Ingegneria Genetica

Ingegneria genetica

Glossario

Fenotipo: insieme di tutte le caratteristiche osservabili di un organismo vivente, quindi la sua morfologia, il suo sviluppo, le sue proprietà biochimiche e fisiologiche comprensive del comportamento.

Genotipo: insieme di tutti i geni che compongono il DNA di un organismo o di una popolazione.

Complementazione: ripristino di un fenotipo normale o selvatico (in assenza di ricombinazione) in un individuo doppio eterozigote per due mutazioni che interessano lo stesso carattere ma che sono localizzate in geni diversi. In questo caso si dice che le due mutazioni determinano la sintesi delle corrispondenti proteine funzionali.

Mutazione: si intende ogni modifica stabile ed ereditabile nella sequenza nucleotidica di un genoma o, più generalmente, di materiale genetico (sia DNA che RNA) dovuta ad agenti esterni o al caso, ma non alla ricombinazione genetica.

Epistasi: l'epistasi è una forma di interazione fra geni. Il fenomeno si verifica quando una coppia di alleli copre l'espressione fenotipica di un'altra coppia di alleli. Le caratteristiche fenotipiche dell'individuo saranno pertanto date dalla risultante di questa interazione; il gene che maschera l'espressione di un altro gene viene definito epistatico, il gene la cui espressione viene mascherata viene definito ipostatico.

Mappa genetica: è una rappresentazione della distanza che separa i geni, basata sui dati di ricombinazione genetica.

Gene: sequenza nucleotidica che codifica per un insieme di prodotti cellulari (proteina, RNA, ribozimi). È l'unità ereditaria fondamentale degli organismi viventi.

• Strutturalmente, presentano regioni codificanti utili a definire segnali precisi (inizio trascrizione, fine trascrizione, regolazione, etc.).
• Possono essere costitutivi o regolati.
• Presenza di zone codificanti e non codificanti (che, se non sono state eliminate dall'evoluzione, significa che sono in qualche modo utili).

Frame di lettura: schema di lettura di una sequenza nucleotidica (definita dal primo nucleotide).

Genoma: insieme di tutta l'informazione genetica di un individuo che appartiene ad una determinata specie, permette alla cellula di assolvere le sue funzioni basilari: metabolismo, riproduzione. Tutta questa informazione è presente nel genoma. Il cromosoma è la struttura con cui, durante il processo riproduttivo della cellula, ciascuna unità funzionale di DNA, dopo essersi duplicata, si compatta associata a specifiche proteine e viene trasmessa alle cellule figlie.

A seconda della localizzazione del DNA, i cromosomi iniziano ad evidenziarsi nel nucleo negli organismi eucarioti, o in una regione chiamata nucleoide nei procarioti, per poi migrare nella cellula nelle varie fasi della mitosi. Le cellule dei procarioti hanno un singolo cromosoma di forma circolare costituito da DNA a doppio filamento. Spesso sono presenti ulteriori molecole di DNA circolari indipendenti dal cromosoma, i plasmidi e gli episomi. Queste unità sono più piccole del cromosoma e solitamente non sono fondamentali per la vita della cellula, ma in genere portano geni che conferiscono alle cellule caratteristiche fenotipiche particolari, ad esempio la resistenza ad un antibiotico.

Negli eucarioti i cromosomi hanno forma lineare, hanno dimensioni maggiori e il loro numero è specie-specifico (ad esempio nell'uomo si hanno 46 cromosomi, nel topo 40 e nel cane 78). Va sottolineato che il numero cromosomico non è sempre associato alla complessità strutturale degli individui di una specie. In molti eucarioti ciascun cromosoma è presente in doppia copia nella cellula, quindi il corredo cromosomico viene detto diploide. Ogni copia deriva da ciascun genitore. L'organismo diploide (zigote) deriva dalla fusione di due cellule aploidi (gameti) in cui è presente solo una copia di ciascun cromosoma.

Negli eucarioti il DNA è sempre legato a proteine, istoniche e non istoniche, attorno alle quali il filamento si avvolge a formare complessivamente una struttura chiamata cromatina. La cromatina si può colorare con alcuni coloranti istologici, da cui il nome; se ne possono distinguere due tipi: l'eucromatina, debolmente colorabile, dalla struttura più aperta e quindi trascrizionalmente attiva, e l'eterocromatina, intensamente colorabile, maggiormente condensata (rimane condensata anche in interfase) e trascrizionalmente inattiva. L'eterocromatina può essere ulteriormente distinta in costitutiva e facoltativa. L'eterocromatina costitutiva è costituita da regioni di DNA altamente ripetitivo, costanti in tutte le cellule dell'organismo e nel cromosoma si concentra principalmente a livello del centromero e dei telomeri.

