Spettroscopia - HPLC prima parte

L'efficienza di una colonna e il numero di piatti teorici

L'esperienza dimostra che l'efficienza di una colonna è direttamente collegata al numero di piatti teorici. Con l'aumentare di questi ultimi i diversi componenti di una miscela escono dalla colonna in bande più compatte.

Per migliorare l'efficienza di una colonna, bisogna quindi fare in modo che il numero di piatti N sia il più grande possibile. Ciò può essere conseguito o aumentando la lunghezza della colonna o ottimizzando tutti quei parametri che determinano il valore di N (e quindi anche di H), primo fra tutti la velocità lineare (in mm/sec) della fase mobile.

Quest'ultimo parametro può anche essere espresso in termini di flusso (ml/min).

I primi sviluppi positivi nella cromatografia liquida furono fatti dopo che si ipotizzò e si constatò che la diminuzione dello spessore del piatto teorico si poteva ottenere impaccando la colonna con particelle di diametro più piccolo.

Solo alla fine degli anni...

’60 è stata sviluppata una tecnologia adattaµm peralla fabbricazione di particelle di grandezza variabile dai 5 ai 10impaccare le colonne. Il nome di High Performance LiquidChromatography (HPLC) serve quindi a distinguere questa nuovatecnologia cromatografica dalla cromatografia classica, ormai usata quasi2esclusivamente per scopi preparativi.

La mostra i cinque tipi di HPLC più usati che comprendono:

1. Cromatografia di ripartizione o cromatografia liquido-liquido
2. Cromatografia di adsorbimento o cromatografia solido-liquido
3. Cromatografia a scambio ionico
4. Cromatografia di permeazione gel
5. Cromatografia di gel-filtrazione

Figura 1. Applicazione dei 5 tipi di HPLC più usati, in base al pesomolecolare e alla polarità dei composti da separare

Dalla figura si può comprendere che a volte i vari tipi dicromatografia liquida tendono ad essere complementari. Per esempio, peranaliti che hanno peso molecolare più grande di 10000

sono spesso usati due tipi di cromatografia di esclusione: la permeazione nel gel per specie non polari e la gel filtrazione per composti polari o ionici. Per specie ioniche che hanno peso molecolare più basso, il metodo di scelta è generalmente la cromatografia a scambio ionico. Specie piccole, polari ma non ioniche sono trattate con la cromatografia di ripartizione. Per la sua versatilità e ampia applicabilità l'HPLC è attualmente una delle tecniche di separazione più ampiamente usate a scopi qualitativi e quantitativi. STRUMENTI Nella moderna cromatografia liquida, sono richieste pressioni di pompaggio di diverse centinaia di atmosfere, per raggiungere velocità di flusso sufficienti a permettere una buona separazione in colonne di micrometri. Come impaccate con particelle di diametro variabile dai 3 ai 10 micrometri. Di conseguenza, l'equipaggiamento di una moderna apparecchiatura per HPLC è notevolmente più costoso rispetto a quello della cromatografia convenzionale.

cromatografiamostra i più importanti componenti di un tipicoclassica. La Figura 2strumento per HPLC.

I CONTENITORI PER LA FASE MOBILE E I MODERNI SISTEMI DI.TRATTAMENTO DEI SOLVENTI

Un moderno apparato per HPLC è equipaggiato con uno o piùcontenitori in vetro o acciaio, generalmente bottiglie, contenenti 500 ml opiù di solvente.

In genere sono presenti dei dispositivi per degassare i solventi e lesoluzioni eluenti ed eliminare eventuali particelle indisciolte. Lapreparazione della soluzione e la sostituzione di un contenitore disolvente, producono bolle e scorie, che se entrassero in colonnapotrebbero causare uno slargamento delle bande; inoltre si avrebbe ancheuna compromissione dell’efficienza del sistema di pompaggio.

La macchina è quindi provvista di un sistema di degassaggio che puòconsistere in una pompa a vuoto, un sistema di distillazione, un sistemaper il riscaldamento e

L'agitazione della soluzione o, come mostrato in Figura 2, un sistema di degassaggio tramite gas inerte, in cui un gas non solubile nel solvente da degassare (generalmente elio), viene fatto gorgogliare in piccole bolle all'interno del contenitore per portare via i gas disciolti.

Un'eluizione con un singolo solvente di composizione costante viene detta isocratica.

Nella eluizione tramite gradiente invece, due o più solventi di differenti polarità, vengono mescolati in proporzioni prestabilite. Il rapporto fra i due solventi viene fatto variare durante l'eluizione, a volte in modo continuo, a volte attraverso una serie di steps, durante i quali la percentuale dei solventi rimane costante per un certo periodo di tempo, per poi cambiare nuovamente.

L'eluizione in gradiente generalmente aumenta l'efficienza della separazione, così come la variazione della temperatura influisce sulla gas cromatografia.

Le apparecchiature più moderne sono

spesso equipaggiate con valvole proporzionali, che introducono i liquidi in colonna con rapporti che variano in maniera continua.

