HPLC e GC - Appunti

La Cromatografia :

‘’chromatography’’

Il termine è connesso alla ‘’separazione visibile’’; dal greco

‘’chroma’’ ‘’grafos’’

(colore) e (scrittura). La definizione ufficiale di cromatografia

riconosciuta dalla IUPAC, è quella di un metodo fisico di separazione nel quale i

componenti da risolvere, sono distribuiti in fasi, una stazionaria ed una mobile.

Le tecniche di cromatografia vengono classificate in base allo stato fisico delle fasi

coinvolte nel processo di separazione.

Esempio:

cromatografia liquido – liquido

1) Nella (LC); le due fasi sono liquide.

cromatografia gas – solido

2) Nella (GSC); la fase mobile è un gas, quella

stazionaria un solido.

cromatografia gas – liquido

3) Nella (GLC); la fase mobile è un gas, quella

stazionaria un liquido.

Cromatografia Liquido – Solido (LSC) :

Serve per l’assorbimento degli analiti sulla superficie polare di un assorbente. La fase

stazionaria è un Gel di silice che lavora a pH 2 – 8; Allumina pH 2 – 12. La fase mobile

è composta da solventi non polari o cloroformio.

Cromatografia su Fasi Legate (BPC) :

Serve per la ripartizione degli analiti tra la superficie idrofobica e metanolo (NON

ACQUA). La fase stazionaria è composta da superfici idrofobiche legate su gel di silice.

La fase mobile è composta da metanolo o acetonitrile e acqua. Viene applicata a

composti solubili in acqua o metanolo: proteine, peptidi, zuccheri, ecc…

Cromatografia Liquida :

Diverse tecniche fanno parte della cromatografia liquida; ricordiamo:

Cromatografia liquido – liquido

1) : nella quale le fasi stazionaria e mobile sono

entrambe liquide. E’ basata sulla relativa solubilità dei soluti nelle fasi; la

separazione avviene per via della diversa affinità dei composti nelle due

fasi (coefficiente di ripartizione ‘’K’’).

Cromatografia di adsorbimento

2) : nella quale la fase stazionaria è solida. E’

basata sull’interazione tra i siti attivi dell’adsorbente (Si o Al) ed i gruppi

funzionali presenti nelle molecole dei soluti da separare. Queste

interazioni sono il risultato di un fenomeno di competizione tra le

molecole della fase mobile e del soluto per i siti attivi. Avremo:

- Cromatografia a fase normale: la fase

stazionaria è di natura polare (Si) mentre la fase mobile non è polare (esano).

- Cromatografia a fase inversa: la fase

stazionaria è di natura non polare (Si modificata con gruppi apolari), mentre la

fase mobile è un liquido Polare (acqua o alcool).

Cromatografia di esclusione (GPC)

3) : la colonna è riempita con materiale poroso;

non si verifica interazione chimica tra soluti e la fase stazionaria,

la separazione avviene in quanto il supporto si comporta come setaccio

molecolare; i soluti di grandi dimensioni non vengono trattenuti. Le

fasi fisse utilizzate si possono dividere in: - rigide: costituiti da vetri

porosi o perle di Si, presentano un’alta

rigidità che dona loro una maggiore

stabilità e facilità di impaccamento.

- semirigide: costituiti da

polimeri (es. poliestere), presentano un

grado abbastanza elevato di

ramificazione per consentire un più basso

potere di rigonfiamento.

Cromatografia a scambio ionico (IEC)

4) : nella quale la fase stazionaria crea una

superficie ionica di carica opposta a quella del campione. Metodo

utilizzato per analizzare composti ionici e ionizzabili. Più sarà forte la

carica del campione più verrà attratto verso la superficie della fase

stazionaria. La fase mobile è un tampone acquoso che

contiene un sale in grado di creare un controione la cui carica è dello

stesso segno dei composti da separare, ma di segno opposto a quella

della fase stazionaria.

Cromatografia liquida su colonna

5) : composta da colonne di 15 – 20 cm di

lunghezza, con un Ø di 1 – 4 cm e riempita con materiale di

impacchettamento (Si). La fase mobile viene aggiunta dalla parte superiore del

tubo ed il processo di eluizione avviene per mezzo delle forza di

gravità. Ha degli svantaggi come: lentezza, scarso potere di

separazione, abilità manuale.

