Schemi di Ingegneria genetica

Caratteristiche di un marcatore molecolare

A parte tutti i nomi, che si dimenticano, è importante sapere come analizzare un marcatore molecolare. Vediamo le caratteristiche di un marcatore:

• La prima cosa che si può fare è analizzare l'abbondanza dei loci che si possono vedere con la tecnica (abbondanza maggiore si ha con il sequenziamento).
• L'altro aspetto è il livello di polimorfismo: se analizzo molte zone del genoma e sono tutte uguali, non ho informazioni, perché cerco qualcosa che differenzi gli individui.
• Specificità per il locus: se devo fare una PCR devo fare una PCR separata per ogni locus o fare un'unica PCR che ricopre tutto? Nel caso dei microsatelliti si fa la MLST con numerosi primer.
• Codominanza del marcatore: un marcatore molecolare viene chiamato dominante o codominante a seconda se riusciamo a vedere l'omozigote o l'eterozigote. Se c'è un polimorfismo che colpisce la zona di annealing del primer.

noi analizziamo la zona, abbiamo l'amplificato se c'è l'allele A e l'allele a se c'è una mutazione puntiforme a livello della zona di attacco del primer che fa sì che il primer non si leghi e quindi non si abbia amplificato. Abbiamo un individuo omozigote AA, abbiamo l'amplificato. Abbiamo un individuo Aa, vediamo l'amplificato. Abbiamo poi l'individuo aa che non dà l'amplificato. Non riesco però a distinguere tra l'individuo AA e Aa poiché vedo in entrambi i casi la banda su gel. marcatore dominante. Questo viene detto in cui non riesco a valutare la presenza dell'eterozigote. Un polimorfismo in cui il primer si attaccava comunque ma la zona amplificata cambiava di dimensione (es. A grande amplifica 100 basi e a presenta una delezione interna ed è di 80 basi). Se trovo su gel la banda da 100 sarà AA, se trovo solo quella da 80 sarà aa se avrò due bande a 100 e a.

80 avrò Aa. Si distingue il genotipo dell'individuo.

Riproducibilità: se altre persone possono riprodurre lo stesso risultato

Intensità del lavoro: quanto devo spendere in termini di energie e tempo per un singolo esperimento?

Domanda tecnica: è possibile attuare l'esperimento in un piccolo laboratorio?

Costi operativi e di sviluppo

Quantità di DNA richieste: l'utilizzo della real time fa sì che non abbia bisogno di grosse quantità di DNA

Possibilità di automazione

Discriminazione famiglie che appartengono a ordini diversi: Se si vuole discriminare una pianta da un animale, il RAPD non ha senso usarlo. Si rischia di avere lo stesso profilo molecolare o bandeggio semplicemente per caso -> non è una buona tecnica se si ha davanti un DNA animale o un DNA di pianta. ARISA o ARDRA (scanning non ad alta densità, si usano enzimi di restrizione) non analizzano il genoma ma solo alcuni geni marcatori.

Servono per fare identificazione e i geni più comuni sono quelli che sintetizzano per gli RNA ribosomiali. L'rRNA ribosomiale 16s o 18s sono usati per l'identificazione per dei motivi molto pratici -> hanno un'ampiezza molto buona per fare PCR, inoltre presentano regioni ipervariabili -> sono zone molto importanti per le funzioni ribosomiali. Ci sono zone che sono meno importanti per la funzione degli rRNA. Il numero di mutazioni che si ha funge da orologio molecolare e per identificarlo si utilizza un semplice finger printing. T-RFLP usa rRNA 16s che viene scandagliato tramite enzimi di restrizione -> si identifica una pianta piuttosto che un animale. Organismi della stessa specie hanno lo stesso rRNA 16s o comunque l'hanno molto simile, quindi quelle poche differenze che si trovano non sono in grado di andare ad identificare un individuo, perché risulta non essere una regione variabile di un individuo di una specie. RFLP: alti polimorfismi, specifici,

codominanti, alta riproducibilità ma alta intensità lavorativa, alta quantità di DNA, non sono automatizzabili, costi operativi alti, domanda tecnica alta.

Microsatelliti: alta abbondanza, alti polimorfismi, alta specificità, codominanti, altamente riproducibili, bassa intensità lavorativa, medio-bassa domanda tecnica, costi operativi medi, bassa quantità di DNA iniziale e automatizzabili. Sono la metodica più utilizzata oggi di genetica forense.

Marcatore molecolare è un marcatore che discrimina qualcosa, da due ceppi batterici, a specie, ordini o domini.

Elettroforesi su gel + southern blotting + conseguente ibridazione con sonda che sarebbe poi migrata in due punti diversi.