I SISTEMI DI POMPAGGIO

Le caratteristiche cui devono soddisfare le pompe impiegate per l'HPLC sono molto restrittive e includono:

• Generazione di pressioni maggiori di 6000 psi (lb/in²)
• Non generare un pressione pulsatile in uscita
• Velocità di flusso variabili in un range di 0.1-10 ml/min
• La riproducibilità del flusso non deve variare più dello 0.5%
• Resistenza alla corrosione verso una grande varietà di solventi

Sono impiegati due tipi di pompe meccaniche: una del tipo a siringa guidata a vite oppure una pompa alternativa (o a pistone), mostrata in Figura 3. La prima produce un flusso senza pulsazione e la velocità del flusso è facilmente controllabile; ha però lo svantaggio di un alto volume di riempimento, che diventa un problema quando devono essere sostituiti i solventi. Figura 3. Pompa alternativa per

HPLC. Le pompe a pistone sono quelle più comunemente usate e sono costituite da una piccola camera cilindrica che è riempita e vuotata dal movimento di un pistone. Il pompaggio produce un flusso pulsatile che deve essere successivamente linearizzato. I vantaggi delle pompe a pistone sono un piccolo volume interno, la capacità di generare alte pressioni in uscita (superiori a 10000 psi), rapida adattabilità ai cambiamenti dei gradienti nel corso dell'analisi, flusso costante e inoltre sono molto poco sensibili alla viscosità del solvente e alla pressione in testa alla colonna.

Alcuni strumenti sono equipaggiati con una pompa pneumatica, che nella sua forma più semplice consiste in un contenitore di solvente collassabile su se stesso contenuto in un recipiente che può essere riempito di gas compresso. Il gas spinge le pareti del contenitore collassabile che spreme il solvente in colonna. Le pompe di questo tipo sono semplici, poco costose e danno

Un flusso costante e lineare, hanno però come inconveniente che la velocità del flusso è molto influenzata dalla viscosità della fase mobile. Inoltre non sono adatte ad analisi ingradiente.

Si deve notare che le alte pressioni generate dalle pompe per la cromatografia in fase liquida, non sono a rischio di esplosione, poiché i liquidi non sono molto comprimibili. Quindi la rottura di un componente può solo provocare una perdita di solvente e soltanto se esso è infiammabile ci può essere l’eventuale pericolo di incendi.

SISTEMA DI INIEZIONE DEL CAMPIONE

Sebbene nella cromatografia in fase liquida sia spesso usata l’iniezione tramite siringa attraverso un setto costituito di materiale elastomero, questa procedura non è molto riproducibile e si può usare solo a pressioni di lavoro inferiori a 1500 psi.

Nella iniezione stop-flow il flusso del solvente viene bloccato per permettere l’asportazione di una piccola

quantità di solvente in testa alla colonna e il caricamento del campione, sempre in testa, tramite una siringa. Comunque il metodo di caricamento più usato in HPLC è quello che utilizza il sampling loop, come mostrato in Figura 4. Questi dispositivi sono equipaggiati di loop intercambiabili di capacità variabile dai 5 ai 500 µl. La caratteristica principale del sistema di iniezione tramite loop è l'alta riproducibilità dei volumi iniettati. Figura 4. Sistemi di iniezione per HPLC. LE COLONNE PER HPLC Le colonne per HPLC sono di solito costruite in acciaio, ma esistono anche in vetro ricoperto di metallo impiegate soprattutto quando si lavora a pressioni inferiori a 600 psi. La lunghezza delle colonne varia da 10 a 30 cm e il diametro interno da 4 a 10 mm. Le colonne sono generalmente impaccate con particelle di diametro variabile dai 5 ai 10 µm. Colonne di questo tipo arrivano generalmente a contenere dai 40000 ai 60000 piatti teorici per metro di colonna.

Lunghezza. Recentemente sono state introdotte sul mercato microcolonne lunghe dai 3 ai 6.5 cm e aventi un diametro interno variabile da 1 a 4.6 mm. Queste colonne che sono impaccate con particelle di diametro variabile µm, contengono più di 100000 piatti per metro e hanno il dai 3 ai 5 vantaggio di una maggiore velocità operativa e di un minore consumo di solvente. Quest'ultima proprietà è di notevole importanza perché i solventi ad alta purezza richiesti per questo tipo di cromatografia sono molto costosi. Con questo tipo di colonne vi sono esempi di separazione di 8 composti in un tempo di 15 secondi con una colonna lunga 4 cm con µm di un diametro interno di 4 mm e impaccata con particelle di 3 diametro. Il più comune materiale usato per impaccare le colonne per HPLC è la silice, preparata per agglomerazione di particelle di diametro inferiore al micron sotto condizioni che portano a particelle più grandi con diametri.

Le particelle utilizzate per impaccare le colonne nella cromatografia liquida sono di solito di materiale poroso, come la silica gel o il gel di silice, che hanno una dimensione uniforme. Le particelle risultanti sono spesso rivestite con sottili film di composti organici, che sono legati alla superficie tramite legami chimici o fisici.

Altri materiali usati per impaccare le colonne sono le particelle di albumina, di polimeri microporosi e resine a scambio ionico.

Spesso, per aumentare la vita di una colonna analitica, in testa ad essa è applicata una colonna di guardia che rimuove dai solventi particelle indisciolte e contaminanti. Inoltre, nella cromatografia liquido-liquido, la colonna di guardia serve a saturare la fase mobile con la fase stazionaria così che sia minimizzata la perdita di fase stazionaria dalla colonna.