Spettroscopia - HPLC seconda parte

Impaccamento delle colonne

In HPLC si utilizzano riempimenti con granulometria decisamente più fine rispetto a quella usata in cromatografia classica. Ciò consente di migliorare le prestazioni ed in particolare di incidere sull'efficienza della separazione, poiché la diminuzione del diametro medio delle particelle comporta anche un più alto numero di piatti teorici. Figura 6. Colonne per HPLC. Due sono i tipi di impaccamenti usati in cromatografia liquido-liquido: 1. Riempimento con particelle di tipo pellicolare, in cui le particelle sono costituite di un nucleo non poroso di forma sferica (solitamente vetro) rivestito da un sottile strato di materiale microporoso, avente uno spessore di 1-3 µm. Il diametro medio dell'intera particella risulta di 40-50 µm. Le colonne impiegate hanno una lunghezza di 50-100 cm. 2. Riempimento con particelle microporose, dove le particelle hanno forma irregolare o sferica ed hanno diverse porosità; sono

disponibiliµmcon diametri medi che vanno da 3 a 10 ed oltre. Si utilizzano ingenere con colonne tanto più corte tanto più fine è la lorogranulometria: ad esempio colonne da 10-25 cm con particelle di 10µm, µm. 1fino a 3-4 cm per le fasi da 3Le microparticelle rappresentano, rispetto alle fasi pellicolari, unsensibile passo avanti dal punto di vista della efficienza. Inoltre lemicroparticelle hanno una capacità più elevata, per cui sono adatte (alcontrario delle pellicolari) anche all’analisi preparativa; viceversa, dalpunto di vista pratico sono molto più difficili da impaccare ed hannotendenza al rigonfiamento.

Figura 7. Fasi stazionarie per HPLC.

IMPACCAMENTI NORMALI ED IN FASE INVERSA

Le cromatografie di ripartizione si distinguono anche in base allarelazione che esiste fra le polarità della fase mobile e della fasestazionaria.

I primi lavori fatti sulla cromatografia liquida furono portati avantisu fasi

stazionarie altamente polari come glicol trietilenico o acqua; la fase mobile era costituita da un solvente relativamente poco polare come l'esano o l'etere isopropilico. Per ragioni storiche questo tipo di cromatografia è detta cromatografia in fase normale. Nella cromatografia in fase inversa la fase stazionaria è apolare e la fase mobile è un solvente polare. Nella cromatografia a fase normale il componente meno polare della miscela da separare è eluito per primo ed aumentando la polarità della fase mobile diminuisce il tempo di eluizione. Al contrario nella cromatografia in fase inversa il componente più polare è quello che viene eluito per primo ed un aumento della polarità della fase mobile fa aumentare il tempo di ritenzione. E' stato stimato che più di tre quarti di tutte le separazioni eseguite in HPLC siano portate avanti su colonne in fase inversa, impaccate con octil- o octadecil- silossani. Durante taliseparazioni i gruppi, costituiti da idrocarburi a lunga catena, sono allineati paralleli gli uni agli altri e perpendicolari alla superficie delle particelle della fase stazionaria e conferiscono l'aspetto delle setole di un pennello alla superficie di tali particelle. Le fasi mobili più usate in questo tipo di separazioni sono soluzioni acquose contenenti solventi come metanolo, acetonitrile o tetraidrofurano in varie concentrazioni. MATERIALI PER L'IMPACCAMENTO DELLE COLONNE E': FATTORI DETERMINANTI L'EFFICIENZA DI SEPARAZIONE I materiali per impaccare questo tipo di colonne sono preparati per reazione di un organoclorosilano con i gruppi -OH formati sulla superficie di particelle di silice per idrolisi a caldo in acido cloridrico diluito. Il prodotto ottenuto è un organoclorosilano. Se si considera la reazione fra un gruppo SiOH presente sulla superficie di una particella di silice, si può scrivere: CHCH3 + Si O Si RSi OH Cl Si R CHCH3 dove R

è generalmente una catena ramificata di un gruppo da otto adiciotto atomi di carbonio. Altri gruppi funzionali legati alla superficie delle particelle di silice possono essere ammine alifatiche, eteri, nitrili e gruppi aromatici. Da questo si deduce che si possono ottenere fasi stazionarie con diverse caratteristiche di polarità.

