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Ingegneria Genetica Appunti scolastici Premium

Appunti di ingegneria genetica su: Metodologie per la manipolazione genetica, eucariotica e procariotica basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Marsano dell’università degli Studi di Bari - Uniba. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Ingegneria genetica docente Prof. R. Marsano

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vantaggio di avere cloni con porzioni overlap, ossia sovrapposti.

In alternativa la frammentazione di questo DNA genomico può avvenire per

rottura meccanica.

- Tali frammenti vengono inseriti in vettori, e quindi in batteri. Ciascun

frammento, contenente una sequenza di DNA, formerà assieme agli altri una

libreria genomica.

Nota: screening di una libreria genomica usando l’ibridazione con una sonda

marcata.

Librerie di c DNA: rappresenta tutto l’insieme dei trascritti di un particolare

tessuto, retro trascritti in DNA con RT. Tale tipo di libreria non rappresenta

l’intero genoma, ma solo la porzione che viene espressa. Infatti sono

notevolmente usate a livello della genetica inversa. (dal gene al fenotipo).

- Si isola anzitutto l’insieme di m RNA della cellula. Questo può avvenire

impaccando una colonnina cromatografica con una resina che porta legati degli

oligodT in modo da permettere il legame con i trascritti maturi grazie alla coda

di poliA.

- Viene permessa la retro trascrizione per mezzo dell’RT. Alla fine di questo

passaggio avremo un ibrido m RNA- c DNA; interverrà quindi l’RNAsi H, che

degraderà solo l’m RNA

- Tutti questi c DNA sono diversi gli uni dagli altri: userò quindi dei primer

random che possono appaiarsi un po’ ovunque (un po’ come il random

priming). In tal modo, amplificheremo più filamenti di DNA possibile.

- Cloniamo i frammenti ottenuti in vettori di espressione particolari. Questi

presentano delle sequenze di controllo, che diano al frammento una certa

direzionalità utile alla trascrizione. Durante l’inserimento userò due ER diversi

per digerire i frammenti di c DNA e il vettore, così posso decidere in che

direzione avverrà l’inserimento di DNA eterologo.

Nota: i siti di restrizione possono essere aggiunti al frammento grazie a degli

“adattatori”, sequenze da 20 nucleotidi completi di siti di restrizione.

Nota: i vettori di espressione sono specie-specifici; in più promotore e sequenze

di terminazione fanno già parte del vettore di espressione.

Ibridazione

Complementarietà tra due filamenti (DNA/DNA o RNA/DNA). Necessita di una

sonda (probe) e di un filamento bersaglio (target).

La sonda o il target devono essere marcati. La marcatura può essere di tipo:

- Radioattivo (anche detta a caldo; visualizzazione o amplificazione di un

segnale per mezzo di radioattività). Viene visualizzata grazie a metodi

autoradiografici.

- Non radioattivo (anche detto a freddo; visualizzazione o amplificazione di un

segnale grazie a marcatura con anticorpi, enzimi, substrati). Le molecole

portano legato un florocromo che quindi ha proprietà fluorescenti che possono

essere sfruttate.

- Terminale (marcatura 5’ e/o 3’)

- Interna (nick translation o random priming)

Saggio di ibridazione: ha come obiettivo la formazione di un ibrido

eteroduplex tra sonde marcate a singolo filamento e sequenze complementari

all’interno di un bersaglio molecolare.

L’ibridazione di acidi nucleici è la fusione di sequenze nucleotidiche provenienti

da genomi diversi. Si tratta della formazione di eteroduplex in cui una strand

deriva da una molecola di DNA e l’altra che deriva da un’altra molecola; quindi

è la formazione di una doppia strand a partire da 2 strand di origine diversa.

Possono appartenere alla stessa specie o a diverse. Questo meccanismo

prevede l’uso di una sonda e di un target. La sonda per risultare visibile deve

essere marcata. Sono stati sviluppati sistemi di marcatura per gli acidi nucleici:

caldi (marker radioattivi) o freddi (bioluminescenza, fluorescenza). I traccianti

radioattivi possono essere seguiti attraverso macchinari come “scintillatori” o

come solitamente vien fatto attraverso emulsioni fotografiche. Per i traccianti

non radioattivi posso sfruttare le qualità del tracciante stesso in quanto molte

molecole sono fluorescenti. Hanno la proprietà di essere eccitabili e di emettere

una radiazione (fotoni a lambda specifici). Queste molecole hanno uno spettro

di eccitazione e di emissione. In un saggio di ibridazione standard distinguiamo

un probe, una sonda a DNA uniformemente marcata e un target, un genoma di

DNA. Sia il target sia il probe sono denaturati (devo creare le singole strand).

Una volta create le single-strand mettiamo insieme probe e target e qui

avviene l’ibridazione, cioè la formazione di eteroduplex.

Nota: alla fine, per discriminare gli ibridi dal resto dei prodotti di ibridazione (il

target che si è annilato su se stesso e il probe annilato su se stesso),

immobilizzo una delle molecole (probe o target). Faccio dei lavaggi per

eliminare ciò che non è ibrido, dopo aver immobilizzato solo l’ibrido su un filtro

di nylon (o nitrocellulosa).

Per permettere l’immobilizzazione del DNA su filtro, applichiamo un campo

elettrico per far migrare tutti i prodotti sul filtro (che è carico positivamente).

Successivamente viene fatto cross linking per mantenere il DNA sul filtro grazie

a raggi UV non dannosi per il DNA, il resto viene lavato via.

Nota: Run-off transcription

Utilizzata per ottenere un preciso trascritto da una sequenza. Necessita degli

elementi per la trascrizione (RNApol e ribonucleotidi, stampo DNA). L’RNA pol

usata è quella del fago T7, per reare una sonda ribonucleotidica (riboprobe).

- Scelgo una sequenza di cui voglio fare trascrizione e la predispongo per la

PCR, grazie alla quale includo promotore e terminatore per la sequenza. Se non

avessimo inserito un terminatore, facendo una page ritroveremmo uno smear

chr non ci aiuterebbe a trovare bande precise.

- Inserisco un terminatore (HDV) a forma di forcina. Nel sistema biologico tale

struttura sarebbe una garanzia di terminazione di trascrizione; in vitro è

piuttosto inutile. La sequenza del terminatore viene tagliata, cosicché sul page

possiamo solo visualizzare delle bande precise derivanti dall’RNA e dal

terminatore.

Tipi di ibridazione

Standard (immobilizzo il target) Inversi (immobilizzo il probe)

- Dot Blot - Dot-blot inverso

- Southern Blot/ Northen Blot - Microarray di DNA

- Ibridazione in situ - Microarray di oligonucleotidi

- Colony blot

- Plaque lift

- Su cloni disposti in griglie

Dot-blot con oligonucleotidi allele-specifici (ASO)

Generalmente usato in diagnostica per determinare la presenza di una

mutazione (ex: anemia falciforme, fibrosi cistica)

Viene individuato lo strand su cui è sopraggiunta la mutazione, sia nel caso

della sequenza sana che di quella mutata. Viene sintetizzato un oligo allele-

specifico, ossia una piccola sequenza che riprende solo le triplette utili al nostro

esame e lo uso come probe (marcandolo). Sceglierò di riprendere o la sequenza

sana o quella mutata, rispetto a quale sia la mia intenzione (ossia, voglio dare

riscontro positivo al mutante o al sano?). Faccio cadere una goccia di tre

diverse prove su filtro i nylon: target sano, target eterozigote, target mutante,

dove li immobilizzo. Il probe che inserisco a livello di ogni spot è altamente

specifico (condizioni di stringenza altissime), per cui si appaia o al normale o al

mutante (dipende da come abbiamo allestito l’esame), il che renderò noto un

certo tipo di mutazione grazie ad una specifica colorazione (in questo caso

rende una colorazione celeste la sequenza mutata, il normale è incolore e

l’eterozigote è allo stesso modo colorato).

Nota: esiste anche il reverse dot blot (immobilizzazione del probe)

Southern Blot: ibridazione su DNA complesso per localizzare specifiche

sequenze (prende il nome dal suo inventore).

In questa procedura il gel di agarosio contenente il DNA da trasferire viene

posto su di un ponte di carta da filtro, le cui estremità pescano all’interno di un

recipiente contenente il tampone di trasferimento. La membrana che verrà poi

utilizzata per l’ibridazione viene posta a diretto contatto col gel e coperta con

una pila di tovaglioli di carta o altro materiale assorbente, che per capillarità

richiamerà il tampone di trasferimento attraverso il gel. Le molecole di DNA

vengono quindi trasportate dal flusso di tampone attraverso il gel verso i

tovaglioli di carta, rimanendo intrappolate sulla membrana che non è

permeabile al DNA. Condizione essenziale per un buon Southern Blot è il

pretrattamento del gel. I frammenti di DNA più lunghi di 10kb vengono trasferiti

assai lentamente e con scarsa efficienza. Per permettere quindi il trasferimento

uniforme di una gamma di frammenti il più ampia possibile, il DNA presente nel

gel viene brevemente trattato con una soluzione di HCl seguita poi da una

soluzione alcalina. In questo modo il DNA viene frammentato mediante idrolisi

alcalina dei siti depurinati. Il trattamento con alcali ha anche l’effetto di

denaturare il DNA, formando le singole eliche necessarie per il legame alla

membrana e per la successiva ibridazione con le sonde prescelte. Come ultimo

passo prima di assemblare l’apparato di trasferimento, il gel viene immerso in

una soluzione di neutralizzazione che serve a riportare il ph a valori simili a

quelli del tampone di trasferimento. Un protocollo alternativo a questo prevede

l’uso di membrane di nylon particolari, caricate positivamente; in questo caso

non c’è bisogno di pretrattare il gel in quanto il DNA viene trasferito in forma

nativa e denaturato con alcali direttamente sulla membrana. Dopo il

trasferimento, gli acidi nucleici devono essere fissato sulla membrana, cosa che

non può essere ottenuta con diversi metodi. Le membrane di nitrocellulosa

vengono solitamente essiccate in stufa a 80°, un procedimento che può essere

impiegato anche con certi tipi di nylon. A causa della infiammabilità della

nitrocellulosa è importante però che l’essicazione avvenga sotto vuoto. Un

metodo alternativo di fissaggio di basa sulla irradiazione con luce UV, che

induce la formazione di legami covalenti (UV cross linking) tra una piccola

percentuale dei residui di timina presenti nel DNA e dei gruppi amminici carichi

presenti sulla membrana di nylon. La durata e l’intensità dell’esposizione

devono essere determinate empiricamente per ciascun tipo di membrana. Una

volta fissato il DNA sulla membrana, quest’ultima viene immersa in una

soluzione contenente RNA, DNA a singolo filamento oppure oligonucleotidi la

cui sequenza sia complementare alla sequenza del frammento di DNA che si

vogliono identificare sulla membrana. Tali acidi nucleici marcati vengono

chiamati sonde, poiché effettivamente scandagliano il DNA sulla membrana

consentendo di localizzare le sequenze a loro complementari. Le condizioni di

ibridazione vengono scelte in modo da massimizzare la quantità di sonda

legata al DNA bersaglio limitando al tempo stesso il legame non -specifico con

altri frammenti di DNA e col filtro stesso. Una volta completata la reazione di

ibridazione, la membrana viene lavata più volte per rimuovere l’eccesso di

sonda; le regioni in cui questa è rimasta legata specificamente al DNA vengono

poi evidenziate mediante autoradiografia, ovvero mettendola in diretto

contatto con una lastra da raggi X.

Northen Blot: stessa cosa del Souther Blot ma con RNA che rende strutture

stabili in soluzione.

Applicazioni:

- Studiare la tessuto specificità del gene

- Quantificare il livello di espressione

Saggio di ibridazione su placche fagiche

Utile ad individuare cloni di DNA ricombinante, quindi per le librerie fagiche per

esempio.

- Abbiamo una piastra con diverse placche fagiche provenienti dalla

costruzione di librerie

- Utilizzo un filtro di nitrocellulosa o nylon delle stesse identiche dimensioni

della piastra, in moodo da poterla adagiare sull’agar e prendere qualche fago

per capillarità

- Tratto il filtro per rompere i capsidi ed esporre il genoma fagico (che sarà il

target dell’ibridazione) con una soluzione basica (NaOH). Elimino tutto il resto

con proteasi e lavaggi. Il DNA sarà quindi sul filtro, e lo immobilizzeremo con

cross linking (calore o UV). Questa è nostra base per ibridazione.

