Ingegneria genetica - Appunti

Falsi positivi: (le colonie positive ovvero quelle bianche che contengono un plasmide

ricombinante), si vede una colonia bianca che però al'interno non ha un plasmide

ricombinante ma troviamo ad esempio il vettore da solo. Potrebbe essere avvenuta una

mutazione nel gene lacZ e non funzionare più, oppure a livello del promotore che nn

permette la trascrizione del gene.

Falsi negativi: colonie celesti in cui ci aspettiamo di trovare dei vettori ed invece ci

troviamo plasmidi ricombinanti. Si possono riconoscere i falsi negativi xkè tra queste

colonie ci sono delle cellule più scure. Ci sono quindi più cromoforo concentrati quindi

sono stati degradati una quantità maggiore di Xgal.

Se c'è più betagalattosidasi ci sta che sia trascritto più efficientemente che in una

colonia celeste, potrebbe . Se io inserisco al suo interno un frammento di dna

passeggero cn un promotore molto forte io posso avere una maggior trascrizione di lacZ

quindi abbiamo più betagalattosidasi.

Riconoscimento dei trasformanti

PCR I : reazione a catena della polimerasi, scoperto da kary mullis,amplificazione in itro

di un frammento di DNA. Metodo che permette di ottenere una quantità quasi inlimitata

di un segmeto di DNA in un tempo brevissimo trammite una reazione catalizzata da

DNApolimerasi. Ci basta una copia di quel segmento per averne tantissimi. Fingerprintig

molecolare. Tanto si gioca sulla specificità delle arezione della PCR. Bisogna

iinterpretarla come una fotocopiatrice molecolare, quindi bisogna dargli le giuste

indicazioni, indirizzare la DNA polimerasi verso la sequenza che vogliamo.Questo è reso

possibile dal fatto che le DNA polimerasi per poter funzionare hanno bisogno di un

innesco per poter funzionare. Le Dna poimerasi aggiungono nuovi nucleotidi a dna già

esistente. Per moltiplicare il nostro stampo dobbiamo conoscere la sequenza

dell'estremità, posso quindi costruire due primer, sintetizziare due oligonucleotidi

unocomplementare ad un estremità l'altro complementare all'altra estremità per farli

funzionare come innesco per la dna polimerasi.Durante la reazione della PCR c'è un

certo numero di cicli, questi variano a differenza dell'esperimento, ogi ciclo corrisponde

ad una sintesi del segmento. Durante ogni ciclo deve avvenire l'estensione del primer da

parte dell'rnapolimerasi affinchè questo avvenga bisogna che i primer si attacchino alla

sequenza bersaglio,il primer che è a signola elica si deve attaccare alla doppia elica

quindi questa deve essere aperta con l'aumento della temperatura che denatura il dna

rompendo i legami ad idrogeno aumentando la vibrazione del DNA. Prima fase

­>denaturazione del DNA. Si ha la denaturazione intorno ai 95 °. La denaturazione

spesso non è totale. Anche la DNA polimerasi a quel temperatura si denatura, quindi si

usano le dnapolimerasi termofile isolate da organismi termofili, termus aquaticus.

Bisogna che il dna si attacchi alla sequenza bersaglioquindi riabbasso la temperatura,

permetto l'appaiamento. Diminuiscono le vibrazione ma i primer si appaiano alla

sequenza solo sesi ha un eccesso di primer rispetto alle molecole di dna. Seconda fase

­>appaiamento del primer. Avviene ad una temperatura che varia dai 30 ai 60 °. Terza

fase ­> estensione del primer. Sintesi del nuovo DNA. Ad un primo ciclo di PCR la

polimerasi sa dove deve iniziare ma non sa dove deve finire, non c'è un punto preciso

deve si ferma, la cosa importante è che la polimerasi arrivi almeno alla regione dove si

deve attaccare l'altro primer. Al secondo ciclo il DNA si riapre le due eliche parentali

continuano a funzionare da stampo, ma oltre a queste ci sono anche i segmenti di DNA

che sono stati neosintetizzati, ora la polimerasi sa da dove partire ma anche dove finire

perchè il primo primer è già attaccato e la polimerasi parte dal secondo verso questo.

Alla fine del secondo ciclo iniziano ad esserci le footocopie dei segmenti desiderati. La

fase cruciale è la seconda, la fase di appaiamento perchè bisogna che i primer si

leghino alle sequenze bersaglio e nn da altre parti e che si leghino entrambi. La

specificità al primer è data dalla sequenza più in particolare bisogna che sia

sufficientemente lungo da impedire il suo attacco da altre posizioni. Semplicemente per

una questione di probabilità. Numero degli avvenimenti favorevoli fratto il numero

degl'avvenimenti possibili. Temperatura di fusione­>temperatura alla quale il 50 % delle

molecole è denaturata l'altro 50 % delle molecole no. In questo caso il 50 % delle

molecole del primer è attaccata alla sequenza bersaglioil rimanente 50 % invece no.

