Genetica medica appunti

La citogenetica

La citogenetica studia, mediante il microscopio ottico, la morfologia, il numero dei cromosomi e il loro ruolo nell’ereditarietà. Inizialmente fu utilizzata per il mappaggio dei geni sui cromosomi, oggi è utile in diagnostica e in ricerca per evidenziare anomalie del cariotipo.

L’analisi dei cromosomi permette di ricostruire il cariotipo, ossia l’ordinamento l’insieme, dalla copia più grande alla più piccola, dei cromosomi di una cellula in un individuo. I cromosomi sono visibili soltanto in una fase del ciclo cellulare: la divisione cellulare.

Il cariotipo

Ogni specie animale e vegetale è caratterizzata da un proprio assetto di cromosomi che si mantiene costante per numero e morfologia, di generazione in generazione. L’uomo, come tutte le specie, ha quindi un corredo cromosomico particolare. Tutte le cellule somatiche che costituiscono un organismo hanno lo stesso assetto cromosomico.

Negli individui appartenenti a specie a riproduzione sessuata questo assetto è costituito da n paia o coppie di cromosomi, che nel loro insieme costituiscono il corredo cromosomico o cariotipo diploide 2n. Per ogni coppia avremo un cromosoma di origine paterna e uno di origine materna.

Quando la determinazione del sesso è controllata dall’assetto di particolari cromosomi (nell’uomo X e Y), questi vengono chiamati eterosomi, mentre le coppie, uguale nei due sessi, vengono chiamati autosomi.

Il citogenetista, che si occupa di evoluzione, spesso analizza diverse specie. Analizzando diverse cellule, anche senza sapere a che tipo di organismo appartengono, è in grado di riconoscere l’origine della cellula dal momento che ogni specie possiede un cariotipo specie-specifico.

Ad esempio, l’uomo possiede 46 cromosomi, il gorilla 48 e il topo 40. NB: Il numero dei cromosomi non corrisponde alla posizione nella scala evolutiva né al numero di geni contenuti: infatti, ad esempio, l’uomo ha 21600 geni, il topo 22700.

Perché è importante lo studio del cariotipo in medicina?

Lo studio del cariotipo nell’ambito medico è importante perché:

• 1 su 200 neonati possiede una patologia cromosomica;
• Più del 50% degli aborti spontanei è dovuto ad anomalie cromosomiche;
• 1 su 100 è portatore di un’anomalia bilanciata che non è associata a un fenotipo clinico, ma ha implicazioni con poliabortività o infertilità.

La maggior parte dei tumori ha anomalie cromosomiche multiple. In alcuni tumori l’analisi citogenetica è vitale perché un particolare riarrangiamento cromosomico comporta una particolare terapia.

Cromosomi omologhi (uno di derivazione paterna, l’altro materna)

I membri di una coppia di cromosomi sono chiamati omologhi, sono uguali per dimensione, forma e posizione dei centromeri; tuttavia, essi portano l’informazione per il controllo degli stessi tipi di caratteristiche genetiche, sebbene non necessariamente l’identica informazione genetica.

Ad esempio, i membri di una coppia di cromosomi omologhi 11 potrebbero portare ognuno un gene che specifica per la struttura dell’emoglobina β, tuttavia uno potrebbe avere l’informazione per l’emoglobina normale e l’altro potrebbe specificare per una forma anomala di emoglobina associata all’anemia falciforme.

I cromosomi omologhi contengono DNA che codifica per le stesse proteine. In questo esempio, si vede come i cromosomi omologhi hanno gli stessi geni nella medesima posizione (bande colorate), ma possono presentare varianti diverse (alleli). Questa struttura è individuabile quando la cellula è in divisione cellulare, perché la cromatina è compattata in modo tale da costituire i bastoncelli.

È importante che le cellule figlie ereditino esattamente lo stesso contenuto, quindi ha un ruolo chiave un’alta compattazione e una distribuzione precisa prima delle divisioni cellulari. Alleli diversi tra loro sono detti alleli in eterozigosi, alleli uguali tra loro sono detti alleli in omozigosi.

Il ciclo cellulare e i cromosomi

Nella profase, con l’inizio della divisione cellulare, comincia la compattazione dei cromosomi, che diventa massima in metafase, ovvero nel momento in cui i cromosomi sono allineati nella piastra metafasica del fuso mitotico. Il numero dei cromosomi lungo il ciclo cellulare non cambia, ma cambia il contenuto del DNA.

