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Spettroscopia - HPLC prima parte

Appunti di Spettroscopia del professor Neri su HPLC parte prima con analisi dei seguenti argomenti: cromatografia liquida ad alta pressione, descrizione dello strumento, generalità sull'hplc, gli strumenti, i contenitori per la fase mobile e i moderni sistemi di trattamento dei solventi, i sistemi di pompaggio. Vedi di più

Esame di Spettroscopia docente Prof. G. Neri

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L’eluizione in gradiente generalmente aumenta l’efficienza della

separazione, così come la variazione della temperatura influisce sulla gas

cromatografia.

Le apparecchiature più moderne sono spesso equipaggiate con

valvole proporzionali, che introducono i liquidi in colonna con rapporti

che variano in maniera continua.

I SISTEMI DI POMPAGGIO

Le caratteristiche cui devono soddisfare le pompe impiegate per

l’HPLC sono molto restrittive e includono: 2

Generazione di pressioni maggiori di 6000 psi (lb/in )

o Non generare un pressione pulsatile in uscita

o Velocità di flusso variabili in un range di 0.1-10 ml/min

o La riproducibilità del flusso non deve variare più dello 0.5%

o Resistenza alla corrosione verso una grande varietà di solventi

o Sono impiegati due tipi di pompe meccaniche: una del tipo a siringa

guidata a vite oppure una pompa alternativa (o a pistone), mostrata in

.

Figura 3

La prima produce un flusso senza pulsazione e la velocità del flusso

è facilmente controllabile; ha però lo svantaggio di un alto volume di

riempimento, che diventa un problema quando devono essere sostituiti i

solventi. Figura 3. Pompa alternativa per HPLC.

Le pompe a pistone sono quelle più comunemente usate e sono

costituite da una piccola camera cilindrica che è riempita e vuotata dal

movimento di un pistone. Il pompaggio produce un flusso pulsatile che

deve essere successivamente linearizzato. I vantaggi delle pompe a

pistone sono un piccolo volume interno, la capacità di generare alte

pressioni in uscita (superiori a 10000 psi), rapida adattabilità al

cambiamento dei gradienti nel corso dell’analisi, flusso costante e inoltre

sono molto poco sensibili alla viscosità del solvente e alla pressione in

testa alla colonna.

Alcuni strumenti sono equipaggiati con una pompa pneumatica, che

nella sua forma più semplice consiste in un contenitore di solvente

collassabile su se stesso contenuto in un recipiente che può essere

riempito di gas compresso. Il gas spinge le pareti del contenitore

collassabile che spreme il solvente in colonna. Le pompe di questo tipo

sono semplici, poco costose e danno un flusso costante e lineare, hanno

però come inconveniente che la velocità del flusso è molto influenzata

dalla viscosità della fase mobile. Inoltre non sono adatte ad analisi in

gradiente.

Si deve notare che le alte pressioni generate dalle pompe per la

cromatografia in fase liquida, non sono a rischio di esplosione, poiché i

liquidi non sono molto comprimibili. Quindi la rottura di un componente

può solo provocare una perdita di solvente e soltanto se esso è

5

infiammabile ci può essere l’eventuale pericolo di incendi.

S

ISTEMA DI INIEZIONE DEL CAMPIONE

Sebbene nella cromatografia in fase liquida sia spesso usata

l’iniezione tramite siringa attraverso un setto costituito di materiale

elastomero, questa procedura non è molto riproducibile e si può usare

solo a pressioni di lavoro inferiori a 1500 psi.

Nella iniezione stop-flow il flusso del solvente viene bloccato per

permettere l’asportazione di una piccola quantità di solvente in testa alla

colonna e il caricamento del campione, sempre in testa, tramite una

siringa.

Comunque il metodo di caricamento più usato in HPLC è quello che

. Questi dispositivi sono

usa il sampling loop, come mostrato in Figura 4 µ

l.

equipaggiati di loop intercambiabili di capacità variabile dai 5 ai 500

La caratteristica principale del sistema di iniezione tramite loop è l’alta

riproducibilità dei volumi iniettati.

Figura 4. Sistemi di iniezione per HPLC.

C HPLC

OLONNE PER

Le colonne per HPLC sono di solito costruite in acciaio, ma esistono

anche in vetro ricoperto di metallo impiegate soprattutto quando si lavora

a pressioni inferiori a 600 psi. La lunghezza delle colonne varia da 10 a

30 cm e il diametro interno da 4 a 10 mm. Le colonne sono generalmente

µ

m. Colonne di

impaccate con particelle di diametro variabile dai 5 ai 10

questo tipo arrivano generalmente a contenere dai 40000 ai 60000 piatti

per metro di lunghezza.

Recentemente sono state introdotte sul mercato microcolonne lunghe

dai 3 ai 6.5 cm e aventi un diametro interno variabile da 1 a 4.6 mm.

Queste colonne che sono impaccate con particelle di diametro variabile

µ

m, contengono più di 100000 piatti per metro e hanno il

dai 3 ai 5

vantaggio di una maggiore velocità operativa e di un minore consumo di

solvente. Quest’ultima proprietà è di notevole importanza perché i

solventi ad alta purezza richiesti per questo tipo di cromatografia sono

molto costosi. Con questo tipo di colonne vi sono esempi di separazione

di 8 composti in un tempo di 15 secondi con una colonna lunga 4 cm con

µ

m di

un diametro interno di 4 mm e impaccata con particelle di 3

diametro.

Il più comune materiale usato per impaccare le colonne per HPLC è

la silice, preparata per agglomerazione di particelle di diametro inferiore

al micron sotto condizioni che portano a particelle più grandi con

diametri altamente uniformi. Le particelle risultanti sono spesso rivestite

con sottili film di composti organici, che sono legati alla superficie

tramite legami chimici o fisici.

Altri materiali usati per impaccare le colonne sono le particelle di

albumina, di polimeri microporosi e resine a scambio ionico.

C OLONNE DI GUARDIA

Spesso, per aumentare la vita di una colonna analitica, in testa ad

essa è applicata una colonna di guardia che rimuove dai solventi

particelle indisciolte e contaminanti. Inoltre nella cromatografia liquido-

liquido, la colonna di guardia serve a saturare la fase mobile con la fase

stazionaria così che sia minimizzata la perdita di fase stazionaria dalla

colonna analitica. La composizione di una colonna di guardia dovrebbe

essere simile a quella della colonna analitica; la grandezza delle particelle

è comunque maggiore per minimizzare la caduta di pressione agli

estremi. T

ERMOSTATO DELLA COLONNA

Per molte applicazioni non è necessario il controllo preciso della

temperatura e le colonne vengono fatte operare a temperatura ambiente.

Spesso comunque i migliori cromatogrammi si ottengono mantenendo la

temperatura della colonna costante e vicina alla temperatura ambiente. I

moderni strumenti sono equipaggiati con riscaldatori di colonne che

possono mantenere una temperatura in un range variabile da qualche

decina di gradi a 150°C.


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Moses

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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti di Spettroscopia del professor Neri su HPLC parte prima con analisi dei seguenti argomenti: cromatografia liquida ad alta pressione, descrizione dello strumento, generalità sull'hplc, gli strumenti, i contenitori per la fase mobile e i moderni sistemi di trattamento dei solventi, i sistemi di pompaggio.


DETTAGLI
Esame: Spettroscopia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Moses di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Spettroscopia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Neri Giovanni.

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