Il gel di silice è il materiale adsorbente più utilizzato in cromatografia liquida. Le nuove silici modificate per fase inversa (RP, Reversed Phase) sono caratterizzate da una diversa tecnologia di legame della fase inversa tesa ad ottenere una ricopertura ad alta densità e distribuita in maniera più uniforme.

Figura 8. Fasi stazionarie di silice al microscopio elettronico.

E’ possibile ottenere rivestimenti altamente uniformi solo utilizzando un supporto siliceo con superficie regolare, pori uniformi (diametro, volume, forma) e distribuzione omogenea della porosità. In RP si parla di nuova generazione di silice.

riferendosi sia all'utilizzo di siliceultra-pura con parametri geometrici (diametro delle particelle e dei pori)monodispersi, sia a una nuova tecnologia di legame della fase idrofobica. La silice è costituita come noto da atomi di silicio legatitridimensionalmente con atomi di ossigeno, la catena è saturata congruppi -OH (silanoli) alle estremità. In HPLC la silice può essereimpiegata sia in forma diretta che in forma legata (RP, Reversed Phase).Le proprietà fisiche del materiale possono essere fortemente modificatedurante la sintesi delle particelle, la cui forma può risultare irregolare osferica. La produzione della silice irregolare prevede:

1. L'idrolisi completa del materiale di partenza che può essere sodiosilicato, tetralcossisilano o tetraclorosilano
2. Uno stadio di condensazione per formare acido polisilicico
3. Disidratazione

Il prodotto viene poi macinato finemente e suddiviso pergranulometria con metodi gravimetrici.

di sedimentazione o separazione con aria. Per la silice sferica la fase di condensazione differisce da quella precedente in quanto la polimerizzazione avviene in una soluzione etanolo/acqua/ammoniaca la cui composizione soprattutto per quanto riguarda il rapporto acqua/silano viene attentamente regolata allo scopo di controllare la crescita delle sfere attorno alle particelle primarie. Aggiungendo opportuni additivi si possono conferire alle particelle solide diverse caratteristiche fisiche le quali daranno luogo a diversi comportamenti cromatografici (selettività) in HPLC.

Le caratteristiche principali sono:

1. Forma: sferica o irregolare. Le fasi sferiche danno una maggiore efficienza (piatto teorico più basso di circa il 10-20%) e una migliore riproducibilità di impaccamento.
2. Dimensione delle particelle. La silice irregolare, in quanto non caratterizzata da una sola dimensione, ha una granulometria puramente nominale che arriva come minimo a 10 µm.

siliceµm.sferica viene prodotta in granulometrie fino a 3. La più diffusaµm.per scopi analitici è 5. Scendendo con la granulometria aumentala contropressione della colonna.3. Dimensione dei pori. Varia da 60 a 150 Angstrong per scopi analiticitradizionali; da 300 a 500 Angstrong per analisi di peptidi e proteinepiccole e da 1000 a 5000 Anstrong per macromolecole.24. Area superficiale. Espressa in m /g, questa risulta essere1direttamente proporzionale a k e alla capacità di carico edinversamente proporzionale alla dimensione dei pori. Le silici2irregolari hanno tipicamente valori molto elevati (400-500 m /g).5. Distribuzione e volume dei pori. Una distribuzione uniforme dei poriè essenziale per avere picchi cromatografici simmetrici, perciò lacurva di distribuzione dovrebbe essere la più stretta possibile. Lalunghezza dei pori influisce sul meccanismo di separazione deglianaliti in quanto nelle silici microporose la velocità dipressione del fluido. I pori sono piccoli canali presenti nella pelle che consentono il passaggio di sostanze come il sudore e il sebo. L'ingresso e l'uscita dai pori dipendono da diversi fattori, tra cui la velocità di flusso del fluido e la pressione esercitata su di esso. La velocità di flusso del fluido può influenzare l'ingresso e l'uscita dai pori. Se il flusso è lento, le sostanze possono accumularsi nei pori e causare ostruzioni. Al contrario, se il flusso è veloce, le sostanze possono essere espulse rapidamente dai pori. La pressione del fluido è un altro fattore che può influenzare l'ingresso e l'uscita dai pori. Una pressione elevata può favorire l'espulsione delle sostanze dai pori, mentre una pressione bassa può ostacolare il passaggio delle sostanze attraverso i pori. In conclusione, l'ingresso e l'uscita dai pori dipendono dalla velocità di flusso e dalla pressione del fluido. È importante mantenere un equilibrio tra questi fattori per garantire una corretta funzione dei pori e una pelle sana.