- Ibridazione con probe (costruito per appaiarsi con un particolare clone

ricombinante) radioattivo o fluorescente denaturato, lascio ad incubare.

Procedo con vari lavaggi per eliminare gli eccessi: a questo punto il filtro ha le

mie molecole ibride, che saranno fluorescenti o radioattive rispetto alla

marcatura.

- A tal punto riprendo la piastra madre: dall’autoradiografia o fluorescenza avrò

individuato la placca con fagi ricombinanti

Nota: ma come faccio a sapere dove si è legata la sonda sul genoma fagico?

Faccio esattamente come una libreria: utilizzo degli ER per spezzettare

progressivamente il target, creando una mappa di restrizione. Reiterando

l’ibridazione con southern blot, troverò il punto in cui la sonda (sempre quella

iniziale) si lega ad uno dei frammenti.

Colony hybrization

Stessa cosa del saggio di ibridazione su placche fagiche, ma per colonie

batteriche. Si procede nello stesso identico modo. Viene usata per fare lo

screening di BAC.

High density filter hybridization

Serve ordinare cloni di libreria di DNA: le librerie che utilizzano batteri sono

ordinate, a differenza di quelle fagiche, in piastre di microtitolazione in cui

pongo un clone a celletta. Tale processo di ordinamento viene fatto da

macchinari specifici, e queste piastre vengono conservate in refrigeratori a

-80°.

Ex: libreria di batteri in cui il vettore usato è un BAC

- Faccio la trasformazione con elettroporazione (dato che i BAC sono molecole

voluminose). L’efficienza della trasformazione viene calcolata contando il

numero di colonie ricombinanti rispetto al DNA usato per fare la

trasformazione, ossia cfu/ug di DNA.

Per i BAC inseriti con elettroporazionel’efficienza è di 10^10 cfu(ug DNA.

- A seconda dell’efficienza, calcolo su quante piastre vado a seminare il tutto

(2000 per piastra)

- Recupero le colonie ottenute e le sposto della piastra di titolazione. Questo

avviene grazie ad un macchinario che fotografa la piastra e la presenta

all’utente per variare alcuni parametri. Una volta individuate le colonie, un

braccio meccanico picca ogni colonia e dispone le cellule piccate nella celletta

della piastra da microtitolazione. Questo metodo permette di ordinare i cloni in

ambiente sterile e controllato.

A questo punto, per fare una cernita dei cloni possiamo usare la high density

filter hybridization. Il contenuto di ogni celletta deve essere spostata su filtro (è

un processo robotizzato, ancora una volta) che permetterà di stockare molti più

cloni di una piastra. La capacità di alloggiamento di un filtro è di 36.864

colonie, 18.432 cloni indipendenti-ogni piccolo array è di 4x4 in cui 8 colonie

sono ripetute due volte, per minimizzare l’errore (bisogna seguire un manuale).

Ovviamente ogni clone avrà una certa potenza di segnale autoradiografico o

fluorescente, ripetuto per ogni sua copia. Dopo l’ibridizzazione otterrò una

griglia con diversi spot visibili; uso la chiave di lettura per leggerli

correttamente. I cloni che hanno dato segnale corrispondono ad una sola

celletta della piastra di microtitolazione, per cui possiamo risalire alla colonia

che ha ibridizzato.

Screening di un clone ibrido su libreria BAC

Obiettivo: cercare un pezzo di gene, localizzare un locus, etc

- Partiamo dall’intera libreria BAC. Scelgo uno dei blocchi e faccio ibridazioni

rispetto alla piastra, alla riga, alla colonna (tutte assieme).

- Quando riceverò un segnale positivo, potrò risalire alla posizione nella libreria

perché ho le 3 coordinate per rilevarlo.

Nota: se abbiamo fatto clonaggio, il clone stesso può funzionare come oggetto

di screening. Possiamo alternare entry point (sequenze conosciute) per fare

screening successivo. Mi basta una sequenza conosciuta da 100 nucleotidi per

costruire un primer e quindi procedere sulla sequenza. L’importante è che non

siano sequenze ripetute.

Nota: come posso sapere che una sequenza non è ripetuta? Faccio un southern

blot, usando tale primer come sonda. Se la sonda rende un solo segnale si

tratta di una sequenza unica; se ottengo due o più segnali si tratta di sequenze

ripetute e dovrò scartare la sonda. Oppure uso la FISH: la sonda è sempre il

primer in questione, il target sono i cromosomi in metafase. Denaturo

entrambe le cose, faccio ibridazione over night. Lavo via le aspecificità ed

osservo i cromosomi sul microscopio ad epifluorescenza. Se vedo spot luminosi,

ci sarà stata ibridazione. A questo punto confronto i cromosomi ben visibili con

il risultato della FISH.

Nota: con la FISH posso inserire sonde con fluorocromi diversi

Nota: Per aumentare la risoluzione della metodica (dato che i cromosomi in

metafase sono molto condensati, per cui non posso stimare la distanza delle

sonde) posso “sfilacciare”il DNA in DNA fibers. Così posso calcolare le distanze

dei vari probe.

Gene chips

Analisi contemporanea di più geni

Ex: voglio confrontare l’espressione genetica di un tessuto sano e di uno

malato.

- Estraggo RNA totali da una cellula sana e una malata

- Retrotrascrivo con RT e marco questi c DNA con un fluorocromo diverso per

sano (rosso) e per malato (verde). Questi sono i probe.

- Inserire su chip il DNA derivante dalla piastra di microarray, dove ci sono i vari

DNA genomici della libreria. Avverrà l’ibridazione. Faccio i lavaggi.

- Fare scanning: osserveremo un segnale tanto più forte quanto i c DNA legati

sono di più. Il confronto tra i due chip ci permetterà di capire qual è la

differenza di espressione (geni che vengono repressi o indotti, che possono

causare la malattia).

Sequenziamento

Strategie di sequenziamento di genomi completi

Sequenziamento gerarchico (clone by clone)

Dobbiamo poter disporre del genoma da sequenziare (cioè i cromosomi). Li

inseriremo in frammenti in BAC o P1 con clonaggio. L’obiettivo è di ottenere il

numero minimo indispensabile per rappresentare tutto il genoma (con

screening specifici e reiterati) -> creare una libreria genomica con grandi

inserti cromosomici. Organizziamo i cloni genomici in una mappa fisica (set

ordinato di frammenti di DNA su una regione cromosomica), in modo da

selezionare il “minimal timing path” (MTP) ossia il numero minimo di cloni che

mi servono per coprire la regione cromosomica con il minor grado di

sovrapposizione. Frammento vari sottogruppi di cloni, sempre creando

sovrapposizioni e conoscendo a loro posizione nel genoma seguendo il tiling

path. A questo proposito sequenziamo. Ricostruisco i frammenti contigui e

quindi l’intera regione cromosomica.

Nota: per ottenere una sequenza dobbiamo poterla ricomporre correttamente,

cioè seguire l’ordine preciso con cui i frammenti si presentano sulla regione

cromosomica da sequenziare. Dobbiamo quindi disporre di “paletti” che ci

permettono di riordinare i frammenti, molti “entry point” cioè molte sequenze

che conosco già, ossia i marcatori molecolari.

Un marcatore molecolare è un sito unico presente nel genoma; sono elementi

genici ereditabili che presentano almeno due forme alternative (varianti

alleliche). Possono essere:

- Geni

- RFLP

- SSLP

- SNP

Esistono tre modi per costruire una mappa fisica utile per il sequenziamento:

- Mappaggio di siti di restrizione (limitata a piccole molecole di DNA, l’uso di

enzimi con siti rari [rare-cutter] può consentire la mappatura di molecole più

grandi)

- FISH

- Mappaggio di STS (il più usato in assoluto)

Sequenziamento shotgun

E’ lo stesso identico procedimento del sequenziamento gerarchico, ma senza la

costruzione di mappe fisiche/genomiche e con la diretta frammentazione dei

cromosomi in sequenze molto piccole.

- Frammentazione del genoma e costruzione di librerie plasmidi che con inserti

di dimensioni tra 2.10 k e librerie BAC (100-200 kb di inserto)

- Sequenziamento di entrambe le estremità di ciascun clone

- Allineamento e assemblaggio di tutte le sequenze ottenute per la produzione

di una sequenza consenso mediante l’uso di tool bioinformatici che, secondo le

probabilità di compatibilità, associano i vari frammenti per completare il

sequenziamento dell’intera regione cromosomica.

- Assemblaggio dei frammenti e mappatura su cromosomi.

Nota: tuttavia, la presenza di sequenze ripetute può causare problemi

nell’assemblaggio di continui più lunghi.

Ma in sintesi qual è la strategia migliore di sequenziamento? Per genomi brevi è

meglio la strategia shotgun, per quelli lunghi, quella gerarchica. Ma in genere si

usa un metodo a metà tra i due (velocità e accuratezza)

Sequenziatori automatici

- Con metodo Sanger: il sequenziamento viene fatto su macchinari ormai

moderni, sequenziatori che usano 96 capillari e consentono di ottenere circa

100.000 basi lette per ogni run.

- Programmi di assemblaggio di sequenze devono:

* Valutare tutte le possibili sovrapposizioni di sequenze in entrambe le

direzioni, al fine di determinare la migliore soluzione di allineamento

* Generare una sequenza consenso per ogni continuo e attribuire un valore

di affidabilità ad ogni base della sequenza consenso.

Tecnologie innovative del sequenziamento (sequenziatori di II generazione)

Portano ad un incremento molto sensibile della capacità di sequenziamento;

caratteristiche principali:

- Non più necessaria la classica fase di elettroforesi. La lettura della sequenza è

effettuata step by step

- Sempre necessaria una fase di amplificazione di DNA, ma fatta con nano

reattori in emulsione.

Ex di tali nuove tecnologie sono:

- Roche/454 (pirosequenziamento)

- Applied biosystem SOLID (sequenziamento per ligazione)

- Illumina/solexa (Sanger modificata)

Pirosequenziamento: metodo di sequenziamento che si basa sulla rilevazione

del pirofosfato rilasciato dall’incorporazione di un nucleotide durante la sintesi

del DNA

La prima reazione è quella generale di ligazione del nucleotide ad una

sequenza di DNA. La seconda riguarda il gruppo pirofosfato ricavato dalla prima

reazione, che va a “ricaricare” una molecola di ADP formando ATP. Questa ATP

viene sfruttata per rendere energia con un substrato chiamato “luciferina” che

grazie all’enzima luciferasi genera energia luminosa per idrolisi dell’ATP.

1) Il primer si ibrida allo stampo a singola elica, per cui viene fatta PCR

2) Viene incubato il tutto con enzimi quali la DNA polimerasi, ATP sulfurilasi,

luciferasi, apirasi, substrati sono nucleotidi triP, APS e luciferina.

3) Se la polimerasi non incorpora nucleotidi al primer non c’è luce visibile.

Dovrò ripetere la reazione con ogni nucleotide per ogni singola posizione sulla

sequenza. Nel momento in cui la polimerasi catalizza l’incorporazione di un

nucleotide trifosfato viene liberato un gruppo fosfato (in quantità equimolare e

quella del nucleotide incorporato). Nel nostro caso d GTP permette la riuscita

delle reazioni e genera chemioluminescenza. Questo perché in presenza di APS,

l’ATP solfurilasi converte fosfato e ATP, che è substrato di una successiva

reazione con luciferina e catalizzata dalla luciferasi. Questa è la causa della

luce. G è quindi il nucleotide corretto dopo il primer. La luce prodotta viene

rilevata da una CCD camera e visualizzato come un picco sul programma.

4) L’aspirasi degrada invece tutti i nucleotidi triP non incorporati e ATP in

eccesso. Non appena la degradazione è completa viene aggiunto un nuovo

nucleotidie triP.

5) I nucleotidi triP vengono aggiunti sequenzialmente, uno alla volta. Tuttavia,

dato che l’d ATP è substrato naturale della luciferasi, viene usata la

deossiadenosina alfa-tio-trifosfato (d ATPs) che viene usata lo stesso dalla

polimerasi.

6) Mano a mano che il processo continua, il filamento di DNA è sintetizzato e la

sequenza nucleotidica determinata dai picchi sul programma.

Nota: questo tipo di metodo non necessita della sintesi di cloni; basta il DNA

genomico che fungerà da stampo.

