Ingegneria genetica

Ingegneria genetica (1 lezione)

Presentazione del corso

Questo sarà un corso di metodologie, di strategie dell’ingegneria genetica, quindi differentemente da altri corsi che sono più di tipo monografico, ovverosia si interessano di affrontare un problema che può essere riguardante gli aspetti molecolari della trascrizione, della traduzione, oppure della meiosi. Questo corso sarà un corso di metodi, ma metodi non semplicemente la ricetta per fare una cosa, ma una strategia generale che porti a dire: dal momento in cui devo clonare una sequenza per studiarla, qual è la via migliore? Qual è la strategia migliore? Per esempio, ci sono tre sistemi di clonaggio: da quelli più semplici, i procarioti, a quelli intermedi, gli eucarioti inferiori, a quelli più complessi che sono gli eucarioti superiori. La logica qual è? La logica sarà sempre quella di scegliere la cosa migliore. Non sempre la strategia più semplice è la cosa migliore, ma naturalmente ci saranno dei casi in cui si dovrà salire di complessità e per forza di cose adottare dei sistemi complessi e difficili quando non è possibile affrontare il problema con sistemi più semplici.

Questa è la prima parte del corso, in cui dal clonaggio del gene si passa al fare le genoteche, i tipi di genoteche, come pescare il gene, con quale strumento (sonde, non sonde). Poi, una volta avuta una sequenza, che ci faccio? Come la studio? Come la maneggio? Questi sono frammenti di DNA che possono essere di 40-100 kb, cioè delle cose molto ingombranti, che sono difficili da maneggiare, studiare e complesse nella loro struttura. Quindi, decidere se andare a studiare una sola parte di questa sequenza, perché è la parte che viene trascritta, oppure al contrario potrei proprio scartare la parte trascritta, perché il mio interesse è nella parte regolativa, e come faccio ad identificare l’una e l’altra? Come studio la parte regolativa, con quali mezzi rispetto a quella che viene trascritta?

Un passo ancora avanti è il sequenziamento, la sequenza di base, ma il sequenziamento da solo non dice assolutamente nulla se non è affiancato da altre prove sperimentali: la sequenza può far venire in mente delle cose, in analogia con cose trovate per cui si presume che una certa regione abbia una certa funzione perché rassomiglia a cose conosciute, ma non è una prova. Quindi, la sequenza deve essere affiancata da altre evidenze. Poi naturalmente anche quello di modificare la sequenza, di fare quella che viene detta genetica al contrario. Cioè, ho trovato una sequenza, spesso capita specie con i sequenziamenti automatizzati si arriva a sequenziare interi genomi con sistema veloce e automatizzato, e ottengo una valanga di informazioni, una valanga di sequenze e di possibili geni di cui non si sa niente, cioè il lavoro genetico che è stato fatto su quell’organismo che è stato sequenziato, non è stato completato; spesso si sequenziano specie nuove e di queste specie, il lavoro di genetica, cioè i marcatori, una mutazione, corrispondenza di geni, non si sa nulla. La situazione qui è rovesciata, abbiamo solo una valanga di informazioni e le sequenze non si sa a che servono perché il lavoro genetico non c’è stato.

E allora si può fare la genetica al contrario, cioè posso mutagenizzare in vitro (inattivarlo) un determinato gene, reintrodurlo in vivo, ma vedremo a quali condizioni, cioè ci sono delle condizioni che devono essere ponderate, e vedere il fenotipo risultante. Quindi esattamente la lezione opposta a quella che ha proceduto per decenni la genetica molecolare tradizionale, in cui prima c’era una mutazione genetica, i fenotipi e poi ci si chiedeva come era fatto il gene che c’era dietro, lo vogliamo clonare? Vogliamo vedere di cosa è responsabile? Questa è la prima parte, come dire una metodologia di base, un approccio di base su qualsiasi problema.

La seconda parte del corso

La seconda parte sarà quella appunto più tecnicamente di ingegneria genetica, di ingegneria genomica, cioè in che maniera si possono reintrodurre i geni soprattutto in organismi complessi? Con quale successo, con quale finalità? Aggiungo dei geni o li sostituisco? C’è una grossa differenza, perché voi sapete che aggiungere dei geni, cioè metterli dentro un plasmide, ad es mettere una sequenza per modificare un fenotipo, se questo fenotipo è dominante, va bene, nel senso che si imporrà come fenotipo cellulare, ma se la sequenza che io introduco è recessiva, un gene che ha un difetto, come posso pensare di fare questo con successo? C’è una coppia di geni endogeni (perché parliamo di eucarioti) che sono funzionanti e che sono dominanti, perché quando una cosa funziona di solito è dominante; quindi con quale successo introduco un gene modificato se ci sono i due funzionanti?

