Esercitazioni con Simulatore HPLC

ECONDA PARTE NALISI IN GRADIENTE

Obiettivo: Separazione ottimale di una miscela contente analiti con idrolipofilia differente tramite l’analisi in

gradiente.

Per questa seconda parte dell’esercitazione, si utilizza come miscela la Mix 5 – Salbutamol and impurities.

Come analiti in esame si ha il Salbutamolo con le sue quattro impurezze principali. Il Salbutamolo è un

broncodilatatore e, come ogni principio attivo, ha un profilo di impurezze che derivano dalla sintesi e dalla

instabilità della molecola.

Gli analiti in esame sono i seguenti:

Salbutamolo (in alto a sinistra) e le sue quattro impurezze principali: B, D, F, G

Queste molecole mostrano un grado di idrolipofilia molto differente tra loro, infatti le impurezze F e G sono

gli analiti più lipofili avendo due anelli aromatici nella loro struttura.

Per questo motivo, questa analisi cromatografica verrà effettuata in gradiente, cioè la composizione della

fase mobile varierà nel tempo, in modo tale che tutti gli analiti potranno essere eluiti con un tempo di

ritenzione accettabile.

Infatti, se si impostasse la modalità isocratica con una percentuale di acetonitrile del 5%, si può noterebbe

come le impurezze F e G eluirebbero con tempi di ritenzione molto alti (oltre ai 170 min).

Cromatogramma con 5% di acetonitrile in isocratica Chiara Esposti – N.M. 500743

Condizioni sperimentali impostate sul software di default:

- Modalità in gradiente

- Solvente A (solvente acquoso) = al minuto zero e al 5%

- Solvente B (acetonitrile) = al minuto 30 e al 50%

Con queste condizione cromatografiche già per impostate dal simulatore, si osserva che l’ordine di eluzione

degli analiti sarebbe: 

1. Salbutamolo essendo la molecola più idrofila



2. Impurezza B si ha un gruppo ossidrile OH in meno rispetto al Salbutamolo, di conseguenza la

molecola diventa meno idrofila



3. Impurezza D si ha l’OH ossidato a gruppo carbonilico C=O, quindi diminuisce l’idrofila



4. Impurezza G si ha nella struttura un anello aromatico in più, quindi aumenta la lipofilia



5. Impurezza F si ha, oltre all’anello aromatico in più, anche maggior catene alchiliche, rendendo

l’analita ancora più lipofilo

Cromatogramma in gradiente con t0 = 95% di A e 5% di B, con t30 = 50% di A e 50% di B

Sempre mettendo a confronto la modalità

isocratica con quella in gradiente, si può

notare che se si lavorasse in isocratica con

acetonitrile al 20%, si vedrebbero tutte le

molecole più idrofile (Salbutamolo e

impurezza B) arrivare insieme al solvente, e

quindi il loro tempo di ritenzione sarebbe

uguale al tempo morto t .

0

Cercare di ottimizzare la separazione in

gradiente, cioè ridurre il più possibile i Cromatogramma con 20% di acetonitrile in isocratica

tempi di ritenzione (tr < 10 min) e avere una

risoluzione maggiore del 1,5 (Rs > 1,5), andando a variare la fase mobile nel tempo:

I due parametri che si possono modificare per ottenere un ottimizzazione della separazione cromatografica

sono:

- Modificare le percentuali del solvente A e B

- Modificare il tempo che impiega la fase mobile per passare dal solvente A al solvente B

Cromatogrammi ottenuti impostando diversi tempi e concentrazioni: Chiara Esposti – N.M. 500743

Caso 1:

- Al tempo zero = 5% di solvente A e 95% di solvente B

- Al tempo 30 min = 10% di solvente A e 90% di solvente B

Si ha un caso limite in cui, in entrambi i tempi, si ha una percentuale quasi completa di acetonitrile (solvente

B)

Cromatogramma in gradiente con t0 = 5% di A e 95% di B, con t30 = 10% di A e 90% di B

Si può notare come tutti gli analiti eluiscono nello stesso momento. Questo perché, essendoci alte

percentuali di solvente organico, la fase stazionaria lipofila sarà più propensa a formare interazione con il

solvente lipofilo invece che con gli analiti. Essendoci concentrazioni così elevate di solvente, le interazioni che

si creano saranno esclusivamente solvente-fase stazionaria, di conseguenza nessun analita potrà creare

interazione con la colonna e quindi verranno eluiti tutti quanti insieme.

Caso 2:

- Al tempo zero = 99% di solvente A e 1% di solvente B

- Al tempo 30 min = 90% di solvente A e 10% di solvente B

Si ha un altro caso limite dove, però, si ha una percentuale quasi completa di solvente acquoso (solvente A)

Cromatogramma in gradiente con t0 = 99% di A e 1% di B, con t30 = 90% di A e 10% di B Chiara Esposti – N.M. 500743

In questo caso in cui si ha come solvente solo la fase acquosa, si può notare come gli ultimi due analiti più

lipofili non eluiscono dalla colonna (impurezza F e G).

Questo avvenimento è dovuto al fatto che questi due analiti lipofili creano delle forti interazioni con la fase

stazionaria lipofila e, non essendoci abbastanza solvente organico lipofilo, non potranno essere spiazzati

dall’acetonitrile. Di conseguenza rimarranno adesi alla fase stazionaria fino alla fine dell’analisi

cromatografica.

Invece, per quanto riguarda gli analiti più idrofili, si può osservare che a bassissime percentuali di solvente

organico, questi analiti vengono eluiti con un buon tempo di ritenzione tr e anche una buona risoluzione Rs,

perché saranno liberi di creare interazione con la fase stazionaria non essendoci l’acetonitrile che ne

impedisce ciò (come avveniva nel Caso 1).

Questa osservazione ci è utile per capire come possono essere costituite le percentuali dei solventi al tempo

zero.

Caso 3:

- Al tempo zero = 93% di solvente A e 7% di solvente B

- Al tempo 30 min = 30% di solvente A e 70% di solvente B

Cromatogramma in gradiente con t0 = 93% di A e 7% di B, con t30 = 30% di A e 70% di B

Tenendo in considerazione le deduzioni fatte con il cromatogramma del Caso 2, le percentuali dei solventi al

tempo zero le teniamo quasi invariate, cioè utilizziamo una percentuale bassa di solvente organico, in modo

tale da riuscire ad ottimizzare l’eluzione dei primi analiti più idrofili.

Invece, per far eluire gli analiti più lipofili, bisogna alzare le percentuali di solvente organico. Infatti, con una

percentuale di acetonitrile al 70%, si possono notare tempi di ritenzione favorevoli ma comunque oltre ai 10

minuti.

Per ridurre i tempi di ritenzione, si può andare a ridurre il tempo che impiega la fase mobile a passare dal

solvente A al solvente B, come riportato nel Caso 4 sottostante.

Caso 4:

- Al tempo zero = 93% di solvente A e 7% di solvente B

- Al tempo 15 min = 30% di solvente A e 70% di solvente B Chiara Esposti – N.M. 500743

Cromatogramma in gradiente con t0 = 93% di A e 7% di B, con t15 = 30% di A e 70% di B

Diminuendo il tempo che impiega la fase mobile a passare dal solvente A al solvente B e mantenendo le

stesse percentuali di solvente del Caso 3, si arriva alle condizioni ottimali richieste: tr ≈ 10 min e Rs > 1,5.

max

Si arriva alla conclusione che le condizioni sperimentali utilizzare in questo ultimo caso siano le migliori per

ottenere una buona risoluzione in tempi contenuti. Chiara Esposti – N.M. 500743

ESERCITAZIONE 3 – 27/11/24

P P : L R L Q

RIMA ARTE IMITE DI ILEVABILITÀ E IMITE DI UANTIFICAZIONE

Obiettivo: Stabilire le concentrazioni che corrispondono al limite di rilevabilità LOD e il limite di

quantificazione LOQ, espresse in unità molare mmM, nelle condizioni sperimentali ottimali

precedentemente ricavate nella scorsa esperienza.

Teoria su cui si fonda l’esercitazione svolta:

In questa esercitazione si sceglie di analizzare una miscela che contiene al suo interno delle impurezze.

Le impurezze, di norma, si trovano in concentrazioni molto basse nel campione. Quindi, per

quantificare queste basse percentuali di impurezze, servono dei metodi molto sensibili.

La sensibilità di uno strumento indica quanto esso è sensibile alla variazione di piccole quantità di

analita. Perciò, più è sensibile il nostro strumento e più si riesce a misurare anche piccole quantità di

analita, che nel nostro caso sono le impurezze.

Lo strumento è caratterizzato dalla presenza di due limiti:



● Limite di rilevabilità (limit of detection LOD) è la concentrazione di analita che produce un

segnale significativamente diverso da quello del bianco, e quindi si capisce solo che l’analita

c’è e che non si sta misurando il bianco 

● Limite di quantificazione (limit of quantitation LOQ) è la concentrazione di analita oltre la

quale è possibile effettuare una misura quantitativa, e quindi si capisce di star misurando e

quantificando il campione 

Maggiore è sensibile lo strumento Più questi limiti saranno piccoli e ciò sta a significare che

potranno essere rilevate e quantificate anche piccole concentrazione di analita.

Di conseguenza: 

● Se si misura un segnale che è sotto al LOD l’analita non c’è



● Se si misura un segnale è dentro all’intervallo l’analita c’è ma non è quantificabile



● Se si misura un segnale sotto al LOQ l’analita c’è ed è quantificabile

Nello strumento, tramite l’iniettore (injector) si può decidere quale è la concentrazione della miscela

da iniettare in colonna. Questa concentrazione può essere diminuita fino ad arrivare al limite di

quantificazione e poi al limite di rilevabilità. Minore sono queste concentrazioni e maggiore è la

sensibilità del nostro strumento.

Questi due limiti vengono calcolati come il rapporto tra il segnale registrato (S) e il rumore di fondo

dello strumento (N). Questo rapporto S/N lo troviamo per ciascun analita ed è il rapporto tra l’altezza

del picco e il noise.

Il noise è il rumore di fondo e corrisponde all’altezza della linea di base. Salbutamolo (in alto a sinistra) e le sue quattro impurezze principali: B, D, F, G

Condizioni sperimentali impostate sul software:

- Si sceglie la miscela Mix 5 - Salbutamol and impurities, cioè la

miscela di Salbutamolo con le sue rispettive impurezze Chiara Esposti – N.M. 500743

- Si lavora in gradiente

- Il pH della soluzione acquosa è di 7

- Le concentrazioni dei solventi sono le stesse utilizzate nelle Esercitazione N°2 e corrispondono

alle condizioni ottimali per avere una buona separazione di ogni analita in tempi contenuti

(con t = 93% di A (acquoso) e 7% di B (organico), con t = 30% di A e 70% di B)

0 15

- La concentrazione che si sta iniettando di default è 0,100 mg/ml. Questa concentrazione

corrisponde anche a 100 μm/ml oppure a 100 ppm

- Come LOD si stabilisce che il S/N è uguale a 3

- Come LOQ si stabilisce che il S/N è uguale a 10

- Lunghezza d’onda preimpostata