Cromatografia Liquida ad Alta Prestazione (HPLC) :

Vengono utilizzati sistemi interamente automatizzati, che permettono di ottenere

separazioni rapide ad alta risoluzione. Il flusso viene generato mediante pompe ad alta

pressione, mentre un iniettore permette l’introduzione di piccole quantità di campione

in maniera altamente riproducibile. Le tipiche colonne usate in HPCL sono lunghe 10 –

30 cm con un Ø tra 2 – 5 mm e vengono impaccate con materiali a granelli fini ( 3

– 10 µm).

Gli svantaggi sono: I

vantaggi sono:

- Costi elevati. - Velocità

- Manodopera specializzata. - Alta risoluzione.

- Necessità di accoppiamento di determinati - Alta accuratezza.

Sistemi di rivelazione dei picchi - Alta sensibilità.

Fase Mobile :

In HPLC si può usare come solvente o un miscela di due o più solventi. Durante

l’analisi LC possiamo operare mantenendo costante la composizione della fase mobile

o variando la composizione percentuale dei solventi.

Quando bisogna separare composti con caratteristiche di polarità differenti: come, ad

esempio, lavorando in fase inversa, è solito, diminuire la polarità della miscela dei

solventi durante l’applicazione. In questo modo i soluti polari, vengono facilmente

separati dai composti non polari.

’isocratica’’

L’applicazione ‘ richiede 80 minuti; i picchi del cromatogramma risultante

sarebbero slargati.

’gradiente’’

L’applicazione a ‘ richiede 40 minuti; i picchi sono meno slargati e più

alti.

Pompe :

Sono considerate gli elementi più importanti dell’HPLC. Ha la funzione di inviare nella

colonna la fase mobile ad una pressione tale da creare il flusso desiderato.

pompe

Le per HPLC devono avere questi requisiti:

Inerzia chimica

- .

Capacità di generare alte pressioni e flussi da 0,5 – 10 mL/min

- .

Assenza di pulsazioni

- .

Flussi riproducibili

- .

Eluizione a gradiente

- (capacità di cambiare rapidamente il solvente).

Esistono diversi tipi di pompe, i più usati in HPLC sono:

1) A pistoni reciprocanti : costituite da una camma eccentrica, rotante, collegata ad

un motore che forza il pistone ad espellere la fase mobile, attraverso una

valvola; questa assicura che il liquido non scorra in una sola direzione, per cui

quando il pistone torna indietro , la valvola di mandata si chiude, quella di

aspirazione, si apre così la camera della pompa si riempirà; quando il pistone va

in avanti, si chiude la valvola di aspirazione, e si apre quella di mandata e fa

in modo che il solvente venga spinto nella colonna.

Questo sistema genera un flusso pulsato; infatti si è creato un sistema di pompe, per

ridurre al minimo questo ‘’svantaggio’’, introducendo:

2) Le reciprocanti a doppia testa : entrambi i pistoni vengono azionati dallo stesso

motore mediante una camma unica, permettendo uno di pompare e

l’altro di aspirare. queste forniscono un flusso costante, quasi

senza pulsazioni.

3) A siringa : hanno un cilindro che contiene la fase mobile compressa da un pistone,

che viene fatto

avanzare da un motore che aziona una vite senza fine, generando un

flusso senza pulsazioni.

Valvola di iniezione :

L’iniettore è un dispositivo importante e delicato, perché consente di portare il

campione liquido dalla pressione ambiente, alla pressione presente in testa alla

colonna. I sistemi di iniezione mediante la valvola, consentono l’introduzione del

campione con notevole riproducibilità e senza significative variazioni del flusso.

Si tratta di tubi capillari d’acciaio montati su un disco metallico che viene ruotato su

un perno.

Il campione viene introdotto mediante una

’sample loop’’

siringa entro un capillare ‘

caratterizzato da un volume di specifico. Il

riempimento del loop avviene quando esso non

si trova nel circuito della fase mobile. Al termine

’filling’’

del ‘ (quando il campione comincia a

spurgare il loop), la valvola viene fatta ruotare

cambiando il collegamento con i circuiti idraulici.

Così il sample loop viene portato in serie al

circuito con della fase mobile ed il ‘’loop’’ si

inserisce nel cammino della fase mobile (iniezione). Le connessioni tra i circuiti sono

rese disponibili dalla presenza di piccole scanalature sul rotore della valvola.

