Ingegneria Genetica

2) I+ Z- Y+/ F I- Z+ Y+

E’ ancora una volta il caso di una induzione. Inoltre, Z- viene compensato da

Z+ del plasmide F

3) Esiste una seconda categoria di mutanti di tipo IS (mutanti superrepressi).

IS+ sono dominanti su I+ e I-. Anche in presenza di lattosio non ci sarà alcun

tipo di induzione, persino in presenza di IPTG. La spiegazione di una

repressione così totale giace probabilmente a livello di una alterazione del sito

di legame stereospecifico e distruggendo il legame all’induttore.

L’inibitore (R) di IS non può legare l’induttore, quindi non c’è repressione

dell’inibitore. Non c’è interazione e quindi induzione. (il caso in basso è quello

che dovrebbe accadere).

4) Una terza classe di mutanti riguardano l’operatore (l’operatore è stato

definito proprio grazie a questi studi; si sono stati fatti dei saggi di foot printing

per capire la posizione dell’induttore sull’operatore).

L’operatore è un cis-agente. Le mutazioni di quest’ultimo (Oc, operatore

costitutivo) generano ceppi in cui il repressore non può legarsi all’operatore lac

(situazione di cis-dominanza). In mancanza di inibizione, l’espressione

dell’operone lac è valida anche in assenza di induttori.

Regolazione di lac con glucosio

- Regolazione negativa inducibile: il glucosio previene l’espressione

dell’operone lac (il glucosio è la fonte di carbonio preferita, quindi è usato

prima del lattosio)

- Sistema di repressione da catabolita: esiste anche una forma di repressione

da catabolita (cap un fattore di trascrizione, che lega c AMP se è presente nella

cellula. Il promotore stesso contiene CAP/c AMP binding sites).

C’è quindi un doppio livello di regolazione, che permette un sistema efficiente e

molto fine: non p un semplice sistema ON/OFF, ma è graduale e controllato. Se

fosse un meccanismo acceso/spento, il lattosio non potrebbe entrare in cellula

per mancanza della permeasi. Ecco perché, quando il glucosio termina, si

produce una piccola quantità di c AMP per permettere un esiguo numero di

trascritti dell’operone lac. In questo modo la cellula presenta un certo numero

di permeasi, che verranno usate al termine dell’uso del glucosio (la cellula non

viene presa di sorpresa)

- La c AMP è un effettore

- Bassso glucosio  alto c AMP

- Alto glucosio  basso c AMP

Se il glucosio è assente, la CAP lega il c AMP. Tale complesso lega il promotore

ed esercita un’azione positiva sulla trascrizione dei geni lac; per permettere

l’induzione dovrà anche legarsi al DNA.

Operone TRP

- Regolazione con processo di attenuazione, che si basa sulle strutture

secondarie dell’m RNA che codifica per le proteine dell’operone W. È un sistema

indipendente dal pathway di repressione, ed è mediato dalla regione leader

dell’operone.

- Regolazione negativa: di repressione, che si basa sul controllo dell’inizio della

trascrizione. Si tratta della codifica di un repressore (trpR) che agisce con il

triptofano stesso (è un co-repressore). Nello stato di repressione, l’operone trp

presenta 70 volte di livelli di trascrizione più bassi.

Nota: l’attenuazione riguarda anche altri operoni per aa

Elementi di regolazione della trascrizione

Fattori di trascrizione

Promuovono la trascrizione legando DNA e attivando la trascrizione. Tali due

funzioni risiedono in domini separati della proteina. L’attivazione avviene

attraverso l’interazione con altri TFs o RNA pol

Sequenze di regolazione

Promotore

- Sequenza modulare (possiede sottosequenze con funzioni diverse tra loro.

Ogni modulo lega proteine specifiche che innescano la trascrizione)

- Sono stati evidenziati grazie alla costruzione di mutanti di cui si variava la

lunghezza delle sequenze antecedenti a quelle codificanti. Facendo delezione

di alcune sequenze, tra cui alcuni moduli del promotore, l’efficienza di

trascrizione variava notevolmente.

Nota: a livello di lab, per definire se una sequenza è o non è un promotore,

utilizzo un gene reporter e clono in vettori di espressione. Se il sistema reporter

viene sintetizzato (poiché posto successivamente ad una sequenza che si

sospetta contenere un promotore), allora quella sequenze è un promotore.

Nota: come si possono individuare i moduli del promotore? Induco mutazioni a

livello dei singoli nucleotidi, e per ogni sequenza mutande vado a quantificare

l’efficienza di trascrizione. Per fare ciò, isolo gli m RNA prodotti da ogni

filamento con promotore mutato. Prenderò tali m RNA e li retrotrascrivo, al fine

di ottenere c DNA. Utilizza tale c DNA come base di amplificazione, utilizzando

primer marcati con fluorocromi. Il prodotto di amplificazione è fluorescente e se

ho usato la PCR real time, posso quantificare il trascritto di partenza. In

parallelo dovrò aver allestito varie altre prove con cui potrò costruire una retta

di taratura. A questo punto posso individuare il valore di fluorescenza registrato

e quindi definire il numero di trascritti in provetta.