Nota: una delle fasi del metodo è l’amplificazione, che può essere fatta in modo

particolare:

 Fase I: Costruzione di una libreria di DNA

1. Frammentazione del genoma

2. La creazione della libreria ss DNA avviene con la ligazione ad alcuni

“adattori”; non c’è alcuna clonazione e non si picca alcuna colonia.

La selezione dei filamenti che hanno fatto ligazione con gli

adattatori avviene con una purificazione avidina-biotina

 Fase II: amplificazione per PCR a emulsione

3. Vengono usate delle piccole sferette (in eccesso) a cui far annilare

il ss DNA. Su tali sferette ci sono i corrispondenti agli adattatori che

sono sui filamenti di DNA, per cui permette una elevata densità di

DNA genomico a livello della sferetta.

4. Si fa partire la PCR in emulsione, chiamata così perché avviene in

vescicole ingegnerizzate in lab. Alla fine della PCR si rompono le

vescicole, per esporre le sfere con legato il DNA

 Fase III: sequenziamento

5. Tali sferette con DNA legato vengono trasferiti (meccanicamente) a

livello di pozzetti del diametro dei 44um. In ogni pozzetto andrà

posizionata una sola sferetta. Riempio ogni pozzetto con gli enzimi

e i substrati utili per il pirosequenziamento. In questo modo, ci sarà

un altissimo numero di frammenti di DNA che vengono sequenziati

in parallelo.

6. Vengono fatti 42 cicli per cui si osserva chemio luminosità che

viene registrata dal pirogramma, che ci renderà nota la sequenza

nucleotidica.

Salexa system

1. Si prepara il DNA genomico (frammenti random), facendolo ligare ad

adattatori terminali

2. Si legano tali filamenti ad una superficie (ex nano poro su superficie di

grafene), in modo assolutamente random

3. Il riconoscimento adattatore-adattatore fa piegare il filamento di DNA a

“ponte”. Inseriamo nucleotidi non marcati e enzimi per amplificazione

4. Per l’amplificazione si formeranno molti filamenti identici di DNA su

quello originale, formando dei cluster di ds DNA

5. A questo punto inizia il primo ciclo di sequenziamento: inseriamo 4

nucleotidi marcati, quattro terminatori marcati, primers e DNA polimerasi.

Un laser leggerò la diversa marcatura di ogni nucleotide e determinerà

dei picchi per cui potremo ricostruire l’intera sequenza nucleotidica.

E’ un metodo per cui non abbiamo bisogno di clonare, di adattare o rompere. Si

possono sequenziare interi cloni BAC.

Elementi trasponibili

Sono una componente fondamentale dei genomi: non esiste un organismo

privo di elementi trasponibili. Servono a creare variabilità. Altra variabilità è

determinata dalla trasposizione, cioè dal movimento di sequenze mobili

presenti nei genomi. Sono anche stati utilizzati per metodi mutagenici, visto

che sono delle sequenze in grado di spostarsi e integrarsi in un punto casuale

del genoma, sono dei mutageni naturali. I trasposoni sono utilizzati nella

terapia genica. Nel genoma umano, i trasposoni sono molto presenti e fanno

parte di quella parte di genoma mediamente ripetuto (45% del DNA). Devono

esistere dei meccanismi di controllo di regolazione del movimento trasposonico

per evitare danni.

Tipologie di trasposoni

- DNA o RNA

- Virali o non virali

- Meccanismo replicativo o meccanismo excisivo

Storia degli ET:

- Per i procarioti: risale alla scoperta delle IS (insertion sequences), che si

comportano esattamente come i trasposoni per gli eucarioti. Generano

mutazioni polari e sono stati individuati con la microscopia elettronica, per la

dorma di “lollipop” con cui si presentano quando la sequenza nornale un etero

duplex con la sequenza in cui è l’inserto l’IS. Sono state identificate sull’E.Coli

sull’operone gal. Può inattivare geni se presente sulle sequenze codificanti.

Nota: il fattore F, per esempio ha come obiettivo le IS

Scoperti nel 1950 per gli eucarioti, grazie al sistema Ac/Ds nel mais, che

influenza il colore della cariosside. Furono dapprima chiamati “loci

instabili/mobili”, dato che erano sequenze che cambiavano posizione sul

genoma e promuovevano rotture cromosomiche. Demolizione dell’idea per cui

il locus genico è statico.

Ex: la colorazione della cariosside è sotto il controllo di un fenomeno epistatico

dominante. A seguito di due mutazioni su una pianta e poi l’autofecondazione,

la progenie è stata osservata

- A1-; Dt (pigmentati)

- A1-; dtdt (pigmentati)

- a1a1; Dt- (maculato)

- a1a1; dtdt (incolore)

e se ipotizzassimo un incrocio a1a1;Dt- X a1a1--. Dovremmo ottenere per il

locus a un individuo a1a1, e dato che c’è Dt maculato per forza. Non mi aspetto

di trovare una cariosside pigmentata, che è invece ciò che è stato osservato.

Barbara McClintock riprese gli studi di Marcus Rhoades, investigando anche

oltre poiché forte degli studi di citogenetica. Studiò principalmente il

cromosoma 9 del genoma del mais, andando a scoprire che quello che rendeva

il colore della cariosside fosse un locus instabile o mobile, come lo chiamò lei.

Esempio pratico: ordine dei locus in discussione: telomero-colorless-bronze-

waxy-centromero

- Locus colourless (pigmento nello strato di aleurone)

C+ (nel wild type). C+/C+ -> colore rosso

C-I dominante su C+. C-I/C+ -> incolore

C recessivo di C+. c/c -> incolore

- Locus bronze: (pigmento nello strato aleurone)

Bz+ (nel wild type) Bz+/Bz+ -> porpora

bz recessivo di Bz+. bz/bz -> bronzo

nel caso in cui Colourless e bronze siano mutati, come per esempio C-I; bz/ C+

bz oppire c bz/c bz

-> la cariosside è incolore, poiché il pigmento non viene prodotto e il locus

bronze è irrilevante.

- Locus waxy (per la produzione di amido nell’endosperma, rilevato con saggio

di Benedict)

Wx+ (nel wild type). Wx+ / Wx+ -> starchy (ricco di amido) wx recessivo di

Wx+. Wx/wx -> waxy (ceroso)

Barbara è partita da tripli omozigoti. Dal primo proviene il polline, dal secondo

gli ovuli. C-I; Bz+; Wx+/ C-I; Bz+; Wx+

X

C+; bz; wx/ C+; bz; wx

Ci aspettiamo: C-I; Bz+; Wx+/ C+; bz; wx, fenotipicamente incolore (C-I su

C+), porpora (Bz+ e bz) e starchy (Wx+ su wz).

Otteniamo: a settori, bronze (bz), waxy (wx). Un fenotipo del genere possiamo

giustificarlo solo con la “perdita” dei locus paterni. La spiegazione fu trovata

nel fatto che tali locus si trovano dopo un locus chiamato Ds (da

“dissociazione”) che nella forma allelica Ds+ non determina rottura, mentre Ds

la determina. Si tratta di un semplice ET che, inserendosi tra il locus waxy e il

centromero, aveva determinato la delezione e la perdita dei locus paterni. In

(b) si osserva come la porzione di cromosoma successiva a Ds venga persa,

esattamente come si osserva dal fenotipo.

Rohades aveva quindi ragione, ma Barbara aveva contribuito mappando il

genoma del mais e individuando questi “hot spot” di rottura. Inoltre, nello

stesso incrocio furono trovati chicchi non cariosside con settori porpora e

starchy (Bz+; Wx+) -> questo significa che i locus paterni erano ancora

presenti. Ds aveva cambiato ancora posizione, inserendosi stavolta tra il locus

colourless e bronze. Si era quindi confermato che Ds si muove. Barbara non

venne creduta al principio, poiché vigeva il dogma dell’immobilità dei locus

genici. Solo negli anni 80 ottenne il nobel per questi studi. E ancora, si osservò

che Ds non riusciva a dissociare se non ci fosse Ac+ “activator”. Se

allontaniamo Ac da Ds, quest’ultimo non si sposta più. Anche Ac+ si muove.

Allestendo una prova di incrocio con genitori:

C+; Ds/C+; Ds // Ac/Ac+ X C+; Ds+/C+; Ds+ // Ac+/Ac+

Abbiamo ottenuto:

- Una classe di progenie che è quella prevista

- Una classe in cui si è perso il locus C (rottura cromosomica dovuta a Ds)

- Una classe il cui fenotipo e particolarissimo, con macchie pigmentate

Come posso spiegare l’ultimo tipo di fenotipo? Non posso con la rottura

cromosomica, come abbiamo fatto precedentemente, perché quell’evento è

irreversibile (i loci persi lo sono per sempre). L’evento contrario, cioè

pigmentato a macchie, ma da incolore verso pigmentato, non posso spiegarlo

in questo modo. Posso solo con l’idea che Ds si è inserito nel locus C,

inattivandolo temporaneamente e rendendolo incolore. Sposando Ds, C torna

ad essere rosso. Quindi l’inserimento di Ds nei geni può determinare una

temporanea inattivazione del gene. Anche Ac può farlo. Ac e Ds sono tutti e

due ET ma il primo è autonomo, il secondo non lo è.

Morfologia del trasposone

- Solo una parte è codificante. Codificano per proteine che permettono il loro

movimento, una tra tutti la trasposasi (della famiglia delle integrasi). Questo

enzima riconosce le sequenze terminali, taglia ciò che vi è nel mezzo e

permette a questa sequenza di essere integrata altrove. È un trans agente

(ossia può anche avere effetti su trasposoni che non sono quelli che

contengono la sua sequenza nucleotidica di partenza) e ha un’azione famiglia-

specifica, ossia una trasposasi sintetizzata da I3 può avere effetto su tutte le I3.

- Le sequenze terminali sono le sequenze cis agenti (ossia, hanno effetti e

funzioni che si esplicano sul trasposone stesso), ripetute e ordinate.

Nota: in laboratorio, i trasposoni possono essere usati “separando” la sequenza

che codifica per la trasposasi e i terminali riconosciuti.

----- < ------------------ >-------- ------------- |||||||||||||| ---------------------

Plasmide con terminali del trasposone Plasmide con sequenza di codifica

Rimane un elemento trasponibile, ma della tnp. Rimane un elemento

non può migrare a causa del fatto che trasponibile, ma non può migrare a

manca l’enzima che le permette di causa del fatto che mancano i

farlo. Statico. terminali che permettono il

riconoscimento del trasposone.

Statico.

Se inseriamo questi due plasmidi in una cellula ospite, la trasposasi riconoscerà

i terminali sul plasmide 1 (trans agente) e ci sarà effettiva migrazione dei

terminali su altre molecole.

Ex: uso una GFP come sistema reporter come sequenze che codifica tra i due

terminali. Se c’è trasposizione vedrò luminescenza verde nella cellula. Questo

metodo è usato per fare mutagenesi e terapie geniche. (anche se anche i

trasposoni possono subire modificazioni negative, che li rendono inattivi).

Trasposoni batterici compositi:

- Due IS terminali (ripetute, invertite o dirette) che fiancheggiano il gene. Tali

estremità IS possono trasporre indipendentemente.

- Il DNA tra le due IS può essere mobilizzato

- Spesso si tratta di geni di resistenza ad antibiotici (Tn3= ampicillina, Tn5=

kanamicina, Tn10= tetraclicina)

- Spesso ritrovati sui plasmidi

Note: Trasposone Tn3

- 3 geni trans agenti: tnpA (trasposoni), tnpR (“repressore” resolvasi Tn3), bIa

(resistenza ampicillina)

2 siti cis-agenti; 38bp inverted repeat ends + 120 IRS (res internal resolution

site, tipo IS)

- 4957 bp

Meccanismo di trasposizione

La trasposizione prevede la rottura e la formazione di nuovi legai fosfodiestere.

Le conoscenze che abbiamo provengono in larga parte dagli studi trasposoni

batterici Mu e Tn3 (meccanismo replicativo) e dei Tn10 e Tn7 (meccanismo

excisivo). Fa capo a due modelli di trasposoni diversi.

