Gli enzimi

Gli enzimi controllano il metabolismo regolando la velocità di reazione metabolica. Agiscono solo su uno specifico

substrato. Non cambiano l’energia della reazione ma potenziano la velocità con cui essa avviene. Sono dei

catalizzatori che promuovono la formazione di reazioni coerenti.

Velocità di reazione:

Velocità iniziale (v0) e S

La concentrazione del substrato (S) presente influenzerà notevolmente la velocità della formazione dei prodotti.

Come definire l’attività degli enzimi?

Le proprietà fisiche di un enzima sono misurate molto spesso in base alla velocità relativa che il substrato produce.

1 unità ATTIVITA’= Unità internazionale (IU)

1 unità SPECIFICA ATTIVITA’ = IU dell’attività enzimatica per i mg delle proteine totali presenti

La velocità v0 della reazione catalizzata da un enzima dipende da:

-concentrazione del substrato

-temepratura

-ph

-forza ionica della soluzione acquosa

Cinetica della saturazione enzimatica

Quando la velocità iniziale è tracciata contro S, ne risulta una curva iperbolica dove Vmax rappresenta la massima

velocità della reazione.

Se S>E, tutti gli enzimi disponibili vengono saturati con il substrato legato.

Michaelis-Menten Curve

Spiegarono la forma della curva di velocità.

L’equazione mostra che quando S> Km,allora v0=Vmax; quindi v0 non dipende da S.

Significato di Km

Quando v0= ½ Vmax, allora la relazione Vmax/2 > Km = S

Sperimentalmente , Km è un parametro utile per caratterizzare il numero e / o tipi di substrati che un particolare

enzima utilizza.

• E 'anche utile per confrontare gli enzimi simili da tessuti diversi o diversi organismi .

• Inoltre, è la Km dell’enzima limitante in molte delle vie metaboliche biochimiche che determina la quantità di prodotto

e la regolazione complessiva di un determinato percorso .

• Clinicamente ,i confronti di Km sono utili per valutare gli effetti che le mutazioni hanno sulla funzione della proteina

per alcune malattie genetiche ereditarie.

Piccoli valori di Km indicano grande affinità dell’enzima al substrato.

Lineweaver-Burk

Vantaggio: determinazione accurata dei valori di Km e Vmax

Eadie-Hofstee Plot

La pendenza è -km. L’ asse y intercetta è Vm. Può Essere oggetto di grande errore dal momento che entrambe le

coordinate contengono la variabile v dipendente.

Effetti della temperatura

Aumenti dei tassi di reazione con la temperatura fino ad un limite sopra una certa temperatura , attività diminuisce con

la temperatura a causa della denaturazione. La denaturazione è molto più veloce dell’ attivazione.

Rate varia secondo l'equazione di Arrhenius

Effetto della temperatura sull’attività enzimatica

Equazione di Arrhenius:

dove

k= costante di velocità

A è una costante che dipende dalla natura dei reagenti

e = 2,718 è la base dei logaritmi naturali o neperiani

E att è l'energia di attivazione della reazione

R è la costante universale dei gas

T è la temperatura assoluta

Effetti del ph

-Sugli enzimi:

Gli enzimi hanno gruppi ionici sui loro siti attivi.

La variazione del pH cambia la forma ionica dei siti attivi.

Il PH cambia la struttura tridimensionale degli enzimi .

-Sul substrato:

Alcuni substrati contengono gruppi ionici

Il PH influenza la forma ionica del substrato

Colpisce l'affinità del substrato all'enzima

Effetto del pH sull’attività enzimatica

Il riconoscimento enzima-substrato e le risposte catalitiche che ne derivano dipendono largamente dal pH.

Generalmente gli enzimi sono attivi solo nell’ambito di un limitato intervallo di pH e la maggior parte di essi esercita

un’attività ottimale in corrispondenza di un particolare valore di pH.

Effetto della concentrazione degli enzimi sulla velocità

Nel fisso , saturando [ S ] , maggiore è la concentrazione dell’ enzima , maggiore è la velocità di reazione iniziale.

Questa relazione si terrà fino a quando non vi è sufficiente substrato.

Effetto della concentrazione degli enzimi sul controllo del metabolismo

La concentrazione di un enzima può cambiare la velocità della reazione catalizzata.

Pertanto le condizioni che aumentano la concentrazione di un enzima (induzione genica) o la riducono (gene rimosso),

possono modificare la velocità di una via metabolica.

Inibizione degli enzimi

In un tessuto e nei diversi agenti chimici di una cellula (metaboliti , analoghi substrato , tossine , farmaci , complessi

metallici , ecc ) possono inibire l'attività dell'enzima.

Inibizione enzimatica: è uno dei meccanismi fondamentali per il controllo dei sistemi biologici:

-IRREVERSIBILE ->Interazioni di tipo covalente

- REVERSIBILE ->Interazioni di tipo non covalente (può essere competitiva o non competitiva).

Inibitori reversibili

Dopo la combinazione con l'enzima ( complesso EI è formato ) possono rapidamente dissociarsi.

L’ enzima è attivo solo quando legato a inibitori.

Il complesso EI è tenuto insieme da deboli interazioni non covalenti.

Vi sono tre tipi fondamentali di inibizione reversibile : competitivi ,uncompetitivi , non competitivi.