L'eterocromatina facoltativa può diventare condensata e diventare temporaneamente inattiva, inoltre può essere inattivata solo in determinati tessuti o in determinati stadi dello sviluppo. Ciascun cromosoma nella cromatina è troppo despiralizzato e aggrovigliato per essere distinto nella sua individualità; dopo la fase S, essendosi replicato, risulta formato da due filamenti di DNA associati a proteine, ma è ancora indistinguibile. La duplicazione del DNA determina la formazione di due copie identiche (cromatidi fratelli) che rimangono unite a livello del centromero, il quale si è duplicato ma non si è separato.

Durante la mitosi la cromatina si condensa ed è possibile distinguere i cromosomi nell'arco di tempo che intercorre tra la profase e la metafase mitotica. La loro dimensione massima è dell'ordine del micrometro e durante la metafase presentano una forma ad X poiché sono costituiti da due filamenti distinti di DNA altamente condensati, i cromatidi fratelli, associati tra loro grazie al cinetocore, un complesso proteico legato al centromero. I cromatidi fratelli sono destinati a dividersi ed essere segregati alternati nelle cellule figlie che si formeranno alla fine del processo mitotico. Dopo la separazione vengono definiti cromosomi figli e la loro migrazione verso i poli della cellula è dovuta alla contrazione dei microtubuli del fuso mitotico attaccati al loro cinetocore. Nelle due nuove cellule appena originate i cromosomi sono di forma bastoncellare e l'unica struttura evidente al microscopio è la strozzatura determinata dal centromero.

Una struttura importante per la segregazione dei cromosomi durante la mitosi è il centromero (o costrizione primaria), una regione di DNA altamente ripetuto associata ad una impalcatura proteica. Esso non occupa la stessa posizione in tutti i cromosomi e divide ogni cromatidio in due parti, i bracci (lungo=q, corto=p), la cui lunghezza dipende dalla posizione del centromero stesso. Al microscopio ottico, i cromosomi sono distinguibili tra loro per le dimensioni e per la "forma", ossia per la posizione del centromero. Ulteriori distinzioni si possono effettuare con opportuni trattamenti chimici, che evidenziano un bandeggio riproducibile: ogni cromosoma ha infatti uno specifico pattern di bande, che permette di distinguerlo dagli altri cromosomi e che permette di individuare eventuali mutazioni cromosomiche. In base alla posizione del centromero si distinguono quindi cromosomi:

• Acrocentrici: centromero in posizione subterminale (in prossimità di una delle estremità).
• Telocentrici: centromero in posizione terminale.
• Submetacentrici: centromero in posizione submediana (spostato verso una delle due estremità).
• Metacentrici: centromero in posizione mediana.

I cromosomi acrocentrici sono caratterizzati da strutture particolari presenti all'estremità del braccio corto, i satelliti. Si tratta di elementi morfologici caratteristici, costituiti da DNA β-satellite, connessi all'estremità del braccio corto attraverso una strozzatura detta costrizione secondaria. In quest'ultima è localizzato il cosiddetto NOR, ossia l'organizzatore nucleolare; esso contiene i geni per gli RNA ribosomiali ed è quindi sede della sintesi dei ribosomi. Inoltre il NOR provvede alla formazione del nucleolo, pertanto la visualizzazione del nucleolo al microscopio ottico indica che nella cellula c'è un'intensa attività di sintesi proteica.

Le regioni di DNA alle estremità del cromosoma costituiscono i telomeri, strutture che rivestono un ruolo fondamentale per l'integrità del cromosoma stesso. I telomeri sono costituiti da sequenze di DNA altamente ripetitivo, in genere sono formati da eterocromatina quindi non codificano per proteine. La loro funzione è quella di proteggere il cromosoma da tutti quegli eventi che ne provocano l'instabilità, infatti un cromosoma con un'estremità danneggiata può facilmente attaccarsi ad altri e dare luogo a mutazioni cromosomiche, come ad esempio le traslocazioni. Numero, lunghezza e forma dei cromosomi costituiscono il cariotipo di un individuo.