- Meccanismo replicativo (Tn3, batteriofago Mu): viene generata una copia

nuova del trasposone

- Meccanismo excisivo (Tn5, Tn10, elemento P): il numero di copie rimane

identico

Meccanismo replicativo (copia e incolla)

- Il taglio iniziale è un nick e una sola strand è ligata

- L’elemento si replica copiandosi

- Viene prodotto un intermedio la cui struttura è detta “cointegrato”

- Il cointegrato è risolto dalla resolvasi (in TnpR e Tn3) ad un sito specifico

(come res di Tn3) e grazie alla replicazione avremo una ulteriore copia del

trasposone

Ex: elementi Ac/Ds

- Ac è lungo 4563bp, e l’unica sequenza codificante esprime una proteina di

807 aa

- Ac attiva Ds; Ac è autonomo (codifica trasposasi), Ds no.

- Ds varia in lunghezza e sequenza ma ha le stesse ITRs di AC.

- Molti elementi Ds sono versioni delete o riarrangiate di Ac

- Ac/Ds sono regolati nello sviluppo. Ac/Ds trasposone solo durante la

replicazione dei cromosomi e sono elementi di classe II (meccanismo di

excisione)

Ac e Ds sono elementi di II classe, cioè non aumentano il loro numero di copie.

Eppure esistono molti elementi Ac/Ds. La spiegazione giace nel fatto che la

trasposizione può avvenire durante la fase S, esattamente come in questo

caso.

a) Se la trasposizione dell’elemento avviene in una forcella di replicazione, non

ci sarà effettivo aumento di numero di copie dell’ET.

b) Se invece la trasposizione dell’elemento avviene a livello di una zona non

ancora affetta da replicazione (a valle della forcella), allora replicando, su una

strand ci sarà aumento di copie dell’ET.

Meccanismo excisivo (taglia e incolla)

- Si excide dal sito originale producendo una rottura a doppia elica

- Taglio del sito target e ligazione delle estremità dell’elemento ad un nuovo

sito

- La rottura originale è riparata

Elementi di trasposizione del meccanismo replicativo: TSD (target site

duplication)

- Avviene il taglio della double strand del sito bersaglio, un taglio sfalsato.

- Ligazione del DNA trasposone. Durante questo evento, i terminali a contatto

col trasposone avranno una copia di origine e una che si forma dal suo

terminale complementare, causando ripetizioni di terminali nel sito bersaglio. È

infatti indizio della presenza del trasposone.

Nota: gli eucarioti sono pieni di elementi trasponibili, spesso a livello delle

sequenze introniche perché la trasposizione è un evento controllato. Se i

trasposoni interrompono un gene e determinano malattie, l’esemplare non

trasmette il suo patrimonio genetico. I nostri geni sono il prodotto delle tante

modificazioni rispetto agli elementi trasponibili. A volte però i trasposoni

convivono con gli introni in modo efficiente. Le proteine della placenta derivano

da sequenze precedentemente introniche + ET, poi assieme diventati esoni.

Nota: gli elementi trasponibili autonomi sono pochi, in realtà. Le LINE lo sono, le

Alu no. Ma gli ET non autonomi spesso sfruttano la trasposasi sintettizate da

altri ET.

Trasposoni: classi

Classe I: intermedio RNA. Necessita di trascrizione, quindi la RT retrotrascrive

tale RNA per dare un c DNA da inserire in DNA bersaglio. (aumento di copie).

Fanno parte di questa classe, i retrotrasposoni e i retrotrasposoni poli A: i primi

comprendono delle sequenze LTR mentre i secondi non contengono LTR

Classe II: avviene l’escissione dell’ET e la sua re-integrazione a livello delle

altre sequenze. (non c’è aumento di copie) (molto simili agli elementi IS). Fanno

parte di questa classe, gli elementi con corti terminali ripetuti ed invertiti

(elemento P) che quelli con lunghi terminali ripetuti ed invertiti (elemento TU)

Elementi trasponibili degenerati: sono la maggior parte dei trasposoni

- Hanno accumulato mutazioni e non sono più attivi. Alcuni hanno mutazioni in

cis agenti e non sono più mobili; altri non hanno una trasposasi funzionale

(possono essere mobilizzati da altri elementi tnp+ (che sono quelli autonomi e

forniscono la trasposasi)

- Sistemi Ac/Ds

- MITEs (minature inverted repeat transposable elements) sono non autonomi

- SINEs: retrotrasposoni non autonomi

LTR (long terminal repeats)

Gli LTR sono sequenze terminali degli elementi trasponibili di lunghezza

variabile e che fungono da elementi cis-agenti. Uno è il PBS (primer binding

site) che è un sito di attacco per il primer a valle di LTR in 5’. È un sito di

innesco per la retrotrascrizione. Un’altra sequenza agente in cis è la PPT

(polipurinica) che si trova a monte di LTR. Al centro c’è una regione codificante

dove ci sono geni che esprimono proteine importanti per avviare il meccanismo

della retrotrascrizione. Le proteine trascritte sono proteine molto simili a quelle

dei retrovirus. Gene gag, pol, ev di un retrovirus.

Il DNA tra le due LTR terminali contengono una ORF, che può codificare per

varie proteine:

- TNP (trasposasi)

- GAG (antigene gruppo specifico) (stabilizza il genoma al suo interno)

- RT (retrotrascrittasi)

- IN (integrasi)

- PR (proteasi)

- RB (ribonucleasi)

I retrotrasposoni sono molto simili alle particelle retrovirali come è confermato

anche dal punto di vista strutturale e funzionale. L’unica differenza giace nel

fatto che il virus è infettivo. Funzionale per la metodologia di integrazione al

genoma, strutturale perché alcuni retrotrasposoni dimostrano avere anche

sequenze per la codifica per l’envelope (involucro lipoproteico ulteriore rispetto

al capside). Questo particolare tipo di retrotrasposoni possono codificare per

VLP, virus like particles, che effetivamente somigliano alle particelle virali. (si

pensa che questo tipo di ET si siano evoluti dalle particelle retrovirali).

Dall’LTR 5’ deve partire la trascrizione e il fulcro della trasposizione di un

elemento di classe I è l’RNA. Questo si genera a partire da un punto ben

preciso, l’inizio della trascrizione grazie a una RNA polimerasi. La trascrizione

parte all’interno della LTR 5’ e viene trascritto tutto l’elemento in un'unica

molecola di RNA e la trascrizione si interrompe nel 3’ LTR. In RNA viene copiato

sia il PBS che il PPT e si appaierà l’innesco (un t RNA endogeno al livello del PBS

che permetterà l’inizio della retrotrascrizione da parte di una “reverse

trascrittasi” codificata dall’elemento stesso. L’elemento codifica per 2/3

proteine: gag (protezione del genoma), pol (specifica per una poliproteina, cioè

una proteina multidominio, che viene poi processata, scomposta nei singoli

domini grazie a una proteasi presente nella poliproteina stessa). La reverse

trascrittasi a partire dall’innesco sintetizza il c DNA, l’integrasi alla fine del

processo di sintesi del c DNA double strand integrerà la nuova copia di

retrotrasposone all’interno di un locus nuovo genomico.

Meccanismo di replicazione di ET con LTR

1) La trascrizione dell’elemento trasponibile parte dalla LTR al 5’ e procede fino

alla LTR al 3’. Si produce quindi l’m RNA corrispettivo, che però si presenta così.

Ecco perché le sequenze 3 e 5 sono dette “uniche” perché lo sono al livello

dell’ m RNA. Non del DNA del trasposone.

2) Una parte di tali m RNA verrà tradotta (proteine del trasposone). Queste

stesse proteine agiscono per la retrotrascrizione. La RT (codificata dal

retrotrasposone, deriva dall’autocatalisi della poliproteina del trasposone) si

lega alla PBS dell’m RNA.

3) A tal punto interviene un t RNA endogeno. Questo complementa con la PBS,

fungendo da innesco per la sintesi della porzione U5 e R. Si è formato un

piccolo eteroduplex ibrido c DNA e m RNA. Interviene quindi l’RNAsi H, che

degrada l’m RNA e lascia la porzione di c DNA. La porzione di PBS rimane

integra perché è una interazione tra due RNA.

4) Avviene il primo “template jump”: la sequenza c DNA- t RNA può essere

usata come innesco ancora una volta, sia della stessa molecola che di una

differente. R alla LTR al 5’ e quella al 3’ si appaiano, permettendo la

retrotrascrizione dell’intera molecola di c DNA. A mano che questo viene

sintetizzato, l’RNAsi degrada l’m RNA a parte la sequenza PPT, poiché essendo

una sequenza polipurinica, è difficile da degradare, per i tanti tripli legami G-C

5) Il PPT rimasto “solo” può fungere da innesco per il secondo strand di c DNA

complementare

6) Secondo “template jump”, la sequenza PBS (del secondo strand c DNA) si

appaia alla sequenza PBS, fungendo da innesco e sintetizzando l’intero

filamento complementare di c DNA. Si ottiene così un ET con le LTR complete

ancora una volta.

Meccanismo di replicazione di ET senza LTR

Un esempio di questi retrotrasposoni sono le LINEs, che presentano una lunga

coda di poliA. Utilizzano ancora una volta un intermedio RNA e poi RT.

Caratteristiche:

- 2 ORF

- TSD variabile

- Usano il meccanismo TPRT, target primed reverse transcription (il primer è il

target stesso)

- Possono trasdurre frammenti di DNA al 3’

1. Trascrizione dell’elemento da parte di una RNApol: anche se il promotore

è nella 5’ UTR, l’inizio della trascrizione è correttamente dal primo

nucleotide dell’elemento.

2. L’m RNA generato si sposta nel citoplasma e viene tradotto (ORF1 e

ORF2). I prodotti rimangono strettamente associati al trascritto.

3. Il complesso ribonucleoproteico torna al nucleo e si associa al DNA

dell’ET

4. Il prodotto della ORF2 taglia il DNA a livello di sequenze ricche di A/T che

stabilizzano l’interazione tra RNA e DNA

5. Sintesi del primo frammento di DNA

6. Degradazione dell’RNA e sintesi del secondo filamento di DNA

7. Riparazione delle rotture al DNA

8. Ligasi delle estremità

Effetti e conseguenze del movimento dei retrotrasposoni

- Ricombinazione

- Mutagenesi inserzionale: inattivazione di geni causato dall’arrivo di un

trasposone

- Produzione di pseudogeni: ovvero sequenze molto simili ai geni senza regioni

regolative (numero introni o sequenze ripetute). Queste regioni non codificano

- Exon shuffling: quando due elementi trasponibili dello stesso tipo sono vicini.

Possono saltare singolarmente o entrambi. La trasposasi può riconoscere, una

sequenza ripetuta invertita del 1° e una del 2°, trasponendo tutto ciò che c’è

tra le due. Se c’è un esone questo viene inserito in un altro gene, all’interno di

un introne.

- Espressione ectopica: ovvero ricombinazione tra due geni non omologhi (non

dovrebbero ricombinare) con due sequenze omologhe dei trasposoni. Crea

elementi incompatibili con la vita

Nota: un esempio di inversione cromosomica mediata dagli ET è una mutazione

del gene “antennapedia” (Antpd) fondamentale per lo sviluppo morfogenetico

dell’imago antennapedia e un gene accanto, rfd presentano due ET uguali, DOC

(è una LINE) con direzionalità opposta. Con la formazione di un’ansa di

inversione a causa dei due elementi DOC uguali, può avvenire lo scambio dei

due promotori di antennapedia e rfd. Questo causa un esemplare mutato con

strutture “ectopiche”, due zampe ben funzionali sulla faccia.

Nota: inserimento di ET rappresentano la maggior fonte di mutazioni spontanee

nella Drosophila, come la mutazione Ubx (ultrabitorax, che ha due toraci).

Anche questa è causata dall’ET DOC.

Nota: nell’uomo vi sono molte patologie causate dalla ricombinazione di ET,

soprattutto delle sequenze frequenti come Alu e L1. Sono esempi il diabete di

tipo II, insulina resistente, ipercolesterolemia, talassemia, emofilia A, cancro al

seno.

Ma a volte la ricombinazione di ET è utile, come nel caso dell’acquisizione di

resistenza ai pesticidi. Ne sono un esempio l’inserimento degli stessi elementi

DOC in locus particolari, ossia quelli riguardanti la detossificazione

dell’organismo: DOC ha un promotore forte, quindi una capacità di indurre più

facilmente la trascrizione e quindi permettere una produzione maggiore di

proteine della detossificazione. Questo tipo di esperimento si fa però con ceppi

di Drosophila selvatici, dato che quelli in lab non subiscono alcuna pressione

adattiva-ambientale.