G1 phase (G = gap): la cellula monitora le sue dimensioni e l’ambiente esterno e cresce sintetizzando RNA e proteine. S (S = synthesis): replicazione del materiale genetico. Il DNA passa da 2n a 4n. G2: controllo dell’avvenuta replicazione di tutti i cromosomi e una crescita secondaria prima della mitosi. In questa fase il DNA ha un corredo 4n.

Componenti strutturali e funzionali di un cromosoma

Un cromosoma per essere stabile ed essere trasmesso alle cellule figlie ha bisogno di una regione chiamata costrizione primaria/centromero, quella dove le due molecole primarie restano unite tra loro. C’è poi una piastra proteica che forma il cinetocore, il componente del centromero su cui prendono attacco i microtubuli del fuso mitotico.

Il genere di cinetocore è duplice, uno per ciascun cromatidio. Il cromosoma è inoltre costituito da due braccia: Braccio corto, indicato con p (petit) e Braccio lungo, indicato con q (queue). Il centromero è parte essenziale per una corretta segregazione dei cromosomi durante la divisione cellulare. Esso mantiene uniti i cromatidi fratelli ed è un punto d’attacco al fuso mitotico.

I telomeri

Sono sequenze di eterocromatiche e sono composte da sequenze ripetute, che nell’uomo terminano con TTAGGG. Le sequenze comuni assicurano la completa replicazione del DNA, le sequenze ripetute TTAGGG (3-20 Kb) sono riconosciute dalla telomerasi la cui attività contrasta l’accorciamento progressivo dei cromosomi dovuto al susseguirsi dei cicli normali di replicazione del DNA. Essa è infatti una riboproteina in grado di allungare l’estremità del DNA che, essendo a filamento lineare, andrebbe incontro a un accorciamento progressivo per le successive replicazioni.

La telomerasi non è attiva in tutte le cellule, ma lo è durante le prime fasi di sviluppo. Nelle cellule somatiche non funziona: è il link tra l’attività telomerasica, l’invecchiamento cellulare e l’apoptosi. Molte cellule tumorali riacquisiscono l’attività telomerasica, che è pro-oncogena; andando a sequenziare tessuti tumorali si è infatti identificata una mutazione che riattiva l’attività telomerasica. Se si effettua un’ibridazione in situ con una sonda specifica per TTAGGG è possibile riconoscere tutte le estremità dei cromosomi.

Nell’immagine qui a fianco la telomerasi è rilevata anche in centro al cromosoma 2: ciò deriva dalla fusione di due cromosomi testa-testa, che nella scimmia è presente sotto forma di due cromosomi diversi: è il segno di fusione. I telomeri sono essenziali per il mantenimento dell’integrità del cromosoma. Sono essenziali per la stabilità dei cromosomi. Favorisce il legame con le proteine telomeriche che costituiscono la capsula protettiva. La loro perdita determina instabilità delle estremità con la tendenza ad associarsi con altre estremità rotte di altri cromosomi, ad essere coinvolto in eventi di ricombinazione o ad essere degradato.

Protezione delle estremità dei cromosomi dalla degradazione e dalla fusione coda-coda con altri cromosomi. Sono coinvolti nello stabilire un’architettura tridimensionale nel nucleo. I cromosomi non sono disposti a caso durante l’interfase, ma sono posti in determinate posizioni non casuali. Alcuni cromosomi, allo scopo di facilitare la funzione di trascrizione di alcune regioni cromosomiche, sono attaccati tramite i telomeri alla membrana interna del nucleo e partecipano quindi allo stabilire un’architettura tridimensionale del nucleo.

Storia della citogenetica

Nel XX secolo si ebbero le prime immagini dei cromosomi. Fino al 1950 si pensava che il numero dei cromosomi fosse 48. Successivamente, nel 1952 viene introdotta una soluzione ipotonica, una soluzione utilizzata per l’allestimento dei cromosomi; essa facilita l’ingresso nella cellula di acqua e, quando questo avviene, ovvero quando le cellule si spottano sul vetrino, la membrana si rompe e i cromosomi si distribuiscono senza sovrapporsi per poi essere analizzati.

Nel 1956: grazie a Tjio si stabilì il corretto numero cromosomico umano. Egli trascorreva le proprie vacanze nei laboratori europei. Così facendo, mentre lavorava in Olanda, si rese conto dell’esatto numero dei cromosomi umani. La scoperta di Tijo rappresentò una conquista per la medicina, che permise, negli anni seguenti, di scoprire molte patologie causate da anomalie cromosomiche di numero.

