Ingegneria genetica - Appunti

Clonaggio

Per effettuare un clonaggio abbiamo bisogno del vettore, ovvero un plasmide con più marcatori genetici, DNA passeggero, inserito nel plasmide con enzimi di restrizione con sequenze palindromiche che tagliano il DNA a doppia elica, enzimi DNA ligasi, un enzima che salda covalentemente due molecole di DNA, nucleotidi adiacenti che si trovano sulla stessa elica. Solo grazie a questa si possono generare molecole ricombinanti stabili. All'interno della cellula ospite entrano tutte le molecole circolari, non molecole lineari.

Piastra con colonie cresciute con antibiotico a cui il plasmide dà la resistenza. Io non so se contengono un vettore o un ricombinante. Il plasmide usato ha solo un marcatore; per vederlo devo estrarre il plasmide e controllare le sue dimensioni. Prendo il plasmide integro e lo inserisco all'interno di una cellula che è sensibile alla tetraciclina e all'ampecillina; la cellula diventa resistente a tutti e due gli antibiotici. Io ottengo una chimera se all'interno ci inserisco del DNA estraneo, è come se avessi fatto un knock out. Il plasmide ricombinante se lo inserisco all'interno di una cellula ospite conferisce la resistenza all'ampecillina.

Proteina RecA e mutazioni

Per evitare che una molecola possa ricombinare con il cromosoma batterico, si inibisce la proteina RecA­. Bisogna fare un mutante in cui la proteina non funzioni correttamente, si va così incontro a degradazione. I plasmidi una volta entrati nella cellula, poiché dotati di un'origine di replicazione, e poiché manca RecA, si replicano all'interno della cellula, indipendentemente che sia ricombinante o meno. RecA è una proteina che permette la ricombinazione tra due molecole di DNA, tra due sequenze omologhe.

Betagalattosidasi e X gal

La betagalattosidasi è un enzima capace di tagliare i legami betaglicosidici. X gal ha un gruppo cromoforo legato con un legame betaglicosilico al resto della molecola. La loro domma dà una colonia celeste. Se nella cellula non c'è betagalattosidasi ma metto la X gal, non viene distrutta la molecola, il gruppo cromoforo non si libera e la molecola rimane bianca. Posso costruirmi un vettore con il gene dell'ampecillina che mi serve a tracciare il plasmide ed il gene lac Z per vedere quali sono ricombinanti e quali hanno solo il plasmide, perché hanno la galattosidasi.

Riconoscimento delle colonie

Se io volessi riconoscere immediatamente colonie che contengono plasmide ricombinante da quelle che contengono solo il vettore, devo andare a vedere il colore, la grandezza, la forma, caratteristiche fenotipiche delle colonie. Bisogna capire come colorarle in maniera diversa, trovare un marcatore molecolare che ci permettesse di farlo. Si replica la piastra su una seconda piastra, quelle che non ci sono sono colonie che non sono resistenti alla tetraciclina.

Immaginando di aver usato un vettore per il clonaggio che contiene ampicillina, colonie resistenti all'ampecillina sulla piastra, si tiene la piastra nel termostato per 2/3 giorni, si hanno più colonie, intorno alle colonie madri iniziali si hanno delle coloniette intorno disposte in cerchio, tanto più si allontanano dalla colonia madre sono sempre più piccole. La proteina della resistenza all'antibiotico è una proteina di secrezione.

Teoricamente le cellule sensibili all'ampecillina muoiono tutte, in realtà alcune rimangono ferme, metabolicamente inattive, alcune di queste saranno distribuite anche intorno alle colonie resistenti all'ampecillina, e se queste cominciano a buttare fuori l'enzima che degrada l'ampecillina, quindi intorno alla colonia madre diminuisce la concentrazione di ampecillina, a quel punto le colonie inattive cominciano a replicarsi e danno origine ad una nuova colonia. Le cellule metabolicamente inattive che sono più lontane dalla colonia madre cominceranno a moltiplicarsi dopo. Le colonie satellite sono bianche perché non hanno il vettore poiché sono sensibili. Le colonie satelliti crescono sia intorno alle colonie blu che a quelle bianche.

Effetti del gene lacZ

Se il gene lacZ non funziona più, la cellula rimane bianca. Il ceppo di Escherichia coli che funziona da ospite deve essere un ceppo recA­, non deve avere un gene lacZ funzionante sul cromosoma, quindi deve essere un ceppo batterico che porta la delezione del gene lacZ, altrimenti ci maschererebbe l'effetto della trasformazione. Dovrà essere anche mutato sul gene che codifica l'enzima di restrizione che altrimenti, se entrasse del cromosoma, potrebbe capitare che l'enzima se lo mangi. Bianche o celesti a seconda che portino un vettore o un enzima di restrizione.

Falsi positivi e negativi

Falsi positivi: le colonie positive, ovvero quelle bianche che contengono un plasmide ricombinante, si vede una colonia bianca che però all'interno non ha un plasmide ricombinante ma troviamo ad esempio il vettore da solo. Potrebbe essere avvenuta una mutazione nel gene lacZ e non funzionare più, oppure a livello del promotore che non permette la trascrizione del gene.

Falsi negativi: colonie celesti in cui ci aspettiamo di trovare dei vettori ed invece ci troviamo plasmidi ricombinanti. Si possono riconoscere i falsi negativi perché tra queste colonie ci sono delle cellule più scure. Ci sono quindi più cromoforo concentrati quindi sono stati degradati una quantità maggiore di X gal. Se c'è più betagalattosidasi ci sta che sia trascritto più efficientemente che in una colonia celeste. Se io inserisco al suo interno un frammento di DNA passeggero con un promotore molto forte, posso avere una maggior trascrizione di lacZ, quindi abbiamo più betagalattosidasi.

Riconoscimento dei trasformanti e PCR

PCR I: reazione a catena della polimerasi, scoperto da Kary Mullis, amplificazione in vitro di un frammento di DNA. Metodo che permette di ottenere una quantità quasi illimitata di un segmento di DNA in un tempo brevissimo tramite una reazione catalizzata da DNA polimerasi. Ci basta una copia di quel segmento per averne tantissimi. Fingerprinting molecolare. Tanto si gioca sulla specificità.