ET e mutazioni

- L’inserimento di trasposoni in una regione di regolazione possono o causare

rottura dall’integrità dei siti di regolazione

- L’inserimento di trasposoni in una regione di codifica causano sicuramente

interruzioni di sequenze proteiche.

Elemento P

E’ un trasposone di classe II riconosciuto in Drosophila con 3 introni e 4 esoni,

sequenze terminali invertite ripetute di 31pb (riconosciute da trasposasi) e

regioni regolative.

Questo gene è stato identificato come la causa della disgenesia degli ibridi:

attraverso un incrocio disgenico, ovvero tra 2 popolazioni diverse di drosophila,

si ottiene una progenie con un altissimo tasso di mutazione (aberrazione,

delezione) e di mortalità. In genere gli individui che sopravvivono sono sterili

(alterata segregazione dei gameti in meiosi). Si collezionano degli individui da

campionamenti in natura e si incrociano con individui di laboratorio: CEPPO P

della natura x CEPPO M di laboratorio.

Come si produce progenie disgenica? Bisogna anzitutto considerare tra

esemplari selvatici, detti P (subiscono stress ambientale, devono adattarsi) e

esemplari di lab (non subiscono stress) detti M.

Female M Female P

Male M Normale (controllo) Normale (controllo)

Male P Disgenetico Normale (controllo)

Solo l’incrocio tra maschio P x femmina M rende la disgenesia.

Nota: si è osservata che se abbasso la temperatura durante gli incroci (18°C),

gli effetti della patologia disgenica sono meno catastrofici. Ciò ci suggerisce

che la disgenesia è causata da un enzima.

Molecolarmente, si è riuscita a comprendere che tale problema era causato da

un ET, chiamato P perché derivante dai ceppi selvatici P (questo ci fa capire

quanto l’ambiente modifichi l’assetto genetico di esemplari della stessa specie

in condizioni differenti). Ma perché la disgenesia è causata sono all’incrocio

maschio P x femmina M, e non dal caso contrario?

Una femmina P presenta l’elemento P, ma questo non causa la trasposizione. Al

contrario, l’elemento P nel maschio genera trasposizione. Questo dipende

dall’elemento P stesso.

- Nelle cellule somatiche: durante la trascrizione, l’introne 3 non viene

eliminato per splicing. Dopo la traduzione si forma un repressore da 60kb, che

agisce per bloccare la trasposizione dell’elemento P. Questo prodotto proteico è

più corto perché nell’introne 3 ci sono varie sequenze di stop.

- Nelle cellule germinali, durante la trascrizione, l’introne 3 viene eliminato per

splicing. Si genera una trasposasi da 87kb. La mancanza del repressore genera

quindi la possibilità, per P, di trasporre a piacimento.

Ma la problematica è ancora più complessa di quello che sembra. L’ovogenesi

nella femmina di Drosophila parte da una cellula staminale ed è meroistica

(ossia, ci sono cellule nutrici): nella camera uovo, questa esegue 4 divisioni,

diventando 16 cellule in tutto. 15 sono cellule nutrici ed una sola è l’oocita vero

e proprio. Inoltre, la camera uovo è anche circondata da cellule follicolari, di

origine somatica. Quindi, in una femmina P, le cellule follicolari sintetizzano il

repressore e lo passano all’oocita. In questo modo, seppur l’oocita presenti la

trasposasi, questa non può agire a causa del repressore. Al contrario, la

spermatogenesi non avviene in contatto con cellule somatiche per cui non c’è

passaggio di repressore. Gli spermatozoi portano solo la trasposasi e l’elemento

P, per cui sono causa di disegenia.

Conclusione: posso usare P come vettore di trasformazione per creare

mutazioni.

Nota: poiché un ET faccia trasposizione, deve avere ORF per sintetizzare la

trasposasi, e terminali riconoscibili da questi. Se l’ET ha solo i terminali, è

statico. E viceversa, se non li ha e ha solo la trasposasi, non si muove allo

stesso modo. Se nella stessa cellula, due plasmidi portano uno l’ORF per la

trasposasi e l’altro per i terminali, la trasposizione avviene. Replicando questo

meccanismo in vitro, posso usare l’elemento P come elemento di

trasformazione.

1) Donatore: plasmide con terminali riconosciuti e un sistema reporter stabile.

In questo caso w+ - white, occhio bianco, locus localizzato sull’X. È un sistema

reporter efficace e palese, dato che per complementazione posso far sì che due

alleli w+ generino un fenotipo WT, ossia occhio rosso. Attribuisco a questo

plasmide un promotore forte, come quello dell’actina, per permettere un alto

tasso di trascrizione della trasposasi.

2) Uso questi due plasmidi per fare clonaggio su cellula, quindi estraggo questi

due plasmidi e li uso in embrioni di Drosophila.

Nota: embrioni di Drosophila: nelle prime fasi di crescita embrionale, tutto ciò

che succede è la continua suddivisione del nucleo. Ci sarà quindi una unica

grande cellula e migliaia di nuclei al suo interno, disposti in modo non casuale.

All’esterno c’è una membrana, chiamata “corion”. Questo è un sincizio

(=blastoderma sinciziale): ogni nucleo diventerà una cellula specializzata in un

particolare tessuto, dopo la cellularizzazione dell’embrione (= blastoderma

cellulare). Per cui suddividendo idealmente l’embrione in fasce orizzontali,

possiamo definire che i nuclei nelle varie fasce diverranno cellule specializzate

in diversi funzioni. La fascia polare (a destra dell’immagine) è di nostro

interesse: contiene i nuclei di quelle che saranno le cellule germinali.

3) Useremo un blastoderma pre-cellulare, di cui dovremo individuare i nuclei

polari da tutti gli altri nuclei. Questa situazione ci aiuta poiché non dobbiamo

oltrepassare alcuna membrana cellulare – che si formerà dopo, nella fase di

cellularizzazione. Dovremmo infatti introdurre i due plasmidi a livello delle

cellule germinali, cosicché siano trasmessi alla progenie. Ciò sperando che i

plasmidi vengano accolti nelle cellule (durante la meiosi), altrimenti saranno

degradati. A noi basta che i plasmidi permangano per permettere al trasposone

(quello w+) di essere inserito a livello dei cromosomi. Altri “salti” non ci

interessano. L’evento di inserimento dei plasmidi nell’embrione avviene con

microiniezione. Tale metodica deve essere fatta con estrema precisione, dato

che il trauma causato dall’iniezione può causare la morte degli embrioni.

Inoltre, si calcola una fase di disidratazione degli embrioni (altrimenti scoppiano

con l’ago)

4) Otteniamo embrioni – chimere, ossia: per le cellule somatiche si ha genotipo

w-/w-, mentre per le cellule germinali in genotipo è w-/w-/w+ (triploide per

gene w).il fenotipo, ad ogni modo, rimane occhio bianco dato che la mutazione

è avvenuta solo per le cellule germinali.

E neanche la progenie di questi esemplari avrà occhio rosso! Il loro genotipo

sarà w-/w-/w+, il che si paleserà solo con l’incrocio w-/w-. Volendo fare una

stima, se usiamo 100 embrioni per fare microiniezione, otterremo 100 mosche

occhio bianco triploidi per w; se incrociamo queste con mosche occhio bianco,

otterremo dalla progenie, il cui 10% circa è a occhio rosso.

Ma come faccio a sapere dove è finito l’ET? Posso usare una ibridazione a

fluorescenza (FISH)

-Target (cromosomi politenici)

- Probe (gene w che abbiamo inserito)

Mi aspetto di trovare, sul 10% di progenie occhio rosso, un segnale su X, cioè

dove il locus w è di natura + un secondo segnale su un altro cromosoma, cioè

dove P ha trasposto.

Elementi P: conclusioni

- Gli elementi P hanno bisogno di poche centinaia di basi in ciascun terminale

per trasposizione

- Quelli ingegnerizzati contengono un gene marker (rosy o white)

- Contengono anche sequenze che ne permettono la propagazione in batteri

Come sono stati usati?

- Sono state create 6000 linee di Drosophila mutante, comprendendo mutanti

“che non imparano” e altre modificazioni cerebrali e comportamentali. Li hanno

poi resi disponibili ai ricercatori e oggi si possono ordinare online.

Inserimento di P

- Gli elementi P si inseriscono nelle UTR dei geni (regioni non codificanti)

- In alcuni casi l’inserzione di P produce solo una parziale inattivazione del gene

di interesse (mutazione ipomorfa)

- Esistono degli “hot spot” di inserimento, localizzati principalmente alla 5’ UTR,

poiché in questa zona la cromatina è più lassa (causa promotori) e quindi è più

facile che l’elemento P si inserisca.

Ex: riassunto: come procedere con gli incroci per lavorare con un omozigote

che porta P in doppia copia (è un ceppo M)

1) P = Male occhio rosso X Female occhio bianco

2) F1 = eterozigoti occhio rosso (li incrocio tra loro)

3) F2 = eterozigoti e omozigoti (da qui lavoro con l’omozigote)

Ma se è letale il gene portato da P? Non posso lavorare in omozigosi. Dovrò

lavorare con l’eterozigote. Dall’incrocio 1, identico a quello precedente,

otteniamo:

a) Omozigote recessivo= muore

b + c ) Eterozigote = 60%

d) Omozigote WT = 30%

Per poter lavorar esclusivamente con gli eterozigoti, dovrò necessariamente

eliminare e i WT dall’ambiente. Perché incrociando un eterozigote con un WT,

otteniamo rapporto 1:1 tra eterozigoti e WT, che aumenterebbe la percentuale

di WT in ambiente (dal 30% al 50%). A lungo andare, gli eterozigoti si

estinguerebbe e i WT si propagherebbero. Quindi, necessitiamo di eliminare i

WT, e lo farò con i cromosomi bilanciatori.

Cromosoma bilanciatore = contiene siti multipli di inversione, che impediscono

l’esplicazione di eventi ricombinativi. In più, presenta un marcatore molecolare

(un sistema reporter) dominante e uno recessivo e letale. Utilizzandolo, ci

assicuriamo che la linea da mantenere non subisca ricombinazioni. Incrocio

quindi un eterozigote per P con un esemplare di sesso opposto, che comprende

un cromosoma bilanciatore (in verde), che porta l’allele dominante Cy (curly) e

il recessivo letale I. L’incrocio fenotipico è: Cy+/w+ (ali dritte, occhio rosso) x

Cy/w- (ali curve, occhio bianco). Ottengo quattro genotipi diversi, ma quello di

mio interesse è il primo. Incrocio maschi e femmine di questo ceppo tra loro,

ottenendo altre 4 classi diverse. Una con P in omozigosi, che muore. Una con I

in omozigosi, che muore. E due classi eterozigote, esattamente come le

parentali, che facendo incrociare a loro volta con loro stessi, otterranno

progenie geneticamente sempre identica.

Ex2: come faccio ad individuare i locus degli elementi P?

Con la FISH o con mappatura genetica, ancora una volta usando i cromosomi

bilanciatori. Diciamo di voler individuare l’elemento P su cromosoma 2 o 3

(dato che il 4 è troppo piccolo). Mi predispongo a fare due prove in parallelo,

una per il cromosoma 2 e una per il cromosoma 3. Prova per cromosoma 2:

scelgo un locus contemplato nel cromosoma bilanciatore, anche questa volta

Cy. Incrocio un ceppo fenotipicamente w+ Cy+ (occhio rosso, ali dritte) con

quello contenente il bilanciatore w- Cy (occhio bianco, ali curve). Se seleziono

in F1, elementi w+ (occhio rosso, perché è quello che porta l’elemento P) e Cy

(ali curve), confermeremo che l’elemento P è sul cromosoma 2.

Prova per cromosoma 3: scelgo un locus contemplato nel cromosoma

bilanciatore, anche questa volta Tabi (Tb, quello che rende più tozze le pupe).

L’incrocio è: fenotipicamente w+ Tb+ (occhio rosso, pupa slanciata) con quello

contenente il bilanciatore w- Tb (occhio bianco, pupa tozza). Se seleziono in F1,

elementi w+ (occhio rosso, perché è quello che porta l’elemento P) e Tb (pupa

tozza) confermeremo che l’elemento P è sul cromosoma 3.

