Spettroscopia - HPLC seconda parte

Impaccamento delle colonne

In HPLC si utilizzano riempimenti con granulometria decisamente più fine rispetto a quella usata in cromatografia classica. Ciò consente di migliorare le prestazioni ed in particolare di incidere sull’efficienza della separazione, poiché la diminuzione del diametro medio delle particelle comporta anche un più alto numero di piatti teorici.

Tipi di impaccamento

Due sono i tipi di impaccamenti usati in cromatografia liquido-liquido:

• Riempimento con particelle di tipo pellicolare, in cui le particelle sono costituite di un nucleo non poroso di forma sferica (solitamente vetro) rivestito da un sottile strato di materiale microporoso, avente uno spessore di 1-3 μm, il diametro medio dell’intera particella risulta di 40-50 μm. Le colonne impiegate hanno una lunghezza di 50-100 cm.
• Riempimento con particelle microporose, dove le particelle hanno forma irregolare o sferica ed hanno diverse porosità; sono disponibili con diametri medi che vanno da 3 a 10 μm ed oltre. Si utilizzano in genere con colonne tanto più corte quanto più fine è la loro granulometria: ad esempio, colonne da 10-25 cm con particelle di 10 μm, fino a 3-4 cm per le fasi da 3 μm.

Le microparticelle rappresentano, rispetto alle fasi pellicolari, un sensibile passo avanti dal punto di vista dell'efficienza. Inoltre le microparticelle hanno una capacità più elevata, per cui sono adatte (al contrario delle pellicolari) anche all’analisi preparativa; viceversa, dal punto di vista pratico sono molto più difficili da impaccare ed hanno tendenza al rigonfiamento.

Impaccamenti normali ed in fase inversa

Le cromatografie di ripartizione si distinguono anche in base alla relazione che esiste fra le polarità della fase mobile e della fase stazionaria. I primi lavori fatti sulla cromatografia liquida furono portati avanti su fasi stazionarie altamente polari come glicol trietilenico o acqua; la fase mobile era costituita da un solvente relativamente poco polare come l’esano o l’etere isopropilico. Per ragioni storiche questo tipo di cromatografia è detta cromatografia in fase normale. Nella cromatografia in fase inversa la fase stazionaria è apolare e la fase mobile è un solvente polare.

Nella cromatografia a fase normale il componente meno polare della miscela da separare è eluito per primo e aumentando la polarità della fase mobile diminuisce il tempo di eluizione. Al contrario, nella cromatografia in fase inversa il componente più polare è quello che viene eluito per primo ed un aumento della polarità della fase mobile fa aumentare il tempo di ritenzione.

È stato stimato che più di tre quarti di tutte le separazioni eseguite in HPLC siano portate avanti su colonne in fase inversa, impaccate con octil- o octadecil- silossani. Durante tali separazioni i gruppi, costituiti da idrocarburi a lunga catena, sono allineati paralleli gli uni agli altri e perpendicolari alla superficie delle particelle della fase stazionaria e conferiscono l’aspetto delle setole di un pennello alla superficie di tali particelle.