• Batteri: singolo cromosoma a DNA circolare a doppio filamento.
• Eucarioti: presenti in multipla copia, il loro numero è specifico. Deve essere capace di replicarsi grazie alle ARS (autonomus replication sites, sito di legame per la polimerasi). Deve essere chimicamente e fisicamente stabile, nessuna sua informazione deve essere persa (altrimenti causerebbero aberrazioni, molto spesso incompatibili con la vita. In genere, se il cromosoma perduto è abbastanza lungo, c’è più possibilità che il gamete non sia vitale).

Centromero: è una struttura del cromosoma fatta da acidi nucleici e proteine. Il centromero è in grado di assemblare un’altra struttura del cromosoma (che fa parte del cromosoma solo quando c’è la divisione cellulare), cioè il cinetocore (struttura che si assembla al centromero). Se il centromero non è presente, il cromosoma non segrega, se ce ne sono 2 o 3 il cromosoma si spezza in anafase.

Negli afidi, i centromeri sono olocentrici, ossia, non è possibile definire un centromero preciso. Visualizzando un cromosoma si dovrebbe visualizzare subito, dato che è la costrizione primaria immediatamente visibile. Negli afidi il centromero è diffuso. Dato che a livello centromerico ci sono proteine specifiche, che rendono l’attacco al fuso, significa che tali proteine specifiche sono in realtà distribuite lungo tutto il filamento, e che la segregazione avviene trascinando l’intero frammento, ancorato in più punti, in un'unica direzione.

Telomero: strutture terminali del cromosoma, utili ad impedire l’accorciamento del cromosoma (dato che, durante la replicazione, per la differenza di tempi con cui i filamenti vengono sintetizzati, manca il primer per le porzioni terminali. È un problema dei repliconi lineari, ovviato con le telomerasi). Tali strutture non presentano sequenze codificanti ma sequenze ripetute codificanti (nell’uomo TTAGGG). Sono solamente strutture di acidi nucleici + proteine.

Cariotipo: l’insieme ordinato di tutti i cromosomi ordinati secondo caratteristiche morfologiche tenendo allineate le posizioni dei centromeri.

Idiogramma: è il cariotipo rappresentato in modo diagrammatico in modo da evidenziare le caratteristiche dei cromosomi. NB: il numero dei cromosomi e il loro bandeggio non è uguale in tutte le specie.

Drosophila melanogaster

La Drosophila melanogaster è un organismo modello, ovvero uno degli organismi più studiati nella ricerca biologica, in particolare nella genetica e nella divulgazione biologica. I motivi sono molteplici:

• Si tratta di un insetto piccolo e facile da allevare in laboratorio.
• Ha un breve tempo di generazione (circa 2 settimane) e una elevata produttività (ogni singola femmina può deporre fino a 600 uova in 10 giorni).
• Le larve mature mostrano cromosomi politenici nelle ghiandole salivari.
• Hanno solo 4 paia di cromosomi: 3 autosomi e 1 sessuale.
• I maschi non mostrano ricombinazioni genetiche, facilitando gli studi genetici.
• Tecniche di trasformazione genetica sono state disponibili dal 1987.
• Il sequenziamento del suo genoma è stato completato nel 1998.
• Le mutazioni genetiche nella specie sono molto frequenti.

La Drosophila ha 4 paia di cromosomi: una coppia X/Y e tre coppie autosomiche etichettate 2, 3, e 4. Il quarto cromosoma è così sottile che è spesso ignorato. Il genoma, che è stato interamente sequenziato, contiene 132 milioni di basi e approssimativamente 13.767 geni. Da un punto di vista genetico l'uomo e il moscerino della frutta sono abbastanza simili. Circa il 60% delle malattie genetiche conosciute si possono verificare nel patrimonio genetico del moscerino, e circa il 50% delle proteine della Drosophila hanno un analogo nei mammiferi. I geni che prendono il nome da alleli recessivi hanno l'iniziale minuscola, mentre gli alleli dominanti hanno l'iniziale maiuscola. I geni che prendono il nome dalla proteina prodotta hanno l'iniziale maiuscola. I nomi dei geni sono solitamente scritti in corsivo. La convenzione di scrittura dei genotipi è X/Y; 2nd/2nd; 3rd/3rd.