Per confermare queste porzioni, posso provare a prendere la progenie e far

avvenire la meiosi. Dovremmo ottenere progenie con caratteristiche

nettamente divise, 50% w+ Cy+ (occhio rosso, ali dritte) e 50% w- Cy (occhio

bianco, ali curve). Se la separazione delle caratteristiche non è così netta. (per

esempio, trovo w+ Cy, occhio rosso, ala curva), P non si trova sul cromosoma

2. Allo stesso modo procediamo sul cromosoma 3.

ET usati per la trasformazione

L’elemento P è stato il primo ET utilizzato, ma ne seguirono altri. P è

compatibile con il sistema Drosophila, ma è raro trovarlo anche nei mammiferi

– si trova soprattutto come “relitto” genomico, quindi non è del tutto versatile

MLEs (Mariner – Like Elements)

L’elemento P non è l’unico elemento trasponibile utilizzato dal punto di vista

batteriologico in quanto è confinato di genomi di Drosophila. Una classe molto

ampia di elementi trasponibili sia negli eucarioti che nei procarioti sono le

MLEs. Sono trasposoni a DNA di classe III (si muove per meccanismo taglia e

incolla). Sono gli elementi che hanno brevi terminali invertiti e tra i 2 terminali

c’è una ragione codificante generalmente non interrotta da introni che codifica

per una trasposasi. Le trasposasi, così come le integrasi, sono delle proteine

multidominio. Cosa deve fare una trasposasi?

1) Deve riconoscere elementi cis-attivi del trasposone (elementi terminali

ripetuti e invertiti). Quindi, come proteina, la trasposasi deve poter legare il

DNA. Deve avere quindi un DNA binding domain: dominio di legame al DNA.

2) Deve avere la capacità di tagliare, rompere legami fosfodiestere e ricucirli,

tipico delle integrasi. Contiene un dominio DDE (2 aspartati o 2 Asp + 1

Glutammato si coordinano con Mg+) ed il sito attivo di taglio.

3) Una volta sintetizzata nel citoplasma, sui ribosomi la proteina deve ritornare

nel nucleo in quanto lì sta il substrato e deve avere perciò il segnale di

localizzazione nucleare.

Molte trasposasi funzionano come dimeri. Questi elementi trasponibili si pensa

siano capaci di saltare la specie: quindi non più un trasferimento genico padre-

figlio, ma orizzontale tra 2 specie diverse. Questo richiede dei vettori che

possono essere “batteri endosimbiotici” come vediamo negli insetti.

Hanno il gene per la trasposasi che fa parte delle integrasi di cui fanno anche

parte i virus come HIV e retrotrasposoni di Drosophila. In particolare, una

trasposasi fa uso di:

- Un dominio catalitico usato per tagliare i legami fosfodiesterici. La famiglia di

integrasi è DD(35)E che rappresenta la triade catalitica (aspartico-aspartico-

glutammico), ma tale trasposasi è particolare, poiché presenta la variante

DD(34)D.

- Un dominio di riconoscimento: è il DBD (DNA Binding Domain)

- Un segnale di entrata nel nucleo: Nuclear Localization Signal, dato che la

trasposasi viene sintetizzata nel citoplasma, ma ha i suoi effetti nel nucleo.

I trasposoni della classe mariner sono diffusi in tutti gli organismi possono

essere usati come vettori di trasformazioni compatibili con molto organismi. La

loro diffusione può essere spiegata se si assume che essi possono effettuare il

trasferimento orizzontale, ossia, “saltare” da specie a specie, oltre che

verticalmente da genitore a figlio.

Ciclo vitale dei Mariner

- ET attivo in ospite

- Invasione della linea germinale

- Proliferazione (aumento delle copie)

- Diffusione in popolazione

- Inattivazione verticale (mutazioni puntiformi)

- Perdita stocastica (diminuzione delle copie)

- Invasione della linea germinale

Sleeping beauty

Un elemento appartenente alle Tc1 mariner che nasce da un elemento “spento”

del genoma dei pesci. Nessuno di questi elementi era attivo. In quanto aveva

tante mutazioni. Dato che tra le copie trovate nessuna era attiva, si è pensato

di “risvegliare” l’elemento trasponibile. I ricercatori presero tante copie del

gene della “trasposasi” inattivo causato da mutazioni che erano presenti nelle

regioni codificanti della trasposasi stessa. Dobbiamo risalire alla sequenza

originaria. È stato ricostruito l’intero gene della trasposasi SP, andando a

eliminare i codoni di stop prematuri tra loro quante più sequenze di ET inattivi

possibili. Con un processo al contrario, si è ricostruito, per confronto la

sequenza del gene che codificava per la trasposasi. A questo punto si prende la

sequenza del gene che codificava pe la trasposasi. A questo punto si prende la

sequenza meno mutata di tutte e si applicano tante mutazioni sito-specifiche

(con megapriming o quick change) per ricostruire quella ancestrale, attiva. Una

volta ottenuta una trasposasi attiva, si sono fatti saggi di attività del dominio

NLS, saggi sulla capacità di legare le IR, saggi di attività per il paired like

domain with leucine zipper e glycine rich box; ed infine saggi di trasfezione

della capacità integrativa si SR in cellule di mammifero e altri vertebrati.

Nota: per testare il paired like domain with leucine zipper della trasposasi,

faremo un saggio di attività per cui utilizzeremo un vettore di espressione

(promotore, sequenza di terminazione, inducibile). Incuberemo con IPTG

(induttore gratuito di trascrizione), che impedirà al repressore di legarsi al

promotore. A questo punto la polimerasi potrà trascrivere. Poi, usando una

sequenza di secrezione (propria del vettore) o un tag, potremo purificare la

proteina. In realtà basta l’N-terminale della traposasi, dato che la leucine zipper

si trova lì, per verificare per la sua interazione con DNA.

Nota: per testare la capacità di interazione del DBD del trasposone, faccio un

saggio EMSA. Ci servirà incubare uno strand DNA e una proteina che la lega, in

questo caso il frammento di trasposasi con leucine zipper. Faccio correre il DNA

libero, e accanto il DNA con la proteina; la seconda lane avrà mobilità minore.

Nel nostro caso si è usato l’DBD dello SP come DNA, e la proteina N123. Ad

aumentare della concentrazione di N123, noteremo che l’DBD libero sarà

sempre minore, mentre il complesso sarà sempre più presente (shift verso

l’altro).

OPPURE

Posso fare un semplice DNA footprinting. Vado ad individuare lo spazio che

occupa una proteina su un determinato acido nucleico.

- Risvegliando SP, questo è stato proposto come efficiente sistema di

trasfezione per la terapia genica oltre che come strumento per la genomica

funzionale.

Il saggio di trasposizione è un altro saggio dove il test avviene su cellule di

vertebrato; vengono sfruttati i plasmidi: uno con le sequenze invertite ripetute

che portano un gene reporter + un plasmide helper che contiene la sequenza

ripristinata con un promotore forte. Usiamo un agente trasfettante per inserire i

plasmidi in cellule ILA di calcinoma umano. Dopo un paio di giorni aggiungiamo

G418, un agente che uccide tutte le cellule senza resistenza e seleziono solo

quelle vive. Se usiamo su alcune cellule un plasmide helper di controllo

(sequenza invertita e dunque non codifica) osserviamo che le cellule hanno

resistenza ma non hanno trasposto: nei processi di riparazione del DNA è stato

inglobato l’intero plasmide. Questo è un meccanismo di controllo per trovare le

cellule resistenti e che hanno subito trasposizione. Il plasmide Helper ha solo 1

sequenza terminale ripetuta invertita ma per la trasposizione servono

entrambe le sequenze. Il sistema sleeping beauty è stato usato come elemento

trasponibile (terapia genica ecc).

- Cellule ospiti: cellule di calcinoma ovarico HeLa (molto efficienti)

- Plasmidi in uso:

Donatore: presenta un promotore, i terminali ripetuti e invertiti del

 trasposone e una cassetta di resistenza alla G418 (che ha lo stesso

effetto della kanamicina  inibitore di sintesi proteica)

Helper: ha un promotore forte e il gene che contiene che la trasposasi

 codificata da SB

Se la trasformazione avviene, questa conferirà resistenza alla G418 alle cellule

trasformate, quindi sopravviveranno in un terreno con G418. Sono state

allestite più prove:

- Il plasmide helper ha la sequenza al contrario. È un controllo, c’è resistenza

ma non trasposizione.

- Il plasmide donatore è in regola, così come l’helper. La resistenza c’è, così

come la trasposizione. Infatti la piastra è affollata di cellule

- Il plasmide helper manca della triade catalitica.

- Il plasmide helper non ha una sequenza funzionante (è la SB10 la sequenza

della trasposasi).

- Il plasmide donatore manca di uno dei due terminali quindi non avviene la

trasposizione

Con cosa uso tale sistema di trasposizione?

- Coltura cellulare

- Transgenesi

- Mutagenesi inserzionale

- Terapia genica

Nota: dall’originario SB10 siamo arrivati all’SB1000X che ha una capacità di

trasposizione migliore di SB10

Nota: ET e ciliati

Nella formazione del macronucleo, si necessita che i cromosomi vengano

spezzettati al suo interno. Tale sistema di rottura derivano da ET, poi diventati

geni propri. In particolare, si è osservato che nel micronucleo, l’organizzazione

dei geni è ben più larga e disordinata. Nel macronucleo, i singoli elementi

vengono riordinati e le porzioni non codificanti sono eliminate. Questo evento

non può essere un semplice evento di splicing, anche perché non riguarda

trascritti. È un sistema taglia ricuci che in realtà deriva dagli ET.

Nota: anche nell’immonuglobulina umana avviene un evento di ristrutturazione

del gene. È un evento di splicing somatico, cioè splicing di DNA. L’obiettivo è

quello di riavvicinare le sequenze J, D e V, per farne un trascritto. Tale evento di

splincing somatico è diverso per ogni tipo di immunoglobulina, e durante il

riparo di questa rottura cromosomica si genera ancora più variabilità. Ma allora

il genoma delle cellule è tutto diverso tra loro. Questo è vero per ogni cellula

del nostro corpo. Siamo chimere, mosaici genici.

Operoni (regolazione genica)

Regolazione dell’espressione genica (eukarya)

L’espressione genica è regolata da moltissimi elementi, tra cui un trascritto

stabile, un sistema di traduzione efficiente, modificazioni post-traduzionali e

post-trascrizionali efficienti, etc, e soprattutto dalle sequenze di regolazione

primarie (promotore) e accessorie (enhancer, insulator, silencer). Nel caso dei

procarioti si trovano inoltre degli insiemi di geni, la cui espressione è

strettamente correlata  operoni. Ogni operone è sotto il controllo di un

operatore, una sequenza di DNA che regola dei geni a seguito.

Operone LAC: il più famoso operone conosciuto

- I (Inhibitor) = sequenze di codifica per l’inibitore dell’operone lac. Si trova

giusto a monte del promotore (in questo caso)

- O (operator) = sequenze operatrici

- LacZ = codifica per beta galattosidasi

- LacY = codifica per galattoside permeasi

- LacA = codifica per transacetilasi

L’espressione della beta galattosidasi dvenne importante nel 1950 circa,

quando si studiò il fenomeno di induzione del processamento del lattosio in

E.Coli. Precedentemente si credeva che le cellule presentassero tutte le

proteine codificabili sottoforma di enzimi precursori inattivi. Così, se necessari,

sarebbero stati trasformati in attivi e utilizzati = teoria dell’adattamento.

- Gli studi di Jacob e Monod portarono all’osservazione dello shift diauxico (fase

in cui un ceppo di E.Coli passa da un tipo di metabolismo ad un altro, in questo

caso a causa di due fonti di C).

Disegnando una curva di crescita di E.Coli in presenza di glucosio, osserveremo

una fase esponenziale che definirà una sola sigmoide. Nel caso in cui invece ci

sia un terreno con due zuccheri (glucosio e lattosio), la curva di crescita

presenterà un piccolo plateau si credeva fosse dovuto all’attivazione dei

precursori inattivi degli enzimi per il lattosio.

- Nello stesso periodo, inoltre, si scoprirono le molecole di induzione come

l’IPTG – isopropil – beta D tiogalattoside. Questo è un induttore gratuito, ossia

una molecola che permette l’induzione ma non è substrato. (anzi causa l’idrolisi

dell’X gal in galattosio, che è sub per il lac). Un induttore determina la

produzione 1000 volte più grande di prodotti cellulari di un operone. Questo

elemento permise a Jacob e Monod di spingere più in la i loro studi.

- Si proposero di far crescere un ceppo di E.Coli in presenza di glucosio e non di

lattosio. Durante tale crescita venivano forniti alla cellula degli aa radioattivi.