Nell’inibizione competitiva l’inibitore compete con il substrato per il sito attivo: può essere spiazzato da una [S]

sufficientemente alta.

Reversione competitiva

L’ inibitore ha una struttura simile al substrato, così può legarsi al sito attivo stesso.

• L'enzima non può distinguere i due composti.

• Quando l’inibitore si lega , impedisce al substrato di legarsi.

• L’ inibitore può essere rilasciato aumentando la concentrazione del substrato.

La costante di dissociazione per il complesso EI è data da

Ki= [E] [I]/[EI]

Poiché l’aumento della concentrazione del substrato può rimuovere l’inibizione, la Vmax può essere ottenuta in

presenza di un inibitore competitivo. Tuttavia il valore di Km apparente è alterato.

KMapp = KM(1 + [I]/Ki)

Aumentando [I]aumenta Kmapp

Inibizione non competitiva

Si lega al sito di un enzima diverso dal sito attivo • Inibitore e il substrato possono legarsi all’enzima

contemporaneamente • Non può essere superato aumentando la concentrazione del substrato.

Cinetica di un inibitore non competitivo

Aumentando [ S ] non può superare l'inibizione Meno E disponibile , V max è inferiore , Km rimane la stessa E per

disponibile. Vmax DIMINUISCE – l’inibitore influisce la velocità di reazione legandosi al sito diverso substrato attiva in

loco.

Km - Nessun cambiamento.

L'inibitore non può legarsi all'enzima direttamente , ma può legarsi solo al complesso enzima-substrato . • ES + I = ESI

• Sia Vmax che Km sono diminuite da ( 1 + I / Ki ). Gli inibitori non competitivi si legano ai ES non per liberare E •

Questo tipo di inibizione di solito si verifica solo in reazioni multi substrato.

Inibitori irreversibili

Gli inibitori irreversibili generalmente provocano la distruzione o la modifica di un amminoacido essenziale richiesto

per l'attività enzimatica.

• Questo è dovuto a qualche tipo di collegamento covalente tra enzima ed inibitore .

• Questi tipi di inibitori vanno dai più semplici , che in linea di massima reagiscono con reagenti modificati

chimicamente ( come iodoacetamide che reagisce con cisteine ) agli inibitori più complessi che interagiscono in modo

specifico e in modo irreversibile con i siti attivi degli aminoacidi (sono chiamati in questo caso inibitori suicidi).

• In seguito al legame e ad alcune modifiche catalitiche , un prodotto inibitore altamente reattivo viene formato per

legarsi irreversibilmente ed inattiva l'enzima. L'uso di inibitori suicidi ha dimostrato di essere clinicamente molto

efficace.

Gli enzimi irreversibili sono:

-reagenti per specifici per gruppi

-analoghi al substrato

- inibitori suicidi

I reagenti specifici per gruppo reagiscono con specifici gruppi R di amminoacidi.

Analoghi al substrato

Strutturalmente simile al substrato per l'enzima; Modificano covalentemente i residui del

sito attivo .

Inibitori suicidi :

L’ inibitore si lega come un substrato ed è inizialmente elaborato dal normale meccanismo

catalitico. Quindi genera un intermedio chimicamente reattivo che disattiva l'enzima

attraverso la modificazione covalente. Si parla di suicidio perché l’ enzima partecipa nella

propria inibizione irreversibile.

La penicillina entra facilmente nel sito attivo della transpeptidasi in quanto la sua struttura

è simile ad una parte del suo substrato (residuo D-Ala-D-Ala. Una volta legata forma poi

un legame covalente con un residuo di serina presente nel sito attivo dell’enzima: la

transpeptidasi è inibita irreversibilmente. Poiché la peptidasi partecipa alla sua

inattivazione, la penicillina agisce come un inibitore suicida.

Regolazione dell’attività enzimatica

Due meccanismi generali possono interessare l’ attività enzimatica :

1 ) alterazione dell'efficienza catalitica dell'enzima

2 ) controllo delle quantità complessive di enzimi

Meccanismi di regolazione degli enzimi : alterazione dell’efficienza catalitica dell'enzima

Concentrazione del substrato

1. Inibizione reversibile dai prodotti

2. Attivazione allosterica o inibizione

3.

4. Modifiche covalenti

5. Scissione proteolitica - digestione

Regolamento della regolazione degli enzimi

• La sintesi complessiva e la degradazione di un particolare enzima , anche definito il suo

numero di turnover , è un modo per regolare la quantità di un enzima .

• La quantità di un enzima in una cellula può essere aumentata aumentando la sua

velocità di sintesi , riducendo il tasso della sua degradazione , o entrambi .

INDUZIONE

( un aumento causato da una molecola effettrice ) L’induzione della sintesi enzimatica è

un meccanismo comune - questo può manifestarsi a livello di espressione genica , la

traduzione di RNA , e modificazioni post-traduzionali.

• Le azioni di molti ormoni e / o fattori di crescita sulle cellule porterà ad un aumento

dell'espressione e alla traduzione di " nuovi" enzimi non presenti prima nel segnale.

DEGRADAZIONE

la degradazione delle proteine accade nella cellula, ma i meccanismi molecolari che

determinano quando e quali enzimi saranno degradati , sono poco conosciuti.

• Il numero di turnover di un enzima può essere utilizzato per il confronto generale con altr