Sarebbe un’operazione inutile, silente per così dire. Quindi in questo caso, la metodologia più complessa sarà di sostituire i geni endogeni con quelli esogeni e questa operazione prevede un’operazione chirurgica di rimozione di nucleotide in quelle sequenze e di sostituzione con un altro che voglio. Cosa semplice da fare in vitro magari, ma non in vivo; in vivo un processo così preciso, la sapete la ricombinazione omologa? L’unico sistema di scambio perfetto tra due alleli uno mutato e uno non, oppure due mutati, quello che volete, comunque scambio tra due alleli. Quindi praticamente l’obiettivo, che poi sostanzialmente è anche quello della terapia genica, è proprio di fare questa operazione, cioè che produca meno danni possibili, meno carico genetico possibile e che porti a un’operazione di sostituzione di una forma allelica con un’altra; cosa difficilissima, perché nei microrganismi questo processo avviene sempre ad altissima efficienza anche in cellule che semplicemente si moltiplicano, negli eucarioti superiori per esempio, questa operazione invece avviene ad alta efficienza soltanto nella meiosi, ma se dovete correggere un difetto, cosa che capita normalmente come problematica della terapia genica, dovete farlo sulle cellule somatiche e le cellule somatiche hanno una ricombinazione omologa a livello infimo, non è che non ci sia, ma è ad un livello che è circa 10000 volte inferiore a quella meiotica.

Per cui vedremo quali sono tutti i trucchi, le strategie per poter aumentare questi eventi, oppure quali sono i trucchi per selezionare i rari eventi che, vista la bassa frequenza di ricombinazione, noi otteniamo. Vedremo di volta in volta: una cosa è operare questa operazione su cellule in coltura eucariotiche superiori, una cosa è farlo su organismi “in toto”, sul topo ad esempio. E quindi diciamo questo è il quadro generale del problema: da una parte tecniche generali di clonaggio e strategie per clonare, studiare e modificare geni, dall’altra parte l’ingegneria genetica più propriamente detta nel 2015, perché l’ingegneria genetica quando è nata, nel 1975-76, era semplicemente un enzima di restrizione che tagliava il DNA ed era già ingegneria genetica perché era una tale novità voglio dire che nessuno aveva operato sul DNA per quella strada. È ovvio che oggi questa è una metodologia del DNA che viene utilizzata un po’ da tutti, dai biologi cellulari e dai biochimici, ovviamente anche dai genetisti e dai microbiologhi, sono metodologie di base dell’ingegneria genetica, anche se ingegneria genetica è un termine che forse è esagerato per descrivere queste cose, però ingegneria genetica come strategia generale per fare le cose è rimasta, cioè non è che io semplicemente clono questa cosa, prendo già una genoteca, tiro fuori il gene e finito lì, quello non vuol dire avere un quadro generale, quello vuol dire aver risolto il pezzettino di problema che riguarda il clonaggio di un gene.

Diciamo che io cercherò di fare una prima parte che in qualche maniera per forza di cose ricapitola tutto e anche quando parlerò di enzimi di restrizione, non lo farò dicendo semplicemente che esiste l’enzima di restrizione, dirò anche come si può utilizzare l’uno o l’altro, che caratteristiche ha l’uno o l’altro, perché è meglio utilizzare l’uno piuttosto che l’altro, e quindi è già una visione più critica, sempre con l’idea di ragionare sulle cose, di confrontare le cose, qual è la cosa migliore, quali sono i pro e i contro.

