Istologia.

Istologia

L’istologia si ferma allo studio dei tessuti e dell’organizzazione che le cellule hanno all’interno di essi; è il riconoscimento dei tessuti e delle caratteristiche citologiche delle cellule. Per indagare i tessuti è necessario il microscopio ottico. Possiamo ridurlo a una fonte luminosa, che viene raccolta da un condensatore e mandata sul nostro preparato. Poi c’è un tavolino dove andremo a depositare i vetrini, quindi non si usa il tessuto integro; la luce, prodotta da una lampadina, viene convogliata sul nostro tessuto, sul nostro preparato, che dev’essere trasparente alla luce, quindi deve essere molto sottile. Una volta che la luce attraversa il nostro tessuto, viene convogliata in degli obbiettivi e l’oculare ci permette di vedere via via ingrandimenti sempre maggiori.

Preparazione dei campioni per microscopio ottico

Quello che utilizziamo per la microscopia ottica è un vetrino sul quale ci sono depositate delle porzioni, in particolare delle sezioni di tessuto. La prima cosa che si nota è che il tessuto dev’essere tagliato in fettine molto sottili, secondo è la colorazione non naturale. Quindi un ulteriore passaggio che bisogna fare per preparare un vetrino è quello di colorare i tessuti prima di andare ad analizzarli, perché un tessuto tendenzialmente è trasparente, non permettendo di mettere in evidenza e contrastare le varie strutture che lo formano. Generalmente un vetrino è formato da un vetrino portaoggetto, di 7,5x2,5 cm abbastanza spesso, su cui viene depositata la nostra sezione di tessuto; poi vi è un secondo vetrino molto sottile, detto copri oggetto, che serve per fissare il nostro preparato sul vetrino.

Andare ad analizzare dei campioni biologici di tessuto col microscopio ottico, richiede il dover ovviare a tutta una serie di problemi:

• La luce del microscopio ottico può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto: il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi, cioè piccole affettatrici in grado di fare fettine molto sottili spesse 5-10 µm.
• La maggioranza dei tessuti biologici è molle e deteriorabile: prima del taglio, il tessuto deve essere reso non deteriorabile e indurito; per cui un secondo passaggio che bisogna fare è quello di riuscire a includerli all’interno di una matrice che li renda facilmente tagliabili, spesso si usano resine ipossidiche o delle paraffine.

Allo stesso modo sappiamo che i tessuti biologici non sono eterni, ma sono facilmente attaccabili da batteri e muffe, cioè deteriorabili; quindi ci sono ulteriori passaggi da fare:

• Fissazione, ovvero bloccare completamente il nostro tessuto, quasi congelarlo per fare in modo che nulla alteri le sue caratteristiche citologiche e istologiche
• Disidratazione
• Inclusione

I tessuti e le cellule normalmente sono quasi incolori e privi di contrasto: prima dell’osservazione al microscopio ottico, il campione biologico deve essere colorato/contrastato e montato su vetrino.

Iter per preparare un vetrino di istologia

L’iter che generalmente si fa per preparare un vetrino di istologia è:

• Prelievo
• Fissazione
• Inclusione, serve per renderlo tagliabile, lo includiamo in una resina che lo rende duro in modo tale che possa essere tagliato dai microtomi
• Taglio
• Colorazione

Fissazione

L’analisi morfologica richiede l’uso di fissativi idonei a preservare nel modo migliore possibile la struttura del campione: uccidono rapidamente le cellule preservandone le strutture (preparati permanenti, rimangono inalterati nel tempo). La fissazione è un trattamento che porta alla immobilizzazione e alla stabilizzazione dei componenti tissutali/cellulari. La forma delle cellule e l’organizzazione dei tessuti devono essere conservate il più possibile simile alla condizione vitale.

Proprietà dei fissativi usati in istologia

• Preservare la morfologia del campione;
• Impedire processi autolitici e putrefattivi (da parte di muffe e batteri);
• Impedire alterazioni biochimiche nei tessuti.

Fissazione fisica: esposizione del tessuto a temperature molto alte o molto basse; congelamento rapido a -30°C; immersione in azoto liquido (-180°C); questa fissazione con il freddo richiede però delle strumentazioni particolari per tagliarlo. Si utilizza il criostato, ossia un altro tipo di affettatrice che è in grado di tagliare il preparato da congelato e lo mantiene tale.

Calore, fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino; si usa ad esempio per gli strisci di sangue, che vengono bloccati e fissati facendo evaporare rapidamente l’acqua.

Fissazione chimica: uso di sostanze chimiche; utilizzata maggiormente, può essere effettuata secondo tre modalità:

• Perfusione, la tecnica migliore, ma limitata all’animale da esperimento o a organi asportati in loco e con vasi integri; si usa in animali interi, quindi sfruttando l’apparato circolatorio si infonde il materiale fissativo;
• Immersione, si immerge il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10:1; è quello usato maggiormente;
• Con vapori, i tessuti si fissano grazie a vapori che si liberano da una soluzione di fissativo riscaldata; si usano fissativi altamente volatili come: formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.

I fissativi chimici più ampiamente usati sono acidi e aldeidi, come l’acido acetico, l’acido picrico, la formaldeide (soluzione 4-10%) e la paraformaldeide (soluzione 10%). Tutti i fissativi chimici sono preparati come soluzioni isotoniche, cioè con la tessa concentrazione del citoplasma (per impedire fenomeni di rigonfiamento o raggrinzimento del campione legati shock osmotici), e a pH 7.4. La durata della fissazione varia in base alla natura del campione biologico in esame, alla velocità di penetrazione del fissativo e, soprattutto, in base allo spessore del pezzo: p.es., uno spessore di 4 mm richiede dalle 12 alle 24 ore a temperatura ambiente.

Alternativamente, il tessuto può essere congelato rapidamente. In questo caso, si evita il successivo passaggio di inclusione e la relativa disidratazione, perché il tessuto congelato può essere immediatamente sezionato mediante il microtomo a congelazione o il criostato. Il vantaggio principale dell’uso del microtomo a congelazione o del criostato dopo congelamento rapido consiste nell’evitare l’azione chimica dei fissativi e la formazione di artefatti. Questi metodi sono usati particolarmente per lo studio dei lipidi, che sono preservati nel campione, mentre sono normalmente estratti (solubilizzati) durante la disidratazione con la serie degli alcoli.

Dalla fissazione dipende la buona riuscita di un preparato istologico, poiché permette di mantenere il più possibile inalterata l’organizzazione strutturale dei tessuti; dunque, la fissazione è l’operazione più importante della tecnica istologica.

Inclusione

Una volta che abbiamo fissato il tessuto, l’abbiamo praticamente bloccato nella condizione originale, ma non è cambiata la consistenza, è rimasto comunque molliccio. Quello che viene fatto è quello di includerlo, di inserirlo in una soluzione di paraffina o di resina ipossidica, che poi polimerizzano e diventano consistenti, grazie agli UV. L’unico problema è che generalmente paraffina e resine non sono solubili in acqua e il nostro soluto è per lo più una soluzione acquosa; quello che bisogna fare è sostituire piano piano l’acqua del tessuto con qualcosa che renda la paraffina solubile e questo è possibile grazie alla scala crescente degli alcoli. Sostanzialmente si prende il tessuto che è quasi 100% acqua, lo si incuba per un tot di tempo in etanolo 10%; questo permette l’equilibrazione tra il citoplasma delle cellule e la soluzione esterna, in modo tale che anche all’interno delle cellule si abbia etanolo 10%. Questa piccola variazione non altera la struttura delle nostre cellule questa cosa viene ripetuta fino ad arrivare ad avere acqua 0% e etanolo 100%. Questo perché l’etanolo è miscibile con un altro solvente, che è lo xilolo, cioè il solvente perfetto per permettere alla paraffina di diffondersi all’interno delle nostre cellule. Quando l’acqua è sostituita dalla nostra resina, questa viene fatta polimerizzare, cioè che da una soluzione acquosa andiamo ad avere una soluzione che diventa consistente, dura.

Una volta che abbiamo questo cubettino di paraffina con all’interno il tessuto, quello che viene fatto è usare il microtomo. Questo strumento ha una manovella che serve per avvicinare via via il nostro preparato alla lama, ha una lama fissa e poi ha un portablocchetto dove con una morsa viene tento in posizione il nostro blocchetto di paraffina. Girando questa manovella il blocchetto fa una serie di cicli, quindi continua a scendere e salire, ogni ciclo si avvicina leggermente alla lama di 3-10 µm alla volta. Alla fine quello che otteniamo sono tante fettine di paraffina all’interno del quale abbiamo il nostro preparato.