Nel 1959 Lejune scoprì che la causa genetica della sindrome di Down era dovuta alla presenza di un sovrannumero del cromosoma 21. A seguire, si notarono le altre. Nel 1960 venne scoperto il cromosoma Philadelphia, che ha un ruolo chiave nella leucemia mieloide cronica. Si notò infatti nel corredo di un paziente malato un marcatore normalmente assente nelle cellule di un paziente sano; è la prima prova che il tumore è una malattia genetica che riguarda le cellule somatiche.

Nowell pensò che questo cromosoma dovesse dare alla cellula la capacità di riprodursi e dare un effetto vantaggioso per la crescita cellulare. Nel 1960, in occasione della Conferenza di Denver, vennero stabilite le convenzioni per chiamare e catalogare i cromosomi. Il 21 è tuttavia più piccolo del 22, ma la nomenclatura è restata tale per motivi storici.

Il bandeggio

Agli inizi del 1970 si misero a punto tecniche di bandeggio che permisero di identificare in modo inequivocabile i diversi cromosomi. L’aumentata risoluzione delle tecniche citogenetiche permise di capire che il cromosoma Ph non era determinato da una delezione del cromosoma 22 ma da una traslocazione reciproca tra i cromosomi 22 e 9.

Nel 1971: primo bandeggio con Quinacrina, bandeggio Q, da Caspersson – bande più/meno fluorescente con il bandeggio ciascun cromosoma possiede un’alternanza di bande caratteristico di ogni cromosoma. Ciò permette di distinguere cromosomi con morfologia simile (ex: gruppo D molto simile per morfologia).

Nel 1972: secondo bandeggio, G, con tripsina-Giemsa – bande chiare/scure. Scambio reciproco tra pezzi di cromosoma in Philadelphia: porta a un gene chimerico, sottoposto a una traslocazione. Con la traslocazione il gene si avvicina a un enhancer o a un promotore forte, il che porta a una overespressione del gene stesso.

Per i riarrangiamenti troppo piccoli altre tecniche: Epoca citogenetica molecolare Ibridazione in situ: applicazione di tecniche molecolari di ibridazione su preparati citologici, basati sull’osservazione che sequenze nucleotidiche complementari erano in grado di appaiarsi e formare degli ibridi stabili. Nel 1986 fu riportato il primo esperimento dove si usò come sonda l’RNA ribosomiale marcato radiattivamente.

Nel 1977 vennero introdotti anticorpi marcati con molecole fluorescenti in grado di individuare in modo specifico ibridi RNA-DNA. Successivamente (1988) si fu in grado di marcare direttamente che indirettamente sonda di DNA o RNA con fluorocromi.

L’analisi del cariotipo

1. Allestimento delle cultura: le cellule vengono prese e messe in coltura
2. Preparazione dei vetrini
3. I cromosomi ottenuti sono colorati mediante colorazione differenziale
4. Osservazione al microscopio e costruzione del cariotipo e scrittura del referto

Allestimento delle colture

Lo studio dei cromosomi si effettua soltanto su cellule proliferanti bloccate in metafase. È necessario utilizzare cellule in grado di dividersi velocemente.

Fonti di cellule in divisione

• Sangue periferico: da un semplice prelievo è possibile recuperare le cellule, metterle in coltura e analizzarle, ma esse necessitano di stimolazione per replicarsi.
• In particolari esigenze si possono utilizzare i fibroblasti. Questo perché alcune patologie cromosomiche sono dovute a un riarrangiamento cromosomico a mosaico, cioè si ha la presenza sia di cellule normali sia di cellule riarrangiate. Non si possono usare quelle del sangue perché le metafasi risultano normali e non si riesce a verificare ipotesi clinica. I fibroblasti, a differenza delle cellule del sangue, non devono essere stimolate. Ciò evita la perdita del riarrangiamento cromosomico e ne permette l’analisi. Nonostante ciò, si preferiscono le tecniche che sfruttano le cellule del sangue, anche dal momento che sono state introdotte nuove tecniche.
• Midollo osseo: nel caso di un paziente con tumore patologico, si effettua un’analisi a livello del midollo osseo e si fa uso di stimolanti della divisione cellulare.
• Cellule immortalizzate: sono ricche di riarrangiamenti e mutazioni, pertanto si cerca di evitare il loro uso soprattutto in diagnostica ma anche in ricerca.
• Villi coriali, liquido amniotico e sangue fetale: studio sugli embrioni

Tutti i tessuti possono essere usati per l’analisi del cariotipo, la cosa necessaria è che devono essere in grado di dividersi e produrre metafasi. In coltura (per il sangue) si utilizza l’anticoagulante (eparina). Si utilizza un terreno con soluzioni saline isotoniche, amminoacidi, vitamine, nucleotidi e indicatori del pH, che indicano il cambio del terreno. Si utilizzano sieri con fattori di crescita, zuccheri, proteine e additivi per stimolare la divisione cellulare, si utilizzano mitogeni, ad esempio la fitoemoagglutinina (PHA), che stimola il linfociti T, oppure LPS e conA (stimola i linfociti B), veleni mitotici: colchicina, vimblastina o altri farmaci che inibiscono il fuso mitotico, servono per impedire che la cellula entri in anafase, in tal modo i cromosomi si compattano ma non entrano in anafase.