Introduzione

Tanto per fare un’esercitazione su cose che conoscete, ma possono essere non ovvie, le risposte infatti non possono essere sempre così scontate. Vediamo queste 4 problematiche che sono di tipo generale:

• È possibile clonare un DNA frammentato non da enzimi di restrizione? Tutti i libri parlano di enzimi di restrizione che tagliano il DNA e clonare; ovviamente non sempre è possibile clonare usando gli enzimi di restrizione. Intanto le prime genoteche che sono state fatte, non sono state fatte utilizzando enzimi di restrizione ed erano di ottima qualità, come vedremo gli enzimi di restrizione vanno usati con cervello perché possono dare delle distorsioni che alla fine escludono certe sequenze completamente: l’uso degli enzimi di restrizione può portare a frammentare il DNA in pezzettini così piccoli e così grandi che si escludono automaticamente dal clonaggio, quindi quando facciamo una genoteca non in maniera mirata, cioè non avendoci pensato bene, potremmo fare una genoteca di stock, in cui avremo clonato soltanto frammenti di dimensione media, che sono quelli clonabili, avendo escluso quelli piccolissimi e quelli grandissimi. Se invece per esempio si procede ad una frammentazione con ultrasuoni è ovvio che la frammentazione è assolutamente random, non tiene conto della sequenza, quindi non esclude a priori nessuna sequenza del DNA, ogni sequenza di DNA ha la stessa possibilità di essere inclusa in un frammento di ricombinazione; però come si clonano? Perché rompere il DNA con ultrasuoni o con altri mezzi chimico/fisici diciamo piuttosto brutali, vuol dire che si formano estremità di tutti i tipi nel DNA, cioè sfalsate in tutte le maniere, irregolari e quindi in questo caso si usano degli enzimi che curano le estremità, cioè che le rendono piatte ad esempio: se uno dei due filamenti protrude, ci sono due strategie o accorciare il filamento lungo e pareggiarlo al corto, o allungare il corto verso il lungo e questo si fa con due enzimi diversi, nel primo caso si usano le esonucleasi, che degradano il singolo filamento più lungo della parte sporgente, pareggiando le estremità; nel secondo caso se c’è la polarità giusta (5’-3’) si usa una DNA polimerasi, o meglio una subunità della DNA polimerasi, che allungherà la parte mancante al filamento più corto, riempiendo la parte mancante stessa. A questo punto vedremo che le estremità piatte così ottenute possono essere clonate nei vettori, hanno efficienza inferiore rispetto alle estremità coesive, ma è un sistema di clonaggio utilizzato.
• A cosa servono le digestioni parziali con RE (enzimi di restrizione)? Digestione parziale significa che viene usata una bassa concentrazione dell’enzima per fare la digestione, per cui non taglia tutto il DNA in tutti i siti di taglio possibili, cioè un DNA che ha 1000 siti di taglio per quell’enzima di restrizione, ci si mette poco enzima in modo che non fa in tempo a tagliare tutti i siti ma ne taglia ad esempio 300. Fare i contigs vuol dire sostanzialmente fare frammenti con digestione parziale, che possono essere digeriti ed è il sistema per fare le genoteche, quello che dicevo io, in questa maniera si ottengono frammenti di tutte le lunghezze, perché sono ottenuti con digestioni parziali, che si sovrappongono anche ed è fondamentale che si sovrappongono, perché se voi clonate questo frammento e fate la sequenza e poi dovete fare la sequenza del genoma e continuare, come sapete che questo frammento è adiacente a quest’altro frammento e non ad un altro, se non attraverso una sovrapposizione? Avete sequenziato questo frammento, vi sequenziate quest’altro, la sequenza comune vi dà la sovrapposizione, voi saprete così che ad esempio il frammento 1 continua nel frammento 2. Un’altra applicazione delle digestioni parziali su cui tornerò sono le mappe di restrizione; le mappe di restrizione si fanno quasi sempre, almeno nel 50% dei casi, con digestioni parziali. Quella di fare mappe di restrizione è una metodologia fondamentale per andare avanti nel lavoro; senza mappe di restrizione è come per uno che non è mai venuto a Roma e non ha una mappa, una cartina con cui orientarsi, non ha nulla; una mappa di restrizione ha questa funzione, cioè quella di fare una mappatura molecolare per sapere come orientarsi e cosa fare con un certo frammento.
• Quante cose vi vengono in mente che si debbano o possano fare dopo aver clonato un lungo frammento da una genoteca genomica? Definire intanto qual è il vostro interesse, voi state studiando un gene come elemento che viene trascritto, cioè un gene strutturale, oppure state pensando a come funziona il genoma, cioè a come funzionano quelle sequenze che fiancheggiano il gene per esempio, cioè le sequenze regolative; quindi sarà importante definire, capire dov’è la parte che viene trascritta e la parte che è adiacente a quella che viene trascritta, per orientarsi a studiare, a subclonare una parte rispetto all’altra e poter fare quelle operazioni per esempio di creare, con sequenze che sono regolative, nuovi costrutti, oppure geni ibridi, geni reporter, che ci permetteranno di studiare l’espressione. Naturalmente, sempre come prima cosa, dopo aver clonato un lungo frammento da una genoteca genomica, si fa la mappa di restrizione, tutte le operazioni che vi ho detto sono in realtà impossibili se come prima cosa non fate una mappa di restrizione.
• Si possono clonare con PCR sequenze sconosciute? La PCR è una bella applicazione, una cosa rivoluzionaria, sicuramente comoda, che per sequenze conosciute o per sequenze di non enorme dimensione, perché la PCR ha dei limiti che sono sulle dimensioni: si può applicare a frammenti di 1 kb, ma se sono di 10kb cominciano ad essere dolori, non è che non si possa fare ci sono stati dei miglioramenti, delle polimerasi nuove che sono state identificate e modificate per poter avere una processività, cioè per poter camminare molto velocemente, poter riuscire ad amplificare in breve tempo lunghi tratti di DNA, però parliamo sempre di sequenze conosciute, cioè perché sapete che bisogna conoscere la sequenza per costruire i primer, quindi se non la conoscete la sequenza che fate? Rinunciate? Utilizzate il clonaggio classico? Si è vero; però ci sono dei trucchi con la PCR inversa per poter clonare delle sequenze adiacenti a quella nota: vi manca un pezzo del gene? Potreste anche non riclonare tutto, ritornare sulla genoteca a prendevi un clone della parte che vi manca, completando e aggiungendola a quella che avete già clonato, ma potreste anche partire da quella e camminare con la PCR, cercando di clonare proprio le zone adiacenti. Ugualmente, avete un gene strutturale e volete clonarvi la parte adiacente, cioè la zona di regolazione? Ecco questo potrebbe essere un approccio. Si è inserito un DNA virale (trasposone o virus tumorale) dentro al DNA, come faccio a capire quale gene è stato colpito? Voi conoscete la sequenza del DNA virale che è nota, quindi con la PCR inversa voi potete camminare e clonarvi le regioni fiancheggianti, che sono proprio rappresentate dal gene che è stato colpito dal virus, cioè in cui il virus a DNA o il trasposone si è inserito, questo per dirvi un’altra possibile applicazione.