Colorazione

Qui il problema è che i coloranti sono generalmente in soluzioni acquose, quindi dobbiamo partire dal nostro preparato in paraffina e fare il percorso inverso, ossia sostituire la paraffina con lo xilolo, fare la scala discendente degli alcoli e riportare il nostro tessuto in acqua. Dopo di che la fettina viene immersa nelle soluzioni coloranti, lasciata un tot di tempo a seconda dello spessore o del protocollo che si vuole utilizzare per la colorazione. Generalmente per fissare la nostra fettina colorata sul vetrino si usano sostanze non miscibili in acqua, quindi facciamo di nuovo la scala crescente degli alcoli e infine si mette sul nostro vetrino porta oggetti, lo si copre con il copri oggetto e possiamo andare a visionarlo al microscopio.

Coloranti

• Coloranti acidi (p.es.: eosina): si fissano nel citoplasma e nelle fibre collagene (componenti acidofili delle cellule e dei tessuti).
• Coloranti basici (p.es.: ematossilina, pironina, verde di metile, blu di metilene, blu di toluidina): colorano preferibilmente alcuni componenti (detti perciò basofili) quali la sostanza fondamentale della cartilagine, la cromatina e il RER.

Combinazioni di più coloranti: alcuni dei metodi di colorazione usati, come la colorazione tricromia di Mallory, si basano sulla combinazione di più coloranti. La colorazione più usata è un mix di due coloranti, cioè ematossilina e eosina, uno basico che lega sostanze acide e l’altro acido. Le caratteristiche che mette in evidenza questo mix sono il nucleo delle cellule, che vengono colorati dall’ematossilina di un viola intenso/blu, mentre l’eosina colora il citoplasma di un rosino pallido. Quindi si può identificare la presenza del nucleo, la sua posizione, la presenza di altri organelli; esistono anche altre strutture che non vengono colorate, cioè le ghiandole mucipare, caratterizzate dal mucinogeno che non è affine per queste due colorazioni (esistono colorazioni specifiche).

Sezioni di un oggetto secondo piani o livelli differenti

Tendenzialmente il tessuto che vogliamo guardare potrebbe essere tagliato in una direzione qualsiasi, questo vuol dire che a seconda di come verrà tagliato, potremo avere aspetti completamente diversi. Se prendiamo un uovo e facciamo un taglio longitudinale lungo l’asse maggiore, più o meno centrale, riusciremo a intercettare sia il tuorlo che l’albume; se invece la sezione longitudinale è più spostata verso l’alto, non riusciremo a vedere il tuorlo, ma avremo una struttura tondeggiante completamente bianca. Stessa cosa se prendiamo sezioni trasversali in direzione ortogonale rispetto a prima.

Questa cosa diventa più complicata se pensiamo di sezionare una struttura tubulare, cioè cava al centro e può essere piena di anse e curve, quindi a seconda di dove cade il piano di taglio, può apparire in numerosi modi diversi. Se facciamo una sezione obliqua del tubulo avremo un aspetto più o meno ellissoidale con al centro la cavità e la parete a delimitarla; se facciamo un taglio perfettamente trasversale avremo una struttura circolare con la cavità al centro. Ma abbiamo molti altri modi di tagliare il tubulo.

I tessuti dei mammiferi

• Epiteliali
• Epiteli di rivestimento
• Epiteli ghiandolari
• Connettivi
• Lasso o areolare
• Denso o fibroso
• Reticolare tessuti connettivi propriamente detti
• Elastico
• Adiposo
• Cartilagine e osso, connettivo di sostegno
• Sangue, linfa, tessuto emopoietico e linfoide
• Muscolari
• Striato scheletrico
• Striato cardiaco
• Liscio
• Nervoso

Epiteli di rivestimento

Generalmente li localizziamo in tre punti:

• La superficie esterna del corpo, ad esempio l’epidermide
• Le mucose, cioè tutti quegli epiteli che si trovano ad esempio nel tratto digerente o in quello respiratorio
• Le sierose, ad esempio la pleurica, la pericardica e la peritoneale

Gli epiteli di rivestimento non sono vascolarizzati e non troveremo mai tessuto nervoso. Le cellule sono molto ordinate e generalmente si dispongono una di fianco all’altra a formare una sorta di palizzata, sono a mutuo contatto; poggiano tutte su una membrana basale, che è una struttura il cui scopo è fare una sorta di filtro molecolare tra l’epitelio di rivestimento (sopra) e gli altri tessuti, generalmente connettivi (sotto). La membrana basale ha anche la funzione di polarizzare le cellule, cioè cellule che hanno specializzazioni a livello apicale (porzione libera, al di sopra). Negli epiteli di rivestimento le porzioni apicali delle cellule spesso presentano delle specializzazioni che possono essere microvilli o ciglia.

