Spettroscopia - HPLC prima parte

Cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC)

Descrizione generale dello strumento

L'HPLC (High Performance Liquid Chromatography) è uno strumento analitico derivato dalla cromatografia classica e si basa sugli stessi principi. Nella cromatografia classica il componente principale è la colonna che contiene la fase stazionaria all'interno della quale scorre la fase mobile rappresentata dall'eluente. Il passaggio dell'eluente avviene tramite la spinta esercitata dalla colonna di liquido costituente la fase mobile e quindi il processo, se la fase stazionaria non è abbastanza porosa, può essere anche molto lento.

La separazione dei componenti avviene tramite interazioni che si creano fra i costituenti della miscela e le due fasi. Le interazioni possono essere di tipo elettrostatico, dipolo-dipolo, forze di Van Der Waals oppure tramite un meccanismo di scambio ionico. Questo dipende dalle proprietà sia delle due fasi sia della miscela da separare.

Nell'HPLC la forza che permette all'eluente di scorrere nella colonna, è rappresentata dalla pressione che è applicata da una pompa in testa alla colonna e forza la fase mobile a scorrere all'interno della fase stazionaria. Questo permette non solo di rendere il processo più rapido ma permette anche di ottenere un maggior numero di piatti teorici il che vuol dire una migliore risoluzione.

Generalità sull'HPLC

Le prime cromatografie liquide sono state eseguite in colonne di vetro che avevano un diametro interno dai 10 a 50 mm. Le colonne erano impaccate con 50-500 cm di particelle solide rivestite con un liquido adsorbente che formava la fase stazionaria. Per aumentare in modo notevole la velocità di flusso di questo tipo di fase stazionaria, la grandezza della particella del solido era di 150-200 µm. Comunque nella migliore delle ipotesi il flusso massimo non superava i 10 ml il minuto.

Tentativi portati avanti per aumentare la velocità di flusso, come l'applicazione di pompe a vuoto o di alte pressioni in testa alla colonna, modificando la cromatografia classica, non portarono a risultati perché insieme all'aumento del flusso si otteneva un aumento della larghezza del piatto teorico.

Il piatto teorico di una colonna cromatografia corrisponde a quel tratto di colonna nel quale una specie chimica si trova in equilibrio fra le due fasi (stazionaria e mobile) prima che l'eludente la trascini ad uno stadio successivo. Il numero di piatti teorici (N) caratteristici di una colonna è dato dalla relazione:

N = 16 (T² / W²)

Dove W è l'ampiezza del picco e T è il tempo di ritenzione, in altre parole il tempo che intercorre fra il momento dell'iniezione e la cresta del picco.

Se si usa, nell'equazione precedente, al posto di T il tempo di ritenzione corretto (ovvero il tempo di ritenzione relativo fra il picco in analisi e il picco di una sostanza non trattenuta, che quindi esce subito dalla colonna), che chiameremo T_r1, otteniamo l'equazione che esprime il numero di piatti N_eff.

N_eff = 16 (T_r1² / W²)

Di significato analogo a N è anche l'altezza equivalente del piatto teorico HEPT (abbreviato con H) che si esprime come riportato nell'equazione seguente.

H = L / N_eff

L'esperienza dimostra che l'efficienza di una colonna è direttamente collegata al numero di piatti teorici. Con l'aumentare di questi ultimi i diversi componenti di una miscela escono dalla colonna in bande più compatte.

Per migliorare l'efficienza di una colonna, bisogna quindi fare in modo che il numero di piatti N sia più grande possibile. Ciò può essere conseguito o aumentando la lunghezza della colonna od ottimizzando tutti quei parametri che determinano il valore di N (e quindi anche di H), primo fra tutti la velocità lineare (in mm/sec) della fase mobile. Quest'ultimo parametro può anche essere espresso in termini di flusso (ml/min).