Metodi di clonaggio

Questo semplicemente è lo schema generale, che voi già sapete come interpretare, della scelta iniziale se devo clonare un gene, quale delle due strade scelgo, cioè:

• a) Un clonaggio in vivo attraverso vettori, cioè faccio a pezzi il DNA, lo frammento e il frammento, ovviamente questo frammento ed altri perché se è una genoteca saranno migliaia di frammenti, però diciamo come schema che questo frammento lo inserisco in un vettore e attraverso l’amplificazione in vivo, cioè plasmidi, per esempio in questo caso dentro a cellule, ho un’amplificazione in vivo;
• b) Questa invece è l’amplificazione in vitro, con la PCR, in un sistema abiotico, non tramite vettori, non tramite cellule, ma con operazioni di tipo puramente biochimico, con cui, avendo i primer, conoscendo i primer, però in questo caso devo conoscere la sequenza, almeno di queste regioni se non tutta, posso amplificare il frammento di interesse.

Clonaggio per amplificazione in vivo

La logica qual è? L’amplificazione è doppia, nel senso che il discorso è arricchire un frammento che è raro ad un tale livello che diventa puro, cioè un frammento di 4 kb ad esempio dentro ad un genoma di un eucariote superiore come l’uomo, è circa un milionesimo del DNA totale, quindi come faccio a studiarlo? È come l’ago in un pagliaio, tutto il resto del DNA mi interferirà con qualsiasi procedura di studio che voglio fare, finché io quel frammento non lo ho amplificato e purificato non potrò studiarlo, devo prima purificarlo, amplificarlo e poi studiarlo. Allora i vettori che si utilizzano che sono vettori o plasmidici o vettori fagici, intanto quindi la prima amplificazione qual è? Che all’interno di...