PCR II : La temperatura di fusione dipende dalla lunghezza del primer e dalla sequenza

del primer, per calcolarlo per primer che hanno una lunghezza fino a 17 basi per ogni A

e T si considerano 2 gradi centigradi e per ogni C e per ogni G si considerano 4 gradi

centigradi. Se i primer sono più lunghi bisogna utilizzare una formula matematica. Se io

tengo il primer ad una temperatura superiore alla temperatura di fusione nn si appaiono

perchè aumenta la vibrazione. Tanto più abbasserò tante più saranno le molecole e i

primer che si appaieranno. Primer X fatto da 17 nucleotidi tutti A e T, il secondo primer Y

è fatto da tutte G e C quindi la temperatura del primo sarà 34 e del secondo 68. Per

fargli appaiare bisognerà decidere a che temperaatura farla avvenire. A 68 gradi Y si

appaia ma X nn si appaia ­> la PCR non viene. Se abbasso la temperatura fino a

34gradi i primer X si appaia il primer si attacca alla sequenza bersaglio ma non solo a

quella , essendo così libero può anche appaiarsi anche a sequenze non del tutto

complementari. Otterremo un amplicone in condizioni normali, mentre quando abbiamo

la temperatura più bassa otterremo tanti ampliconi diversi, otterremo anche l'amplicone

desiderato ma anche altri non desiderati aspecifici. Quindi a questo punto decido di

cambiare primer, non essendo questi specifici. Come faccio a capire se va bn? Faccio

un elettroforesi su gel di agarosio. Se fosse venuta bn dovremmo vedere una banda

delle dimenzioni giuste.Se abbiamo prodotti aspecifici otterremo più bande e con un

intensità diversa. I primer vanno disegnati senza che abbiamo regioni complementari,

altrimenti si potrebbero legare.

Complementazione di una mutazione

Unico sistema che ci da una risposta in vivo. Mutazione­> cambiamento nella sequenza

del dna. Frequenza di mutazione spontanea 10^­6. Mutazioni di diverso tipo­> puntiformi

(generalemnte colpiscono una sola base e la modificano) che possono essere di diverso

tipo insersioni o delezioni di una o più basi, che provocano lo scivolamento della lettura;

o sostituzioni. Mutazione silente­> l'organismo nn la sente, la tripletta che viene mutata

codifica lo stesso amminoacido. Mutazione neutrale ­>viene codificato un altro

amminoacido ma l'amminoacido richiamato è simile dal punto di vista chimico fisico a

quello che c'era prima, chiamata neutrale perchè nona da un vantaggio ne uno

svantaggio dal punto di vista evolutivo. Missenso ­>un nucleotide viene sostitutito con un

altro, la tripletta cambia , amminoacido richiamato completamente diverso

dall'amminoacido preesistente, proteina non funziona in maniera funzionale. Non senso

­> tripletta che diventa un codone di stop della traduzione, si ha una proteina più corta,

tanto più la mutazione avvienevicina all'inizio del gene tanto più sarà corta e quindi sarà

maggiore che la funzionalità venga perduta. Le mutazioni possono anche tornare

indietro, revertire. La frequenza di reversione è minore della frequenza di mutazioni. E'

intorno al 10^­8, 10^­9. Ci sono delle mutazioni che rivertono meno ­>delezione. Non

reverte mai ­> la delezione di un intero gene. Ammetendo di avere una via metabolica

(insieme di reazioni catalizzata da un enzima, codificato da un gene. Si parte da un

substrato iniziale, attraverso dei passaggi che hanno degli intermedi di reazione si forma

il prodotto finale).

Biosintesi dell'istidina, l'istidina sta nel sito attivo, per fare l'istidina ho bisogno di più di

40 molecole di ATP. Ha un anello imidazzolico, può cedere o acquistare elettroni quindi

si può comportare da acido o da base. E' una molecola estremamente reattiva. La

biosintesi processa attraverso una seriedi passaggi, se io interrompo la via metabolica

del'istidina alla fine la cellula non è capace di farsi l'istidina, auxotrofo per l'istidina.

Posso allora innescare o una mutazione nel gene così la via metabolica riprende,

oppure posso infilare un plasmide ricombinante con un extracopia di quel gene ma

funzionante, la proteina che manca viene ripristinata così' riparte la via metabolica. La

complementazione di una mutazione noi la possiamo verificare in vivoperchè un

mutante auxotrofo per istidina in un terreno minimo in assenza di istidina muore la

cellula. Può sopravvivere in un terreno minimo solo se ci mettiamo l'istidina. La

complementazione per l'istidina noi la possiamo verificare solo se è capace di crescere

per un terreno selettivo.

­­­­­

Ceppo batterico mutato nell'istidina A, fenotipo istidina ­ , in un terreno minimo in

assenza di istidina queste cellule non crescono. In uno scenario metto un plasmide

ricombinante con un gene che non corrisponde al gene istidina la cellula rimane istidina­

, nel secondo caso metto un estracopia funzionante del gene istidina si ha

ricombinazione. Mutante istidina ­ esperimento di clonaggio ­ > vettore taglio con enzima

di restrizione, prendo un batterio che contenga il gene istidina A, miscela di ligasi,

trasferisco il tutto in un batterio che è istidina­, trasferisco tutto in un terreno contente il

batterio ed istidina qui crescono tutte le cellule con incorporato un plasmide. Devo capire

quale colonia contine un plasmide ricombinante che contiene istidina, li metto su terreno

minimo senza istidina qui cresceranno solo quelle colonie che riescono a sintetizzare

istidina. Le cellule che sono diventate capaci di sintetizzare istidina ­>o c'è stata

retromutazione nel gene istidina A nel cromosma nel gene ricevente, o c'è stat auna

complementazione, oppure possono essere successe entrambi le cose. O il plasmide è

responsabile del gene A+ o non lo è; se il plasmide ricombinante è responsabile del

ripristino del fenotipo istidina +, se davvero c'è stata una complementazione, io estraggo

il plasmide dalla colonia istidina + lo purifico e trasformo cellule che sn A­ con quel