Colonna :

La separazione dei componenti in una miscela avviene all’interno della colonna. La

maggior parte delle colonne hanno lunghezza tra 3 – 25 cm con diametri di 2,6 – 3

mm, o 4,6 – 5 mm, sono costruite in acciaio inox. Le colonne, solitamente, vengono

commercializzate già impaccate. Con particelle di diametro di 3 – 5 – 10 µm. le due

estremità della colonna, sono racchiuse da filtri d’acciaio sintetizzato detto ‘’frit’’. E’

stato detto che la colonna può essere danneggiata dalla presenza di particelle in

sospensione nella fase mobile. Per evitare ciò è utile far precedere la colonna da una

precolonna, con funzione di filtro; questa precolonna viene impaccata con lo stesso

materiale della colonna. I sistemi HPCL operano a temperatura ambiente o superiori, la

temperatura, comunque, deve sempre essere controllata se si vuole ottenere una

buona riproducibilità analitica. Infatti minime variazioni della temperatura, possono

avere un effetto notevole sugli equilibri termodinamici che si formano all’interno della

colonna durante il processo cromatografico.

Gel di Silice :

E’ una sostanza amorfa, polare ed acida, è disponibile, solitamente, sotto forma di

perle di verto, rivestite di uno strato poroso. La superficie del gel di silice, non è mai

silanolici,

omogenea, ma sono presenti diversi gruppi funzionali. Come i gruppi:

silossanici centri reattivi.

e La dimensione del gel di silice è un parametro che va

tenuto in considerazione per diversi motivi:

- Se vengono utilizzate delle particelle con diametro ridotto, le interazioni soluto – fase

stazionaria sono più numerose in quanto l’area è maggiore.

- Diminuendo la grandezza delle particelle e a parità di lunghezza della colonna, si

ottiene un incremento di efficienza della colonna ma anche una maggiore resistenza al

flusso.

Rivelatori :

detector

Il ha il compito di misurare un parametro caratteristico del soluto e di

trasformarlo in un segnale elettrico, che viene inviato e poi elaborato.

I rivelatori si distinguono in: ’Bulk property’’

- ‘ : sensibili a proprietà dell’insieme

analita – fase. ’Solute proprerty’’

-‘ : sensibili a caratteristiche del

soluto.

Le caratteristiche fondamentali sono:

1) Il segnale di fondo-

2) La costante di tempo.

3) La sensibilità.

4) La quantità minima rilevabile (MDQ).

5) La linearità.

6) L’universalità o la selettività.

1) Il segnale generato dal rivelatore in assenza di analita (senza picco), produce un

segnale di fondo, spesso instabile. Le cause di ciò vengono espresse da due parametri

del segnale di fondo che sono:

rumore nosie:

- Il o caratterizzato da oscillazioni in entrambi i sensi, ad alta o bassa

frequenza.

deriva:

- La innalzamento graduale della linea di base, misurabile per un determinato

tempo.

E’ importante limitare l’entità del rumore, in quanto è un fattore che diminuisce la

sensibilità analitica.

2) la costante di tempo (τ) è una misura del tempo di risposta, caratteristico del

rivelatore; è, in pratica, il tempo richiesto per rispondere al 63,2% di un’improvvisa

variazione del segnale, è inoltre un parametro che va selezionato con attenzione, dato

che, un valore troppo basso genera un eccessivo rumore, invece un valore troppo alto

ha effetti negativi sulla separazione cromatografica.

3 – 4) La sensibilità è strettamente legata alla MDQ, quest’ultima è definita come la

quantità di soluto che genera un picco che abbia un segnale di ampiezza pari almeno

a due volte l’ampiezza del rumore.

4 – 5) Vi è una relazione lineare tra concentrazione dei soluti nel campione e la

risposta del rivelatore. Il ‘’range’’ dinamico lineare, viene misurato tenendo in

considerazione la MDQ e la massima, quantità di uno specifico soluto che genera un

segnale di entità proporzionale.

6) I rivelatori selettivi, vengono usati per la rivelazione solo di alcuni composti, invece

quelli universali per tutti i soluti. UV/Vis

Sono attualmente disponibili sistemi in grado di registrare simultaneamente lo

spettro completo di una molecola, senza interrompere il flusso di solvente. Questo

viene permesso dalla matrice di fotodiodi lunga una striscia sulla quale vengono

disperse le radiazioni elettromagnetiche da parte del prisma. Questo tipo di sistema

richiede l’elaborazione di tutti i segnali provenienti dai diodi. Il rivelatore UV/Vis a

lunghezza d’onda variabile è caratterizzato da una buona sensibilità e selettività

offrendo la possibilità di operare in gradiente.