Diagnosi post natale: coltura e allestimento del preparato da SP

Vengono utilizzate provette a becco di clarino, aggiunta terreno + sangue + fitoemoagglutinina (stimola crescita) proliferazione di 48-96h. Prima di prelevare, circa trenta minuti prima, è aggiunta colchicina per bloccare cellule in metafase; le cellule sono centrifugate e risospese in soluzione ipotonica (0.075M KCl), per venti minuti. Seguono una seconda centrifugazione e tre lavaggi in una soluzione di fissativo rappresentata da acido acetico e metanolo, in rapporto 3:1.

Le cellule fissate sono risospese in poco fissativo, successivamente consegue l’allestimento del preparato per sgocciolamento. I tempi sono ben definiti in base al tempo del ciclo cellulare delle cellule in coltura. Ad esempio, i linfociti T hanno un ciclo cellulare della durata di 24 ore. Dalla coltura, prelevo dopo 72 ore, in modo tale da avere un certo numero di cellule. I fibroblasti crescono, invece nella flask. Si utilizza tripsina per staccare le cellule dalla flask, successivamente saranno processate nello stesso modo del sangue. Talvolta c’è la possibilità di vedere cellule in divisione tondeggianti che si staccano dalle superfici.

Allestimento e preparazione dei vetrini

• Le cellule, risospese in una quantità opportuna di fissativo fresco, vengono fatte cadere mediante sgocciolamento (2-3 gocce) su vetrini pretrattati (miscela di alcol assoluto e HCL) posti in acqua distillata.
• Per una buona qualità dei preparati, l’umidità e la temperatura dell’ambiente devono essere controllate: le condizioni migliori sono offerte da 20°C con una umidità relativa di poco superiore al 50%.

Nelle prime fasi il vetrino risulta bagnato ma, man mano si asciuga le metafasi si vedono meglio. Nelle immagini risulteranno anche i nuclei. Inoltre c’è differenza di qualità del preparato, che può variare molto. Se si asciuga molto velocemente il citoplasma resta sui cromosomi bassa qualità: troppa acqua, eccessivo spread dei cromosomi, non si riesce a ricostruire conduzione ideale.

Colorazione

CROMOSOMA METACENTRICO: centromero in posizione mediana. CROMOSOMA SUBMETACENTRICO: centromero in posizione submediana. CROMOSOMA TELOCENTRICO: centromero in posizione subterminale (centromero corrisponde con il telomero, è tipico del topo, non è presente nell’uomo). CROMOSOMA ACROCENTRICO: centromero in posizione terminale. Più cromosomi hanno la stessa morfologia, pertanto servono altre caratteristiche.

Tecnica di bandeggio importante: si crea alternanza bande chiare/scure.

Tecniche di bandeggio: L’abilità di identificare con certezza specifici cromosomi è stata conquistata con la scoperta di alcuni fluorocromi e messa a punto di protocolli di bandeggio cromosomico che usati creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi (un pattern RIPRODUCIBILE di bande). Il bandeggio cromosomico è da allora diventato standard ed indispensabile per l’analisi citiogenetica. Ognuna di queste tecniche produce un pattern di bande chiare e scure (fluorescenti e non) lungo l’intero cromosoma.

Ogni coppia di cromosomi mostra un UNICO pattern di bandeggio, analogo ad un “bar code” che ci permette di differenziare l’uno dall’altro cromosomi con stessa taglia e stessa posizione del centromero.

• BANDE G: trattamento con Tripsina e successiva colorazione con Giemsa. Bande scure ricche in AT, che replicano più tardivamente e bande chiare in CG, più ricche di geni e che replicano più precocemente.
• BANDE Q: colorazione con Quinacrina, colorante fluorescente che non si lega preferenzialmente alle zone ricche in AT. Nelle regioni ricche in AT la fluorescenza è più stabile e quindi più ‘luminosa’ perché decade più lentamente.