Tutte le cellule presentano lo stesso patrimonio genetico, quindi dovrebbero dimostrarsi tutte allo stesso modo. Eppure, ci sono eccezioni. Nella Drosophila, all’interno dello stesso organismo, i genomi di cellule diverse è identico, eppure la forma di replicazione è diversa. Per esempio, nelle ghiandole salivari delle larve, si osserva il cromosoma gigante (politenico): questo si origina da un cromosoma la cui segregazione non segue alla fase S. E così via, per 10 volte, la segregazione non avviene. In tal modo non ci saranno più cromosomi diversi, ma solo uno, gigantesco. Questo evento prende il nome di endoreplicazione del DNA. Il nucleo diventa enorme ma la cellula non si divide. Lo spessore di un filamento sarà 2¹⁰ il singolo filamento; sono anche lunghissimi, dato che sono cromosomi fermi all’interfase. Se fossero in metafase sarebbero spessi ma non così lunghi. Eppure, non si troveranno mai in metafase (per le 10 volte non ci sarà metafase, il numero di cromosomi rimane lo stesso, varia solo lo spessore del filamento, questo finché la larva non diventa pupa). La spiegazione di questa diversità riguarda la rappresentanza di un gene: le ghiandole salivari hanno bisogno di avere alta rappresentanza a livello genomico, per rendere molti trascritti e quindi una alta espressione. Soprattutto a livello larvale, in cui la larva ha necessità di nutrirsi continuamente. Tutti i cromosomi giganti si collegano a livello di un unico centromero, che comprende tutti i centromeri dei singoli cromosomi.

Caratteristiche di centromeri e zone pericentromeriche:

• Non presentano ORF.
• È una zona in cui la condensazione della cromatina è sempre molto compatta, sotto forma di eterocromatina, il che non permette l’attacco della polimerasi e quindi la replicazione (ecco perché è una zona sotto replicata).

Genoma dei ciliati

I ciliati sono organismi unicellulari che si possono trovare nei mari, in acqua dolce, nel terreno e dovunque ci sia acqua. I ciliati appartengono al gruppo dei protisti. Sono tra i più differenziati e sviluppati. La loro superficie cellulare è ricoperta completamente da organelli simili a peli chiamati “ciglia”.

Sono binucleati (hanno due nuclei): un nucleo assolve funzioni vegetative e sono definiti macronuclei, un altro nucleo assolve funzioni riproduttive ed è definito micronucleo. In questi nuclei, il genoma, strutturalmente è differente. Nei macro, i cromosomi sono piccoli e tantissimi, nel micro i cromosomi sono lunghi. In realtà la cellula figlia ha un solo nucleo e successivamente, per mitosi, vengono prodotti i due nuclei che hanno origine comune ma funzione diversa. Anche in questo caso la spiegazione riguarda la “rappresentanza” del gene, ossia, un grande numero di piccoli cromosomi renderà moltissimi trascritti, che asserviscono alle funzioni vegetative.

Nota: epatociti umani

Nell’Homo sapiens, negli epatociti sono presenti più di 46 cromosomi. Gli epatociti sono poliploidi. È il raddoppio o triplicare il numero dei cromosomi. Nello zigote questa situazione provoca la morte dello zigote. Negli epatociti questa situazione è una condizione fisiologica.

Genomica batterica

Il genoma procariotico è una molecola circolare, stabile, deve essere capace di esprimere i propri geni. La sua stabilità è determinata dal fatto che non ha estremità libere e nella segregazione utilizzano una porzione di DNA che prende contatto con la membrana interna, cioè il mesosoma. Non presentano nucleo, esprime i geni.

Eccezione: esistono batteri con genoma lineare o con più copie dello stesso genoma circolare.

Nota: mappe genetiche

Possono essere di due tipi: mappe genetiche e mappe fisiche. Le mappe genetiche rendono informazioni su posizione, ordine, distanza tra loci (grazie al sistema degli incroci, quindi alla ricombinazione). Nel caso dell’uomo, questa pratica è sicuramente più difficile, per cui si utilizza lo studio di alberi genealogici, guardando l’aplotipo con cui costruire mappe genetiche. Mappe fisiche: distanza fisica lungo il cromosoma, espressa in coppie di basi. Aplotipo: la combinazione di varianti alleliche lungo il cromosoma contenente loci in linkage disequilibrium, cioè strettamente associati tra loro che di solito vengono ereditati assieme.

I batteri sono aploidi, non fanno numerose meiosi. Eppure ricombinano con metodi come trasformazione, trasduzione, coniugazione.

Metodologie di identificazione e conta batterica: sistemi di selezione

Caratteri seguiti:

• Biosintesi di aa
• Utilizzo di zuccheri
• Resistenza ad antibiotici

I batteri detti auxotrofi sono incapaci di sintetizzare molecole essenziali, al contrario sono detti prototrofi.

1. Selezione di mutanti per biosintesi aa

In questo modo dalla coltura è possibile isolare cloni mutanti per il triptofano.