FRET (fluorescence resonance energy trasfer): tecnica usata per caratterizzare

molecole biologiche, soprattutto a livello delle interazioni tra loro. Nel nostro

caso vogliamo usarlo per visualizzare mutazioni dei promotori attive o no. La

tecnica si basa sull’uso di due fluorocromi, uno usato per definire che un

filamento di DNA è libero (rosso) mentre per definire se un filamento è

occupato se ne usa uno verde, a cui la molecola con cui il DNA interagisce (da

un promotore, da un TF) è legata. Se il filamento è libero il fluorocromo rosso

assorbe ed emette energia; se invece si presenta la molecola che lega il DNA,

per il fenomeno di risonanza l’energia liberata si trasmette al fluorocromo

verde. In questo modo, posso capire quali promotori mutanti presentano moduli

che ancora interagiscono con le proteine di trascrizione.

- Tutto l’insieme di tali esperimenti serve a caratterizzare mutazioni di

promotori a livelli dei nucleotidi, che definiranno una diversa efficienza di

trascrizione.

- Altri saggi di efficienza del promotore sono per esempio il saggio con la

luciferasi.

I promotori eucariotici si dividono rispetto al tipo di RNA pol che utilizzano (I, II,

III)

Classe I

- Rappresenta il 50% dell’attività trascrizionale nella cellula eucariotica

- L’unico prodotto di questa trascrizione è il pre- r RNA, che attraverso un

processo di maturazione, produce le specie mature r RNA 18-5, 8-28S

- Clusterizzati su uno o pochi cromosomi specifici, rispetto a regioni

morfologicamente distinte che prendono in nome di NOR (organizzatori

nucleolari  il nucleolo è la porzione di nucleo in cui permangono gli r RNA in

maturazione). Con la microscopia elettronica si possono visualizzare degli

“alberi” di r RNA che si replicano continuamente. Ogni “ramo” dell’albero

accoglie più di una RNA pol I che replica mano a mano i geni di r RNA.

Nota: è stato dimostrato che ci sono ribosomi anche nel nucleolo. Si è

confermati con gli studi sulle NMD: sono alleli mutati di geni in cui è insorto un

codone di stop, che quindi rendono m RNA non utili. Questo m RNA viene

degradato, ma prima viene “provato” da questi ribosomi, che fanno una

traduzione di prova. Se il prodotto è attivo l’m RNA passa oltre, se non lo è,

viene degradato.

Promotori di classe I (geni per r RNA) è composto di due moduli principali:

- Promotori Base (o centrale) compreso tra -45 + 20. Comprende all’interno

l’inizio di trascrizione (1+). La delezione di tale sequenza o la sostituzione con

un altro oligonucleotide, diminuisce drasticamente la trascrizione dell’r RNA.

- Elemento a controllo a monte (UCE) compreso tra -156 e -107, determina un

aumento significativo del tasso di trascrizione a partire dal promotore centrale

Nota: La distanza e l’orientamento reciproco tra le due regioni di controllo è

fondamentale per l’efficienza di trascrizione.

Fattori di trascrizione di classe I

- UBF-1 e SL-1 (nelle cellule umane) che assieme alla RNApol I promuovono la

trascrizione dei geni per r RNA.

- UBF-1 si lega alla regione 3’ UCE e ad una sequenza del promotore base

- SL-1 non interagisce con il DNA ma rafforza l’interazione dell’UBF-1 con il

promotore centrale. (formano un complesso che diventa una piattaforma che

accoglie l’RNApolI). Inoltre questa proteina è specie-specifica. Forma un

complesso con la proteina TBP che lega la TATA box ed altri tre fattori associati

alla TBP. Tuttavia, dato che SL-1 non si lega al DNA, interagisce con più proteine

diverse per formare complessi multifattoriali.

Classe III

- Gli RNA trascritti da questi geni codificano per piccoli RNA per la sintesi

proteica, come i t RNA e gli r RNA 5s, RNA di trasporto come RNA 7s ed RNA

per i processi di maturazione post-trascrizionali.

Promotori di classe III

Si trovano all’interno della sequenza codificante stessa. Cioè in alcuni punti,

regioni codificanti e quelle regolative coincidono, quindi le due non possono

evolvere indipendentemente, come accade per gli altri geni. Devono co

evolvere, il che è un fenomeno complesso e sfavorito. Tale caratteristica fu

evidenziata grazie a delle analisi di delezione condotte sul gene 5S di Xenopus.

Sintetizzo dei filamenti che sono progressivamente più corti al 5’: quando le

delezioni mangiano via il promotore, la trascrizione non viene più eseguita. Nel

nostro caso, i filamenti deleti trascrivevano anche se la delezione arriva nei

pressi della sequenza codificante. Tale studi hanno fatto emergere la presenza

di ICR (regioni di controllo interne) tra le posizioni 50+ e 90+, che ad una

analisi approfondita è stata suddivisa in:

- A Box (+50/+64), particolare di tutti i promotori di tali geni

- C box (+80/+90) caratteristica dei geni 5S

Nota: ancora una volta la distanza tra le due box è fondamentale

Nota: per i t RNA l’A box è a +10/+20 mentre la B box è tra +50/+65

Nota: per avviare la trascrizione di RNA III richiede l’intervento di attori proteici.

Tutti i geni che presentano ICR hanno bisogno di TFIIIB e TFIIIC1-C2 mentre i 5S

richiedono TFIIIA.

Classe II

- Generano trascritti di proteine, cioè m RNA e RNA di tipo U (tranne l’U6) che

fomano le snRP (snRNA)

- Modificazioni post trascrizionali come cappuccio, cosa di poli A, splicing.

Promotori di classe II: posti a monte del gene e modulari. (esistono anche

promotori alla valle del gene come il DPE ma possono anche non esserci)

Nota: i moduli servono a diluire l’effetto delle mutazioni sulle regio