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Ingegneria genetica - Appunti

Appunti per l'esame di Ingegneria genetica, corso di laurea in Biotecnologie Mediche all'università di Firenze.
Argomenti:
Clonaggio;
riconoscimento dei trasformanti;
complementazione di una mutazione;
ibridazione DNA - DNA;
riconoscimento immunologico.

Esame di Ingegneria genetica docente Prof. P. Bogani

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specificità al primer è data dalla sequenza più in particolare bisogna che sia

sufficientemente lungo da impedire il suo attacco da altre posizioni. Semplicemente per

una questione di probabilità. Numero degli avvenimenti favorevoli fratto il numero

degl'avvenimenti possibili. Temperatura di fusione­>temperatura alla quale il 50 % delle

molecole è denaturata l'altro 50 % delle molecole no. In questo caso il 50 % delle

molecole del primer è attaccata alla sequenza bersaglioil rimanente 50 % invece no.

PCR II : La temperatura di fusione dipende dalla lunghezza del primer e dalla sequenza

del primer, per calcolarlo per primer che hanno una lunghezza fino a 17 basi per ogni A

e T si considerano 2 gradi centigradi e per ogni C e per ogni G si considerano 4 gradi

centigradi. Se i primer sono più lunghi bisogna utilizzare una formula matematica. Se io

tengo il primer ad una temperatura superiore alla temperatura di fusione nn si appaiono

perchè aumenta la vibrazione. Tanto più abbasserò tante più saranno le molecole e i

primer che si appaieranno. Primer X fatto da 17 nucleotidi tutti A e T, il secondo primer Y

è fatto da tutte G e C quindi la temperatura del primo sarà 34 e del secondo 68. Per

fargli appaiare bisognerà decidere a che temperaatura farla avvenire. A 68 gradi Y si

appaia ma X nn si appaia ­> la PCR non viene. Se abbasso la temperatura fino a

34gradi i primer X si appaia il primer si attacca alla sequenza bersaglio ma non solo a

quella , essendo così libero può anche appaiarsi anche a sequenze non del tutto

complementari. Otterremo un amplicone in condizioni normali, mentre quando abbiamo

la temperatura più bassa otterremo tanti ampliconi diversi, otterremo anche l'amplicone

desiderato ma anche altri non desiderati aspecifici. Quindi a questo punto decido di

cambiare primer, non essendo questi specifici. Come faccio a capire se va bn? Faccio

un elettroforesi su gel di agarosio. Se fosse venuta bn dovremmo vedere una banda

delle dimenzioni giuste.Se abbiamo prodotti aspecifici otterremo più bande e con un

intensità diversa. I primer vanno disegnati senza che abbiamo regioni complementari,

altrimenti si potrebbero legare.

Complementazione di una mutazione

Unico sistema che ci da una risposta in vivo. Mutazione­> cambiamento nella sequenza

del dna. Frequenza di mutazione spontanea 10^­6. Mutazioni di diverso tipo­> puntiformi

(generalemnte colpiscono una sola base e la modificano) che possono essere di diverso

tipo insersioni o delezioni di una o più basi, che provocano lo scivolamento della lettura;

o sostituzioni. Mutazione silente­> l'organismo nn la sente, la tripletta che viene mutata

codifica lo stesso amminoacido. Mutazione neutrale ­>viene codificato un altro

amminoacido ma l'amminoacido richiamato è simile dal punto di vista chimico fisico a

quello che c'era prima, chiamata neutrale perchè nona da un vantaggio ne uno

svantaggio dal punto di vista evolutivo. Missenso ­>un nucleotide viene sostitutito con un

altro, la tripletta cambia , amminoacido richiamato completamente diverso

dall'amminoacido preesistente, proteina non funziona in maniera funzionale. Non senso

­> tripletta che diventa un codone di stop della traduzione, si ha una proteina più corta,

tanto più la mutazione avvienevicina all'inizio del gene tanto più sarà corta e quindi sarà

maggiore che la funzionalità venga perduta. Le mutazioni possono anche tornare

indietro, revertire. La frequenza di reversione è minore della frequenza di mutazioni. E'

intorno al 10^­8, 10^­9. Ci sono delle mutazioni che rivertono meno ­>delezione. Non

reverte mai ­> la delezione di un intero gene. Ammetendo di avere una via metabolica

(insieme di reazioni catalizzata da un enzima, codificato da un gene. Si parte da un

substrato iniziale, attraverso dei passaggi che hanno degli intermedi di reazione si forma

il prodotto finale).

Biosintesi dell'istidina, l'istidina sta nel sito attivo, per fare l'istidina ho bisogno di più di

40 molecole di ATP. Ha un anello imidazzolico, può cedere o acquistare elettroni quindi

si può comportare da acido o da base. E' una molecola estremamente reattiva. La

biosintesi processa attraverso una seriedi passaggi, se io interrompo la via metabolica

del'istidina alla fine la cellula non è capace di farsi l'istidina, auxotrofo per l'istidina.

Posso allora innescare o una mutazione nel gene così la via metabolica riprende,

oppure posso infilare un plasmide ricombinante con un extracopia di quel gene ma

funzionante, la proteina che manca viene ripristinata così' riparte la via metabolica. La

complementazione di una mutazione noi la possiamo verificare in vivoperchè un

mutante auxotrofo per istidina in un terreno minimo in assenza di istidina muore la

cellula. Può sopravvivere in un terreno minimo solo se ci mettiamo l'istidina. La

complementazione per l'istidina noi la possiamo verificare solo se è capace di crescere

per un terreno selettivo.