Successivamente, con lo spostamento delle colonie su un terreno contenente

lattosio (e non glucosio) e aa non radioattivi, si notò che gli enzimi riguardanti il

processamento del lattosio non fossero radioattivi. Questo significa che tali

enzimi, durante la fase di crescita in glucosio, non erano stati espressi. J&M

dimostrarono che l’induzione coincideva con la sintesi di nuove molecole di

enzima (come confermato dagli studi cinetici). Era quindi chiaro che la cellula

poteva “attivare e disattivare” un operone. Successivamente si scoprì che le

concentrazioni di proteine sintetizzate dall’operone lac erano equimolari. Tale

scoperta avvenne grazie all’uso di mutanti, in modo da mappare le regioni

regolatrici nei presso di Z, Y e A. Tra i mutanti, trovarono un lac costitutivo

(ossia, non inducibile, nominato I-). A livello della crescita batterica, il plateau

di intercambio glucosio/lattosio tipico della sigmoide diauxica spariva, data la

disponibilità immediata di proteine per il lattosio. I batteri WT impiegano circa

40 minuti per passare da glucosio a lattosio (il plateau); i mutanti lac costitutivi

non presentano affatto fase lag. Questo significa che mentre i Wt iniziano a

crescere con lattosio, i lac costitutivi sono già floridi. In questo modo,

alternando continuamente lavaggio glucosio-lattosio, arriverò a una coltura che

presenta solo lac costitutivi. Dopo 15 passaggi nell’ultima coltura si ottengono

solo mutanti costitutivi. Si procedette ad una caratterizzazione genetica di tali

ceppi. Servirebbe una condizione di diploidia, ma l’E.Coli è aploide.

Fortunatamente, in contemporanea si stavano facendo studi sul fattore F.

Durante la fase di excisione, il fattore F può fare excisione imprecisa, portando

via con sé alcuni marcatori cromosomici. In questo modo, se inserisco un

plasmide F con marcatori cromosomici in un ceppo F- otterrò un diploide

parziale per il locus, che F si è portato dietro. Posso far sì che F porti con sé

tutto l’operone lac, così da avere un diploide parziale.

1) I- Zà Y+ / I+ Z+ Y+  cellula inducibile

I- è recessivo rispetto a I+. Questo perché il repressore può essere sintetizzato

dal filamento I+ (WT) e andare ad inibire tutte e due le regioni O dell’operone.

Significa che I è un fattore transagente

2) I+ Z- Y+/ F I- Z+ Y+

E’ ancora una volta il caso di una induzione. Inoltre, Z- viene compensato da

Z+ del plasmide F

3) Esiste una seconda categoria di mutanti di tipo IS (mutanti superrepressi).

IS+ sono dominanti su I+ e I-. Anche in presenza di lattosio non ci sarà alcun

tipo di induzione, persino in presenza di IPTG. La spiegazione di una

repressione così totale giace probabilmente a livello di una alterazione del sito

di legame stereospecifico e distruggendo il legame all’induttore.

L’inibitore (R) di IS non può legare l’induttore, quindi non c’è repressione

dell’inibitore. Non c’è interazione e quindi induzione. (il caso in basso è quello

che dovrebbe accadere).

4) Una terza classe di mutanti riguardano l’operatore (l’operatore è stato

definito proprio grazie a questi studi; si sono stati fatti dei saggi di foot printing

per capire la posizione dell’induttore sull’operatore).

L’operatore è un cis-agente. Le mutazioni di quest’ultimo (Oc, operatore

costitutivo) generano ceppi in cui il repressore non può legarsi all’operatore lac

(situazione di cis-dominanza). In mancanza di inibizione, l’espressione

dell’operone lac è valida anche in assenza di induttori.

Regolazione di lac con glucosio

- Regolazione negativa inducibile: il glucosio previene l’espressione

dell’operone lac (il glucosio è la fonte di carbonio preferita, quindi è usato

prima del lattosio)

- Sistema di repressione da catabolita: esiste anche una forma di repressione

da catabolita (cap un fattore di trascrizione, che lega c AMP se è presente nella

cellula. Il promotore stesso contiene CAP/c AMP binding sites).

C’è quindi un doppio livello di regolazione, che permette un sistema efficiente e

molto fine: non p un semplice sistema ON/OFF, ma è graduale e controllato. Se

fosse un meccanismo acceso/spento, il lattosio non potrebbe entrare in cellula

per mancanza della permeasi. Ecco perché, quando il glucosio termina, si

produce una piccola quantità di c AMP per permettere un esiguo numero di

trascritti dell’operone lac. In questo modo la cellula presenta un certo numero

di permeasi, che verranno usate al termine dell’uso del glucosio (la cellula non

viene presa di sorpresa)

- La c AMP è un effettore

- Bassso glucosio  alto c AMP

- Alto glucosio  basso c AMP

Se il glucosio è assente, la CAP lega il c AMP. Tale complesso lega il promotore

ed esercita un’azione positiva sulla trascrizione dei geni lac; per permettere

l’induzione dovrà anche legarsi al DNA.

Operone TRP

- Regolazione con processo di attenuazione, che si basa sulle strutture

secondarie dell’m RNA che codifica per le proteine dell’operone W. È un sistema

indipendente dal pathway di repressione, ed è mediato dalla regione leader

dell’operone.

- Regolazione negativa: di repressione, che si basa sul controllo dell’inizio della

trascrizione. Si tratta della codifica di un repressore (trpR) che agisce con il

triptofano stesso (è un co-repressore). Nello stato di repressione, l’operone trp

presenta 70 volte di livelli di trascrizione più bassi.

Nota: l’attenuazione riguarda anche altri operoni per aa

Elementi di regolazione della trascrizione

Fattori di trascrizione

Promuovono la trascrizione legando DNA e attivando la trascrizione. Tali due

funzioni risiedono in domini separati della proteina. L’attivazione avviene

attraverso l’interazione con altri TFs o RNA pol

Sequenze di regolazione

Promotore

- Sequenza modulare (possiede sottosequenze con funzioni diverse tra loro.

Ogni modulo lega proteine specifiche che innescano la trascrizione)

- Sono stati evidenziati grazie alla costruzione di mutanti di cui si variava la

lunghezza delle sequenze antecedenti a quelle codificanti. Facendo delezione

di alcune sequenze, tra cui alcuni moduli del promotore, l’efficienza di

trascrizione variava notevolmente.

Nota: a livello di lab, per definire se una sequenza è o non è un promotore,

utilizzo un gene reporter e clono in vettori di espressione. Se il sistema reporter

viene sintetizzato (poiché posto successivamente ad una sequenza che si

sospetta contenere un promotore), allora quella sequenze è un promotore.

Nota: come si possono individuare i moduli del promotore? Induco mutazioni a

livello dei singoli nucleotidi, e per ogni sequenza mutande vado a quantificare

l’efficienza di trascrizione. Per fare ciò, isolo gli m RNA prodotti da ogni

filamento con promotore mutato. Prenderò tali m RNA e li retrotrascrivo, al fine

di ottenere c DNA. Utilizza tale c DNA come base di amplificazione, utilizzando

primer marcati con fluorocromi. Il prodotto di amplificazione è fluorescente e se

ho usato la PCR real time, posso quantificare il trascritto di partenza. In

parallelo dovrò aver allestito varie altre prove con cui potrò costruire una retta

di taratura. A questo punto posso individuare il valore di fluorescenza registrato

e quindi definire il numero di trascritti in provetta.

FRET (fluorescence resonance energy trasfer): tecnica usata per caratterizzare

molecole biologiche, soprattutto a livello delle interazioni tra loro. Nel nostro

caso vogliamo usarlo per visualizzare mutazioni dei promotori attive o no. La

tecnica si basa sull’uso di due fluorocromi, uno usato per definire che un

filamento di DNA è libero (rosso) mentre per definire se un filamento è

occupato se ne usa uno verde, a cui la molecola con cui il DNA interagisce (da

un promotore, da un TF) è legata. Se il filamento è libero il fluorocromo rosso

assorbe ed emette energia; se invece si presenta la molecola che lega il DNA,

per il fenomeno di risonanza l’energia liberata si trasmette al fluorocromo

verde. In questo modo, posso capire quali promotori mutanti presentano moduli

che ancora interagiscono con le proteine di trascrizione.

- Tutto l’insieme di tali esperimenti serve a caratterizzare mutazioni di

promotori a livelli dei nucleotidi, che definiranno una diversa efficienza di

trascrizione.

- Altri saggi di efficienza del promotore sono per esempio il saggio con la

luciferasi.

I promotori eucariotici si dividono rispetto al tipo di RNA pol che utilizzano (I, II,

III)

Classe I

- Rappresenta il 50% dell’attività trascrizionale nella cellula eucariotica

- L’unico prodotto di questa trascrizione è il pre- r RNA, che attraverso un

processo di maturazione, produce le specie mature r RNA 18-5, 8-28S

- Clusterizzati su uno o pochi cromosomi specifici, rispetto a regioni

morfologicamente distinte che prendono in nome di NOR (organizzatori

nucleolari  il nucleolo è la porzione di nucleo in cui permangono gli r RNA in

maturazione). Con la microscopia elettronica si possono visualizzare degli

“alberi” di r RNA che si replicano continuamente. Ogni “ramo” dell’albero

accoglie più di una RNA pol I che replica mano a mano i geni di r RNA.

Nota: è stato dimostrato che ci sono ribosomi anche nel nucleolo. Si è

confermati con gli studi sulle NMD: sono alleli mutati di geni in cui è insorto un

codone di stop, che quindi rendono m RNA non utili. Questo m RNA viene

degradato, ma prima viene “provato” da questi ribosomi, che fanno una

traduzione di prova. Se il prodotto è attivo l’m RNA passa oltre, se non lo è,

viene degradato.

Promotori di classe I (geni per r RNA) è composto di due moduli principali:

- Promotori Base (o centrale) compreso tra -45 + 20. Comprende all’interno

l’inizio di trascrizione (1+). La delezione di tale sequenza o la sostituzione con

un altro oligonucleotide, diminuisce drasticamente la trascrizione dell’r RNA.

- Elemento a controllo a monte (UCE) compreso tra -156 e -107, determina un

aumento significativo del tasso di trascrizione a partire dal promotore centrale

Nota: La distanza e l’orientamento reciproco tra le due regioni di controllo è

fondamentale per l’efficienza di trascrizione.

Fattori di trascrizione di classe I

- UBF-1 e SL-1 (nelle cellule umane) che assieme alla RNApol I promuovono la

trascrizione dei geni per r RNA.

- UBF-1 si lega alla regione 3’ UCE e ad una sequenza del promotore base

- SL-1 non interagisce con il DNA ma rafforza l’interazione dell’UBF-1 con il

promotore centrale. (formano un complesso che diventa una piattaforma che

accoglie l’RNApolI). Inoltre questa proteina è specie-specifica. Forma un

complesso con la proteina TBP che lega la TATA box ed altri tre fattori associati

alla TBP. Tuttavia, dato che SL-1 non si lega al DNA, interagisce con più proteine

diverse per formare complessi multifattoriali.

Classe III

- Gli RNA trascritti da questi geni codificano per piccoli RNA per la sintesi

proteica, come i t RNA e gli r RNA 5s, RNA di trasporto come RNA 7s ed RNA

per i processi di maturazione post-trascrizionali.

Promotori di classe III

Si trovano all’interno della sequenza codificante stessa. Cioè in alcuni punti,

regioni codificanti e quelle regolative coincidono, quindi le due non possono

evolvere indipendentemente, come accade per gli altri geni. Devono co

evolvere, il che è un fenomeno complesso e sfavorito. Tale caratteristica fu

evidenziata grazie a delle analisi di delezione condotte sul gene 5S di Xenopus.

Sintetizzo dei filamenti che sono progressivamente più corti al 5’: quando le

delezioni mangiano via il promotore, la trascrizione non viene più eseguita. Nel

nostro caso, i filamenti deleti trascrivevano anche se la delezione arriva nei

pressi della sequenza codificante. Tale studi hanno fatto emergere la presenza

di ICR (regioni di controllo interne) tra le posizioni 50+ e 90+, che ad una

analisi approfondita è stata suddivisa in:

- A Box (+50/+64), particolare di tutti i promotori di tali geni

- C box (+80/+90) caratteristica dei geni 5S

Nota: ancora una volta la distanza tra le due box è fondamentale

Nota: per i t RNA l’A box è a +10/+20 mentre la B box è tra +50/+65

Nota: per avviare la trascrizione di RNA III richiede l’intervento di attori proteici.

