mantenere il

più possibile la struttura iniziale.

Lo studio dei tessuti inizia dunque con l’avvento della microscopia ottica, grazie alla quale si arriva

ad un potere di risoluzione fino a 0,2 micron. Anche nella microscopia ottica però sussistono dei limiti,

tra cui lo stesso potere di risoluzione, che è troppo basso per poter avere delle informazioni anche

sugli organuli. Solo negli anni Sessanta del 900 si ha un passo avanti nella scienza con l’avvento della

microscopia elettronica, quando fu messo a punto il primo microscopio elettronico a trasmissione e,

subito dopo, il microscopio elettronico a scansione grazie ai quali si potevano avere delle informazioni

sulla superficie e sull’interno della cellula. Più avanti nel tempo fu invece messo a punto il microscopio

a forza atomica che riesce a far visualizzare anche le molecole.

Microscopia ottica ed elettronica sono alla base dell’istologia. Esistono delle differenze sostanziali

tra microscopia ottica e microscopia elettronica. In ottica ad esempio abbiamo la possibilità di colorare

le varie parti della cellula, si può visualizzare una vasta porzione di campione (sull’ordine del

centimetro quadrato). Nell’elettronica invece ci si muove su un’area più ristretta (nell’ordine del

millimetro quadrato). Non possono essere utilizzati coloranti se non sali pesanti come l’acetato di

uranio, che possono creare solo dei contrasti visibili in bianco e nero. Le tecniche di microscopia

elettronica sono inoltre molto care.

Il microscopio ottico a luce, così chiamato perchè si basa sulla presenza di una sorgente luminosa

(generata da una lampada prima al Tungsteno, adesso una semplice lampada alogena). Il condensatore

indirizza il raggio di luce sul campione posto su un tavolino di vetro. Successivamente il raggio è

raccolto da un altro insieme di lenti (solitamente ve ne sono quattro tipi). Il fascio di luce passa

dunque dall’oculare che è l’ultima lente che lo ingrandisce ulteriormente di dieci volte.

Bisogna tener conto che per far si che la luce passi attraverso il campione, questo non dev’essere

troppo spesso, in quanto oltre a non poter passare la luce, potrebbero venirsi a creare un insieme di

immagini sovrapposte. Per poter ottenere una sezione istologica bisogna attuare dunque un

particolare processo di preparazione. Dopo aver prelevato un campione di tessuto dall’organismo

bisogna subito bloccare i processi autolitici che si attiveranno, dunque si procede con la fissazione.

Grazie a questa tecnica si bloccano i processi metabolici delle cellule, vengono rimossi gli eventuali

organismi patogeni oltre a rendere la cellula più rigida grazie a dei legami più rigidi che si vengono a

creare tra le cellule. Le sezioni infine sono ottenute grazie ad un particolare strumento munito di lama

chiamato microtomo. Prima di procedere al taglio bisogna conferire al campione una consistenza tale

da non “sbriciolarsi” al taglio dunque utilizziamo una particolare cera che alla temperatura di 60°C

circa si trova allo stato liquido e che a temperatura ambiente invece risulta essere solida, che è la

paraffina.

Il contrasto degli oggetti biologici osservati al microscopio dipende dalle differenze di

assorbimento della luce. I tessuti sono inoltre normalmente incolori, e lo scarso assorbimento di luce

nella cellula dipende in larga misura dal suo alto contenuto di acqua. Dunque ci serviamo di coloranti,

definiti coloranti istologici, per poter conferire colore elettivamente ai vari componenti della cellula.

Abbiamo detto che le cellule dei tessuti non possono sopravvivere a lungo al di fuori

dell’organismo da cui sono state prelevate, sia perchè non sussistono più le corrette condizioni

ambientali, sia perchè venendo meno la difesa costituita dal sistema immunitario dell’organismo, i

tessuti vengono invasi da microrganismi presenti nell’ambiente. La fissazione dev’essere dunque

effettuata immediatamente dopo il prelievo, ed implica la morte delle cellule in maniera rapida e la

denaturazione delle proteine, compresi gli enzimi litici. Tra i più usati tra i fissativi vi sono gli alcoli

etilico e metilico e le aldeidi (in particolare per la microscopia ottica la formaldeide e per la

microscopia elettronica la glutaraledide), o ad esempio la formalina neutra al 10%. Quest’ultime

formano legami crociati tra catene proteiche adiacenti immobilizzandole. Il tempo di permanenza nel

liquido di fissazione varia da pochi minuti a due giorni a seconda della grandezza del campione.

Un’altra forma di fissazione può essere il congelamento veloce, che potrebbe rappresentare in alcuni

casi un’alternativa senza dubbio migliore perché può evitare la morte delle cellule, solo nel caso in cui

il congelamento avvenga repentinamente. In caso contrario la formazione di cristalli più grandi

distruggerebbe la cellula. Per questo motivo si predilige, nel caso di questa tecnica, l’immersione del

materiale biologico in azoto liquido alla temperatura di -196°C, che permette alle cellule, una volta

scongelate di ritornare a svolgere le normali attività vitali.

Come abbiamo precedentemente detto, per poter studiare un campione al microscopio ottico,

questo deve avere uno spessore compreso tra i 3 e i 10 m