­­­­­

Ceppo batterico mutato nell'istidina A, fenotipo istidina ­ , in un terreno minimo in

assenza di istidina queste cellule non crescono. In uno scenario metto un plasmide

ricombinante con un gene che non corrisponde al gene istidina la cellula rimane istidina­

, nel secondo caso metto un estracopia funzionante del gene istidina si ha

ricombinazione. Mutante istidina ­ esperimento di clonaggio ­ > vettore taglio con enzima

di restrizione, prendo un batterio che contenga il gene istidina A, miscela di ligasi,

trasferisco il tutto in un batterio che è istidina­, trasferisco tutto in un terreno contente il

batterio ed istidina qui crescono tutte le cellule con incorporato un plasmide. Devo capire

quale colonia contine un plasmide ricombinante che contiene istidina, li metto su terreno

minimo senza istidina qui cresceranno solo quelle colonie che riescono a sintetizzare

istidina. Le cellule che sono diventate capaci di sintetizzare istidina ­>o c'è stata

retromutazione nel gene istidina A nel cromosma nel gene ricevente, o c'è stat auna

complementazione, oppure possono essere successe entrambi le cose. O il plasmide è

responsabile del gene A+ o non lo è; se il plasmide ricombinante è responsabile del

ripristino del fenotipo istidina +, se davvero c'è stata una complementazione, io estraggo

il plasmide dalla colonia istidina + lo purifico e trasformo cellule che sn A­ con quel

plasmide mi aspetto che tutte le celule che hanno ricevuto il plasmide A+diventano

istidina A+ vuol dire che i fenotipo era legato al plasmide ricombinante, se continuano ad

essere A­ vuol dire che non dipendono dal plasmide. Posso far perdere il plasmide ad

una cellula, se è legata al plasmide la presenza di istina questa diventerà A­ altrimenti

resterà A+. Curing del plasmide­> perdita del plasmide, noi facciamo perdere alle cellule

i plasmmidi mantenendoli però vitali., bisogna però cercare di impedire che il plasmide si

replichi, utilizzare inibitori della replicazione. Inoculare le cellule e metterle in una beuta

in un terreno liquido,con presenza di istidina e assenza di ampecillina poi dopo ci

aggiungerò l'arancio di acretina bloccata la replicaizione del dna in generale, quindi ci

sta che tutta la replicazione del cromosoma venga bloccata e quindi muore la cellula,

replicazione del plasmide e del cromosoma e quinde muore, non viene bloccata ne una

ne l'altra quindi continua a vivere e replicare il plasmide, ci sta anche che la cellula

sopravviva e perda il plesmide. Bisogna far si che sopravvivano tutte quelle che hanno

perso e quelle che hanno mantenuto il plasmide quindi non ci metto ampecillina ma

metto l'istidina. Dopo un certo periodo di tempo semino parte delle cellule su piastra

nello stesso terreno in cui l'ho fatta crescere ma senza arancio di acretina, ammettiamo

di avere una piastra 5 colonie (come un 5 a carte), si fa una replica su un terreno con

istidina ed ampecillina così crescono soltanto le 2 colonie superiori vuiol dire che hanno

mantenuto il plasmide. Devo valutare quali delle 5 colonie sono capaci di farsi l'istidina e

quali sono incapaci di farseli ­> si fa una relica in un terreno che non contiene

ampecillina e istidina, crescono solo quelle che hanno la capacitàdi sintetizzare l'istidina,

ci si prospettano 2 scenari, se crescono tutte e 5 le colonie vuol dire che fanno tutte la

istidina anche quelle che non hanno il plasmide quindi la cellula di partenza era

revertante xkè anche se gl'abbiamo tolto il plasmide quelle cellule continuano a fare

istidina, l'altro scenario è la crescita delle due colonie superiori e basta vuol dire che solo

le colonie che hanno mantenuto il plasmide sono capaci di farsi l'istidina quindi vuol dire

che il fenotipo A+ è legato alla presenza dle plasmide quindi la cellula iniziale è un

complementare.

Ibridazione DNA­DNA

Se io faccio questo esperimento devo essere sicuro che nel genoma della celula ospite

quella in cui abbiamo effettuato il clonaggio non ci sia o nn ci siano sequenze bersaglio

a cui la sonda si può legare xkè altrimenti ci vengono risultati sballati,un'altra cosa che

possiamo usare è la stringenza di una reazione­> condizioni di reazione che ci possono

permettere di favorire o meno la formazione di ibridi anche non perfettamente

complementari, se io lavoro a condizioni di alta stringenza permetto la formazione

del'irbido solo se c'è altra complementarietà a bassa stringenza lo permetto anche se le

sequenze sono divergenti

Un ibrido ­> una miscele di due o più entità diverse. Dna iibrida contine due filamenti

uno con un origine l'altro cn un'altra origine, serve che riescano ad arrotolarsi l'una

sull'altra questo implica che siano abbastanza complementari, sufficientemente


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AUTORE

Giugia91

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in Biotecnologie mediche e farmaceutiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Giugia91 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Ingegneria genetica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Bogani Patrizia.

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