Le caratteristiche che ci permettono di classificare gli epiteli di rivestimento sono sostanzialmente due: la forma della cellula e il numero di strati. Ci possono essere tre tipi di forme che generalmente vanno in base all’altezza delle cellule: se abbiamo cellule la cui larghezza è molto maggiore rispetto all’altezza, parliamo di cellule pavimentose, molto propense a essere localizzate in siti dov’è necessario lo scambio, quindi ad esempio negli alveoli polmonari; quello che ci aiuta a definire la forma della cellula è la forma del nucleo, quindi le cellule pavimentose di solito hanno un nucleo schiacciato lateralmente. Modificando leggermente l’altezza delle cellule, abbiamo le cubiche o isoprismatiche, larghezza paragonabile all’altezza e nucleo tendenzialmente sferico e centrale; infine possiamo avere sono quelle cilindriche, quindi altezza molto maggiore rispetto alla larghezza e il nucleo risulta schiacciato e allunato verso l’alto.

Se abbiamo un solo strato di cellule generalmente l’epitelio viene definito semplice o monostratificato, se invece aggiungiamo un numero di strati di cellule andiamo a definire quelli che sono gli epiteli pluristratificati. Generalmente può capitare che all’interno di un epitelio pluristratificato, la forma delle cellule si modifichi lungo gli strati, quindi la classificazione avviene sempre riferendosi allo strato più esterno. Possiamo anche avere un epitelio pseudostratificato e di transizione o polimorfo.

Epitelio pavimentoso semplice

Posso trovarlo nella parete che delimita il lume dei vasi, quindi nei capillari, e a livello dei glomeruli e della capsula di Bowman. Un epitelio pavimentoso semplice guardato dall’alto o una sezione tangenziale, cioè il cui piano di taglio è all’interno dello spessore delle cellule, ha l’aspetto di quello in foto, quasi un pavimento piastrellato. Se invece tagliamo l’epitelio con un piano ortogonale, quello che ci aspettiamo di vedere è una singola fila di cellule, nella foto in violetto un po’ più scuro, e l’unica caratteristica che ci permette di definirlo è sostanzialmente la forma del nucleo. Qui i nuclei per la stragrande maggioranza sono appiattiti e schiacciati.

Una condizione in cui spesso lo vedremo è quello in cui questo epitelio va a far parte dei piccoli capillari. L’endotelio (parete dei capillari) è composto da cellule pavimentose monostratificate, quindi nel momento in cui andiamo a tagliare un capillare ortogonalmente al suo asse maggiore, quello che ci aspettiamo di vedere è la cavità centrale vuota (se sono stati fatti numerosi lavaggi del vetrino) o con dei globuli rossi. Se invece andiamo a sezionare il capillare longitudinalmente l’epitelio avrà quest’aspetto, quindi la parete è ogni tanto intervallato dai nuclei. In questo caso il calibro del nostro capillare è così piccolo che i globuli rossi devono mettersi in fila indiana per passare. Tra gli eritrociti anucleati, ogni tanto potrà capitare di trovare delle cellule nucleate, che sono i globuli bianchi e riconosciamo non far parte dell’endotelio perché non hanno i nuclei schiacciati.

Capsula di Bowman

Una seconda posizione in cui lo andremo a vedere è a livello renale; l’unità funzionale del rene è il nefrone, caratterizzato dall’avere una porzione più o meno sferica (glomerulo) a cui arriva il capillare e forma tutto un groviglio, il quale è delimitato da questa struttura da una struttura detta capsula di Bowman che serve a raccogliere quella che è l’urina iniziale, prima ancora che venga processata e concentrata in tutte le porzioni successive del nefrone. Un esempio di epitelio semplice monostratificato è proprio la capsula di Bowman. Anche qui colorazione ematossilina-eosina, quindi nuclei viola pi.