(RI)

Il rivelatore ad indice di rivelatore è un rivelatore universale. Presenta una

sensibilità piuttosto bassa per cui non viene sfruttato per l’analisi di componenti in

tracce. Un ben definito valore di RI è una caratteristica fisica di ogni molecola. Uno

svantaggio è l’impossibilità di operare in gradiente perché alla variazione della

composizione della fase mobile corrisponde una deriva della linea di base. I rivelatori

RI usati sono: deflessione riflessione

- A e : entrambi sono realizzati con una cella di

misura ed una cella di riferimento. Un rivelatore a deflessione

sfrutta il principio della deflessione: si misura la deflessione di

un raggio di luce al variare dell’indice di rifrazione del liquido nella

cella di misura in confronto alla cella di riferimento. La presenza di

soluto provoca una modificazione dell’angolo di rifrazione,

generando una variazione del segnale che raggiunge il rivelatore.

L’entità del segnale è correlata alla concentrazione del soluto.

fluorescenza

I rivelatori a funzionano attraverso la misurazione dell’intensità della

radiazione di fluorescenza emessa quando un soluto è eccitato tramite UV di

opportuna frequenza.

elettrochimico

Il rivelatore si basa sull’ossidazione o sulla riduzione di un soluto su

un elettrodo e sulla misura della corrente risultante. Il processo è quantitativo. Questi

rivelatori si distinguono in due classi:

Amperometrici

- : sono i più diffusi.

Polarografici

- : utilizzati per applicazioni particolari.

La fase mobile deve essere resa elettricamente conduttiva con l’aggiunta di un sale,

ciò ne esclude l’utilizzo per tecniche cromatografiche caratterizzate da solventi apolari

(esano) e lo permette in metodiche HPLC a scambio ionico e fase inversa. Il campo di

applicazione di questi sistemi comprende matrici di alto interesse biochimico come

plasma ed urina. In questi casi la possibilità di ottenere un’alta sensibilità e selettività

è utile.

HPLC

In possiamo usare uno spettrometro di massa (MS) come rivelatore. I sistemi MS

vengono operati sotto alto vuoto; in HPLC la fase mobile presenta un flusso di circa 1

mL/min, che vaporizzata, sviluppa un volume incompatibile con i flussi di un MS,

questo inconveniente viene superato mediante un’interfaccia che elimina

selettivamente gran parte del solvente prima dell’ingresso del campione nell’MS.

attraverso il sistema HPLC-MS le molecole entrano nella camera di ionizzazione, in cui

avviene la frammentazione ionica dei soluti, separati prima dal sistema

cromatografico. Gli ioni, prima separati in base al rapporto m/z e poi rivelati da un

rivelatore che genera lo spettro di massa. Con il sistema MS viene prodotto un

tracciato cromatografico misurando la corrente ionica totale in funzione del tempo.

limiti

I dell’HPLC sono:

- Strumentazione costosa.

- Tempi di addestramento (6 – 12 mesi).

- Non sono disponibili rivelatori universali e sensibili.

- Materiali di consumo costosi.

- Le identificazioni richiedono conferma con metodi spettroscopici.

Allargamento di Banda in HPLC :

La capacità separativa di una colonna impaccata, viene definita come ‘’efficienza della

colonna’’. Tale fattore è direttamente connesso al grado di allargamento di banda nello

spazio e nel tempo. Questo processo è dipendente sia dalle caratteristiche intrinseche

della colonna sia dalle condizioni operative sperimentali. Depositando il campione in

testa alla colonna, esso occupa un certo spessore dello strato del materiale con cui la

colonna è impaccata, ossia avrà una determinata larghezza. Durante il processo

cromatografico, oltre ad una migrazione differenziale dei composti, si ha un

allargamento della banda iniziale del soluto. Questo allargamento è funzione del

tempo che il composto trascorre in colonna. Questo fenomeno è dovuto al fatto che le

molecole di uno stesso componente hanno diverse velocità. Si cerca di effettuare una

scelta ottimale dei parametri analitici, per operare nelle condizioni di massima

efficienza della colonna. Il numero dei piatti teorici (N) è un termine adimensionale

utilizzato per determinare l’efficienza. N = ( t /w ) 2

b b

.

W = ampiezza del p