Come possiamo utilizzare i polimorfismi? Abbiamo visto un utilizzo nella storia naturale (si analizzano e relazioni fra specie o popolazioni), per la diagnosi di malattie genetiche, individuazione di individui, ceppi o specie, e infine per l'identificazione di.

particolari geni (come accadde per il gene della fibrosicistica). Per trovare geni deputati alla malattia un modo potrebbe essere quello di prendere un genoma malato e uno sano che diano delle differenze significative tra genoma malato e sano. Bisogna tenere conto del cosiddetto squilibrio di linkage, che dice che se geni su un cromosoma sono molto vicini l'uno all'altro, la probabilità che quei due subiscano ricombinazione è bassa. Se ho il marcatore molecolare vicino allo SNP, questo SNP tenderà ad essere sempre presente quando c'è la malattia, perché gli eventi di ricombinazione sono stati pochi. Se poi magari sequenzio la zona vicina al mio marcatore, magari trovo il gene della mia malattia. Quando si analizza il DNA si può analizzare DNA nucleare e citoplasmatico. Si può analizzare tutto il DNA cellulare o concentrarsi su alcune parti del DNA. Perché decidere di scegliere quale DNA studiare? Se si sta analizzando qualcosa in cuiserve distinguere delle parentele legate alla discendenza verticale, analizzare il DNA nucleare significa analizzare il contributo materno e paterno e la ricombinazione che è avvenuta. Per cui i segnali di parentela nell'arco di alcune generazioni rischiano di non essere più leggibili. Se voglio andare più indietro nel tempo, il DNA nucleare non è adatto. Può essere conveniente prendere del DNA che non ricombina, che è stabile e che accumula mutazioni. Si avrebbe così un orologio molecolare che percorrerebbe la storia delle generazioni in base al numero di mutazioni accumulate. Questo DNA non è quello parentale ma è quello mitocondriale o cloroplastico che è trasmesso solo per via materna e non ricombina. Questo permette di analizzare certi aspetti confrontandoli con le altre eredità. Se confrontiamo le stesse popolazioni umane a livello della loro parentela nucleare e della loro parentela mitocondriale, possonovenir fuori delle cose differenti. Si può capire la mobilità differenziale di maschi e femmine e analizzare le strutture sociali e il comportamento delle popolazioni. Si può ricostruire anche qualcosa che abbia a che fare con la biologia di una specie. Nelle piante si può analizzare il DNA cloroplastico e nei batteri il DNA plasmidico. Come tecniche locus specifiche (sappiamo cosa andiamo ad analizzare) abbiamo i microsatelliti, gli PCR-RFLP e l'SNP. Ci sono anche degli scan utilizzati quando i polimorfismi non sono noti (genome wide) e quindi si analizza tutto il genoma (senza sequenziarlo tutto perché ancora non è fattibile per delle indagini, è stato fatto in Islanda) sequenziando alcune zone specifiche (RAD-seq) o facendo una scansione di zone che presentano polimorfismi per enzimi di restrizione (RFLP o AFLP) o polimorfismi nell'annealing di un primer (RAPD). Microsatelliti: regioni di DNA di 10-20 bp e spesso non codificanti.La caratteristica che hanno è che sono altamente ripetute e molto semplici. Sono essenzialmente zone che differenziano gli individui tra di loro, è uno dei sistemi più pratici e a basso costo per poter identificare singoli individui. Esempi di zone satellitari sono: 5'...AGCTTCTATATATATATATATACGTATCG...3' 5'...CGATATTTTTTTTTTCAGTAGT...3' 5'...TAGCTTGATGATGATGATGATGATAGCTTA...3' In queste zone la DNA polimerasi ha dei problemi perché duplicando queste zone tende a inserire o rimuovere una ripetizione. Si ha lo snip della polimerasi (scivolamento); queste zone omolettera confondono il sistema di proofreading della polimerasi e il tasso di mutazioni è molto alto (da 10^-7 che è il tasso standard si arriva a 10^-4 o addirittura 10^-3, il che significa che qui una mutazione è 100.000 volte più probabile che in qualsiasi altra zona). Quindiè ragionevole pensare che nella nostra storia recente abbiamo accumulato un numero sufficiente di generazioni in linea germinale tali da avere tutti un assetto microsatellitare differente. Considerando anche che di queste zone nel genoma ce ne sono migliaia, abbiamo una carta d'identità genetica del nostro genoma. Se noi facciamo il fingerprinting di cellule diverse (braccio e pancia) potrebbe essere differente perché le divisioni cellulari da quando eravamo zigoti sono state differenti. Quello che si fa è amplificare la regione e determinare la dimensione del frammento tramite elettroforesi capillare su poliacrilammide (altamente risolutiva). Esistono casi in cui queste zone possono essere tanto importanti, come è il caso della sindrome da X fragile, in cui si rompe il cromosoma X perché in quella zona c'è un microsatellite ripetuto in TATATA che si è espanso molto e comporta un'alterazione topologica del cromosoma, dando

luogo ad una zona di cromosoma X facile da rompere.

PCR-RFLP: altra tecnica locus specifica. È semplicissima, si amplifica la zona di interesse e si digerisce con enzimi di restrizione. Se quegli enzimi vanno a cadere in zone diagnostiche per una variabile di interesse si avrà il marcatore. Si utilizza sia in ambito clinico che non, per determinare differenze. Un esempio di applicazione è in microbiologia quando si analizzano i geni che codificano per l’RNA 16 S ribosomiale. Questo gene presenta delle zone variabili che possono corrispondere a siti di restrizione di alcuni enzimi e queste zone possono riconoscersi con la PCR-RFLP (si riconoscono ceppi diversi). Oggi si preferisce sequenziare il gene per essere sicuri. La PCR-RFLP dell’RNA ribosomiale 16 S ha un nome particolare e viene chiamata ARDRA. Gli enzimi che si usano riconoscono siti di 4 basi e il motivo è molto semplice: