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Spettroscopia - HPLC seconda parte

Appunti di Spettroscopia del professor Neri su HPLC parte seconda con analisi dei seguenti argomenti: impaccamento delle colonne, impaccamenti normali ed in fase inversa, materiali per l'impaccamento delle colonne e fattori determinanti l'efficienza di separazione, silice modificata chimicamente, scelta della fase... Vedi di più

Esame di Spettroscopia docente Prof. G. Neri

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CH

CH 3

3

+ Si O Si R

Si OH Cl Si R CH

CH 3

3

dove R è generalmente una catena ramificata di un gruppo da otto a

diciotto atomi di carbonio. Altri gruppi funzionali legati alla superficie

delle particelle di silice possono essere ammine alifatiche, eteri, nitrili e

gruppi aromatici. Da questo si deduce che si possono ottenere fasi

3

stazionarie con diverse caratteristiche di polarità.

Il gel di silice è il materiale adsorbente più utilizzato in

cromatografia liquida. Le nuove silici modificate per fase inversa (RP,

Reversed Phase) sono caratterizzate da una diversa tecnologia di legame

della fase inversa tesa ad ottenere una ricopertura ad alta densità e

distribuita in maniera più uniforme.

Figura 8. Fasi stazionarie di silice al microscopio elettronico.

E’ possibile ottenere rivestimenti altamente uniformi solo

utilizzando un supporto siliceo con superficie regolare, pori uniformi

(diametro, volume, forma) e distribuzione omogenea della porosità. In RP

si parla di nuova generazione di silice riferendosi sia all’utilizzo di silice

ultra-pura con parametri geometrici (diametro delle particelle e dei pori)

monodispersi, sia a una nuova tecnologia di legame della fase idrofobica.

La silice è costituita come noto da atomi di silicio legati

tridimensionalmente con atomi di ossigeno, la catena è saturata con

gruppi -OH (silanoli) alle estremità. In HPLC la silice può essere

impiegata sia in forma diretta che in forma legata (RP, Reversed Phase).

Le proprietà fisiche del materiale possono essere fortemente modificate

durante la sintesi delle particelle, la cui forma può risultare irregolare o

sferica. La produzione della silice irregolare prevede:

1. L’idrolisi completa del materiale di partenza che può essere sodio

silicato, tetralcossisilano o tetraclorosilano

2. Uno stadio di condensazione per formare acido polisilicico

3. Disidratazione

Il prodotto viene poi macinato finemente e suddiviso per

granulometria con metodi gravimetrici, di sedimentazione o per

separazione con aria.

Per la silice sferica la fase di condensazione differisce da quella

precedente in quanto la polimerizzazione avviene in una soluzione

etanolo/acqua/ammoniaca la cui composizione soprattutto per quanto

riguarda il rapporto acqua/silano viene attentamente regolata allo scopo di

controllare la crescita delle sfere attorno alle particelle primarie.

Aggiungendo opportuni additivi si possono conferire alle particelle

solide diverse caratteristiche fisiche le quali daranno luogo a diversi

comportamenti cromatografìci (selettività) in HPLC.

Le caratteristiche principali sono:

1. Forma: sferica o irregolare. Le fasi sferiche danno una maggiore

efficienza (piatto teorico più basso di circa il 10-20%) e una migliore

riproducibilità di impaccamento.

2. Dimensione delle particelle. La silice irregolare, in quanto non

caratterizzata da una sola dimensione, ha una granulometria

µm.

puramente nominale che arriva come minimo a 10 La silice

µm.

sferica viene prodotta in granulometrie fino a 3 La più diffusa

µm.

per scopi analitici è 5 Scendendo con la granulometria aumenta

la contropressione della colonna.

3. Dimensione dei pori. Varia da 60 a 150 Angstrong per scopi analitici

tradizionali; da 300 a 500 Angstrong per analisi di peptidi e proteine

piccole e da 1000 a 5000 Anstrong per macromolecole.

2

4. Area superficiale. Espressa in m /g, questa risulta essere

1

direttamente proporzionale a k e alla capacità di carico ed

inversamente proporzionale alla dimensione dei pori. Le silici

2

irregolari hanno tipicamente valori molto elevati (400-500 m /g).

5. Distribuzione e volume dei pori. Una distribuzione uniforme dei pori

è essenziale per avere picchi cromatografici simmetrici, perciò la

curva di distribuzione dovrebbe essere la più stretta possibile. La

lunghezza dei pori influisce sul meccanismo di separazione degli

analiti in quanto nelle silici microporose la velocità di ingresso e

uscita dai pori, anche in rapporto alla velocità di flusso e alla

viscosità della fase mobile, dà un contributo importante

all’allargamento dei picchi. I pori dovrebbero essere corti e numerosi

mentre dovrebbero essere il più possibile assenti le comunicazioni

tra singoli pori. Inoltre, a seconda del metodo di produzione, diversi

tipi di silice avranno caratteristiche chimiche superficiali diverse in

4

termini di comportamento acido/basico.

Si può dedurre che le diversità esistenti tra silici sferiche anche della

stessa granulometria e dimensione dei pori possono essere talmente

elevate da impedire qualsiasi tipo di comparazione.

Nonostante le innumerevoli complicazioni e difficoltà in fase di

produzione, la silice è il materiale più utilizzato e studiato come

adsorbente per HPLC e ciò, soprattutto, grazie alla straordinaria reattività

chimica della sua superficie.

S

ILICE MODIFICATA CHIMICAMENTE

La reattività conferita dai gruppi Si-OH superficiali rappresenta

insieme un limite e un vantaggio. Da un lato i gruppi silanolici, sia in fase

diretta che in fase inversa, interagiscono con analiti nei quali sono

presenti gruppi basici e/o polari per dare fenomeni di scodamento dei

picchi o decomposizione degli analiti. Dall’altro permettono di

modificare la superficie ottenuta tramite il legame di diversi gruppi

funzionali.

I gruppi funzionali possono essere diversi a seconda del meccanismo

di in-terazione più idoneo per separare gli analiti (Reversed Phase o RP,

5

Scambio Ionico debole o forte, Affinity, ecc.).


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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti di Spettroscopia del professor Neri su HPLC parte seconda con analisi dei seguenti argomenti: impaccamento delle colonne, impaccamenti normali ed in fase inversa, materiali per l'impaccamento delle colonne e fattori determinanti l'efficienza di separazione, silice modificata chimicamente, scelta della fase mobile e stazionaria.


DETTAGLI
Esame: Spettroscopia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher valeria0186 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Spettroscopia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Neri Giovanni.

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