Tutti i geni che presentano ICR hanno bisogno di TFIIIB e TFIIIC1-C2 mentre i 5S

richiedono TFIIIA.

Classe II

- Generano trascritti di proteine, cioè m RNA e RNA di tipo U (tranne l’U6) che

fomano le snRP (snRNA)

- Modificazioni post trascrizionali come cappuccio, cosa di poli A, splicing.

Promotori di classe II: posti a monte del gene e modulari. (esistono anche

promotori alla valle del gene come il DPE ma possono anche non esserci)

Nota: i moduli servono a diluire l’effetto delle mutazioni sulle regioni regolatrici.

- Porzione centrale (core-promoter + proximal-promoter) riconosciute dai RF più

generici.

- Il core promoter è composto da TATA boc, CCAAT box e GC box, elemento che

riconosce il TFIIB (BRE), l’iniziatore (Inr) e l’elemento promotore a valle (DPE –

down stream promoter). Posizionato a -35.

- Il promotore prossimale è a 200/300 bp upstream, è responsabile in parte

della modulazione dell’espressione.

- Il promotore distale è a 100bp/2mb lontano. Il promotore distale può essere

un enhancer o una regione di risposta (RE). Una RE è una sequenza che viene

influenzata dalla presenza di un induttore.

Nota: esistono anche dei geni TATA less che pur tuttavia possono usare la TBP.

- Regione regolative che vengono riconosciuti come fattori di regolazione che di

volta in volta modulano la funzione dei fattori genici.

Fattori di trascrizione di classe II

- La RNA pol II richiede i fattori di trascrizione per formare complessi

trascrizionali funzionanti, che regolano tutta l’attività della pol

- Alcuni TF possono legarsi a più di un motivo e viceversa può succedere.

Alcune regioni promotrici conservate

TATA BOX: sequenza consensus TATAAA (A): lega la TBP ed i TAF correlati ad

essa; è posizionata a -25/-30 dal TTS

Inr box: sequenza consensus presente nei promotori con e senza la TATA box

DPE: Downstream promoter element, è presente nel 30% dei promotori

presente, di solito nei promotori TATA less ma che devono avere Inr.

BRE: B recognition Element, sequenza consensus G/C, G/C, G/A, CGCC è

posizionata immediatamente a monte della TATA box, lega TFIIB

CAAT box: sequenza consensus: CCAAT è posizionata generalmente a -60/-100.

Nei promotori TATA less può trovarsi vicino a Inr; si trova nel 50% dei promotori

dei vertebrati

CpG islands: è presente nel 50% dei promotori. Di solito questi promotori non

presentano né TATA box né DPE.

Nota: i geni housekeeping hanno tanti residui CG a livello di varie sequenze. La

metilazione della C (di cui sono ricche le CpG island) regolano la trascrizione,

cioè l’apertura/chiusura nella cromatina. Questa caratteristica è tipica degli

eucarioti superiori (animali a sangue caldo).

Nota: la TATA box è un elemento estremamente conservato nei geni eucariotici.

Per confermarlo basta mettere a confronto varie TATA box provenienti da

diversi promotori, e contare il numero di volte in cui, sul totale di nucleotidi, c’è

una T o una A (rispetto alla posizione). L’indice di conservazione è altissimo.

Fattori di trascrizione: a review

- TF generali (GTF): formano l’apparato trascrizionale basale con RNA pol II,

sufficiente alla trascrizione in vitro (in assenza di cromatina). Sono TBP (TATA

binding protein), TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH

- TF specifici: richiesti per la trascrizione attivata

 Servono per reclutare e assemblare l’apparato trascrizionale, sia

direttamente che mediante il reclutamento di co attivatori

 Si legano a elementi di riconoscimento sul promotore e sull’enhancer

 La loro funzione principale è quella di facilitare l’assemblaggio del

macchinario basale di trascrizione sul core promoter. Ciò avviene: tramite

reclutamento di GTF e componenti del mediatore, tramite reclutamento

di HAT oppure di attività che rimodellano la cromatina, tramite attività

acetilasiche intrinseche.

Come promuovono la trascrizione? Legano il DNA e attivano la trascrizione. Tali

due funzioni risiedono in domini separati dalla proteina. L’attivazione avviene

attraverso l’interazione con altri TF e/o RNA pol.

1) Come riconosco le sequenze di DNA con cui interagire? Con strutture

proteiche particolari, come i motivi zinc finger, leucine zipper, helix-turn-helix,

helix-loop-helix.

2) L’attivazione della trascrizione: nel lievito osserviamo l’attivatore della

trascrizione per i geni che riguardano il metabolismo del galattosio, cioè

l’interazione tra GAL4 (TF) e UAS (upstream activating sequence)

- GAL4 riconosce e lega quattro piccole sequenze a livello dell’UAS

- GAL4 presenta una regione di legame con UAS, una regione di attivazione

della trascrizione I e II

Anche le regioni di GAL4 sono state individuate con una analisi di delezione.

Creo delle proteine con aa deleti e sfrutto un gene reporter, nel nostro caso la

CAT. Resistenza al Cloramfenicolo. Uso due plasmidi: uno per la sequenza di

GAL4 (+ il suo promotore) e uno con più sequenze UAS che precedono la

sequenza che codifica per il nostro reporter. Faccio trasfezione all’interno di

cellule umane (che in realtà non presentano proteine GAL4). Quello che

osservo è la presenza o assenza del sistema reporter nelle cellule trasfettate:

l’espressione avviene se il dominio di riconoscimento a UAS e almeno uno dei

due domini di attivazione di trascrizione sono presenti.

Promotori di eucarioti

Sono ben più complessi di quelli dei procarioti e possono presentare sistemi

“alternativi” ossia un gene può disporre di più promotori a monte se stesso. In

tal modo si generano diversi tipi di trascritti, magari contenenti regioni UTR 5’

utili a contenere segnali di localizzazione subcellulare.

Ex: Salmonella Typhimurium (enterica): i suoi flagelli sono le componenti con

proprietà antigeniche riconosciute dai sistemi immunitari degli organismi che

infetta. Vive a livello degli intestini degli animali. Il meccanismo con cui riesce a

prendere di sorpresa gli animali è eccezionale e prende il nome di “variazione

di fase”: ogni 1000 generazioni, questo batterio cambia la tipologia di flagellina

che produce, così da scavalcare i sistemi immunitari.

- La flagellina “usuale” è codificata dal gene flj B

- La flagellina scondaria è codificata dal gene fli-C

La variazione di fase è causata dalla periodica inversione di DNA contenente il

promotore del gene della flagellina. Si tratta di una ricombinazione sito-

specifica mediata dalla ricombinasi Hin a livello delle sequenze “hix” (14 basi)

a ciascuna delle due estremità del promotore. In un caso, il promotore sarà

orientato in modo che si possano sintetizzare i geni fljB e fljA; il secondo gene

sintetizza un repressore che blocca la trascrizione della flagellina alternativa.

Nell’altro caso, dopo l’inversione del promotore a causa delle hix, la mancata

direzionalità corretta impedisce la trascrizione di fljB e fljA; in mancanza del

repressore, fliC è libera di essere trascritta.

Nota: la ricombinasi Hin (il cui gene è posizionato tra il promotore e una hix) è

sintetizzata in ogni caso, indipendentemente dall’orientamento del segmento

di DNA, quindi il passaggio di fase è sempre possibile. A differenza degli altri

tipi di regolazione, questa è un “ON/OFF”; ossia il gene non può esprimersi se

invertito il promotore.

La trascrizione eucariotica presenta:

- Fattori di trascrizione speciali, regolati dal calore, dalla luce, degli ormoni

- Esistono anche delle sequenze particolari trovate nelle vicinanze dei geni, gli

enhancers eucariotici.

Caratteristiche

- Spesso interagiscono con i TF di base e con la RNApol II

- Regolano l’espressione di un gene (enhance = migliorare)

- Agiscono anche a grande distanza dai geni (> = kpb) (al contrario dei

promotori)

- Non hanno direzionalità, funzionano anche invertiti (al contrario dei

promotori)

- I loro effetti sono indipendenti dalla posizione (upstream, downstream,

intronic)

Funzioni:

Stimolano la trascrizione (spesso sono tessuto-specidico)

Meccanismo:

- Molto probabile che i TF si leghino all’enhancer, e con il ripiegamento della

cromatina, il complesso ENH – TF comunichi con il promotore e ne aumenti

l’efficienza.

Proprietà generali:

- Dimensioni variabili (da decine di bp fino ad alcune centinaia)

- Non coinvolti nella determinazione dell’inizio accurato della trascrizione

- Mostrano un notevole grado di conservazione tra specie diverse

- Sono formati da alcune brevi ripetizioni (10-15pb), quindi modulari

- La loro attività è indipendente rispetto al gene

- Sono attivi solo in cis

- Transvection

Ex: y (yellow) in Drosophila utilizza più enhancer. Quattro, per la precisione,

poiché promuovono la colorazione gialla in diversi tessuti del moscerino.

Volendo fare un esempio: un moscerino eterozigote che geneticamente si

presenta così:

- L’allele nell’immagine, che causa una espressione del pigmento giallo

ovunque, tranne ali, corpo larvale e torace e addome.

- L’altro allele non presenta per esempio promotore, l’espressione del secondo

allele è 0

Eppure se faccio nascere questo mutante, osserverò la colorazione gialla anche

in ali, torace, addome e corpo larvale. Questo perché la posizione dell’enhancer

è indipendente dalla funzione. Il che significa che gli EHN possono anche agire

in trans  trasfezione.

Quello che succede è che gli ENH del secondo allele, agiscono sul promotore

dell’allele 1, permettendo l’espressione dei 3 ENH a monte della TSS (sequenza

inizio trascrizione). Questo evento può essere spiegato con l’ipotesi dei territori

cromosomici. (architettura cromosomica), per cui durante l’interfase, i

cromosomi non hanno posizione casuale, ma be precisa. La possibile estrema

vicinanza dei due alleli durante fase può determinare l’interazione di tali ENH

con il promotore, causando un effetto in trans.

- Possono rispondere a specifici segnali (ormoni steroidei, Heat shock, metalli

pesanti)

- Possono conferire specificità cellulare

- Non sono promotore – specifici (in vitro)

Come posso confermare che gli ENH non sono promotori specifici? Posso

allestire un costrutto di integrazione con P. inserisco un ENH a monte di un

promotore debole di un gene reporter LAC; a valle un altro promotore, questa

volta forte, per un gene reporter che può essere White.

- Il reporter White serve a indicare se la trasformazione è avvenuta

- Il reporter LacZ serve a indicare se l’ENH ha funzionato.

Questo costrutto P posso crearlo in modo diverso: con ENH invertito, con uno

spaziatore che lo allontani dal promotore  riuscirà comunque ad aumentare la

frequenza di trascrizione. Da qui s’intende che gli ENH non solo hanno

posizione arbitraria rispetto alla funzione, ma che sono assolutamente

promotore – aspecifico. L’importante è avere un promotore.

Come individuo un ENH? Uno degli approcci è di tipo casuale. Un esempio sono

gli studi di Conte e Dastruge:

- Costoro avevano un ceppo di Drosophila con occhio arancio, causato da una

inserzione di ET (elemento I) in un locus white. Il ceppo era stabile, per cui è

stato fatto riprodurre: tra la progenie è stato individuato un moscerino con

occhio rosso. Hanno però riscontrato che l’ET era rimasto nella stessa posizione

nel locus white.

- C’era stata una nuova inserzione a monte del promotore, un altro ET (ZAM).

Questo occhio rosso viene fatto riprodurre e nella sua progenie si trova

nuovamente un occhio arancio.

- Vi era stata una ulteriore inserzione di ET (Idefix). Da tale progenie è nato

ancora un occhio rosso.

- Era un altro Idex, questa volta a contrario.

Si tratta di elementi trasponibili con ENH, che variano il fenotipo

dell’organismo, per esempio:

- ZAM ripristina il fattore I, che aveva bloccato la trascrizione

- Idefix porta invece un insulator, che blocca l’ENH di ZAM


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie industriali ed ambientali
SSD:
Università: Bari - Uniba
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher daniela_tortorella di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Ingegneria genetica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bari - Uniba o del prof Marsano René Massimiliano.

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