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Genetica medica appunti Appunti scolastici Premium

Appunti di genetica umana basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Finelli dell’università degli Studi di Milano - Unimi, facoltà di Medicina e Chirurgia, Corso di laurea in biotecnologie mediche. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Genetica umana e medica docente Prof. P. Finelli

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ESTRATTO DOCUMENTO

Non sempre le duplicazioni sono in tandem: un cromosoma 15 presenta due frammenti della stessa regione

non in tandem.

CROMOSOMA AD ANELLO O RING

Generato dalla rottura delle estremità del braccio p e del braccio q, che si chiudono ad anello.

Le cellule sono instabili alla mitosi, pertanto questo tipo di cromosoma viene perso.

Ring del 14: perdita del frammento terminale del cromosoma 14: essendo

instabile, spesso i pazienti, in un numero piccole di cellule, presentano una

condizione dove il ring manca del tutto.

Ring del 20: a volte si perde il braccio corto/lungo. Questo ring porta a una

tipologia di epilessia resistente al farmaco. A volte mancano solo i telomeri, ma

si giunge comunque ad avere un ring. Probabilmente ci sono geni di posizione inattivati.

Se la madre ha un ring a mosaico, ovvero cellule normali e cellule con ring, il figlio può ereditare la cellule con

o senza ring. Se la cellula con ring dà luogo a formazione del gamete il gamete avrà un cromosoma 20

normale del padre e uno a ring.

Tuttavia, ci sono casi in cui la madre è a mosaico e il figlio pure: questo perché il ring è instabile e si riapre

durante la divisione cellulare.

ISOCROMOSOMA MONOCENTRICO

E’ un cromosoma formato o da due braccia corte o da due braccia lunghe.

Si possono avere isocromosomi p o

isocromosomi q. Esso avrà una regione in

duplice copia: ho monosomia parziale e

trisomia parziale

Il più comune isocromosoma coinvolge il

braccio lungo del cromosoma X presente in

alcuni pazienti con sindrome di Turner.

Le pazienti hanno 46 cromosomi, dove un X è

normale e l’altro ha due braccia lunghe (trisomia del braccio lungo e

monosomia de braccio lungo).Questi cromosomi possono essere usati come

marcatori sovrannumerari.

Sindrome di Pallister-Killian, si ha una tetrasomia del braccio corto del cromosoma 12.

Il fenotipo è molto grave, per instabilità dei marcatori a volte viene perso.

A volte è possibile avere un mosaico. Pertanto, volendo fare il cariotipo, questo viene fatto in citogenetica sui

fibroblasti perché le cellule del sangue, dividendosi, perdono il marcatore.

ESAC o cromosoma marcatore

Extra Structurally Abnormal Chromosome.

E’ un marcatore sovrannumerario per anomalia cromosomica strutturale, si hanno quindi individui di 47

cromosomi, con 46 + 1 marcatore.

Date le piccole dimensioni risulta difficile identificare col bandeggio la regione genomica da cui deriva.

Il laboratorio non può dare indicazioni se questo marcatore sovrannumerario causerà o meno un fenotipo

alterato: è diagnosi prenatale.

E’ difficile capire il suo effetto sul fenotipo, pertanto può essere benigno o causare un fenotipo severo.

Si stabilisce un rischio in base, ad esempio, alla presenza di sequenze di cromosomi acrocentrici (se è

eterocromatina no effetto fenotipico)

Il marcatore derivante da cromosoma 15 riconosce regioni in triplice copia che portano a sindrome grave

Correlazione cariotipo-fenotipo

Si valuta singolarmente, basandosi sui parametri:

- de novo/ereditario

- morfologia (datellitato, mono/bi)

- dimensioni, più è grande più c’è la possibilità che contenga eucromatina e geni importanti

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Consulenza:

Marker ereditato da genitore sano:

Non associato a aumentato rischio di difetti congeniti, ma possibilità di espressione di geni, presenti sul

marcatore, soggetti ad imprinting.

Marker de novo:

Rischio empirico di anomalie fenotipiche:

10.9% per satellitati

15.6% per non satellitati

Anomalie cromosomiche della struttura BILANCIATE

TRASLOCAZIONE

Una traslocazione è una mutazione cromosomica, in conseguenza della quale vi è un cambiamento di

posizione dei segmenti cromosomici e delle sequenze geniche in essi contenute. In una traslocazione non vi è

né aumento né perdita di materiale genetico.

Si verificano due tipi di traslocazione semplici.

1. Traslocazione intracromosomica: implica un cambiamento di posizione di un tratto cromosomico entro lo

stesso cromosoma.

2. Traslocazione interromosomica: implica lo spostamento di un segmento cromosomico da un cromosoma a

un cromosoma non omologo. Se questa traslocazione implica il trasferimento di un segmento in una sola

direzione da un cromosoma a un altro è una traslocazione non reciproca; se, invece, comporta lo scambio di

segmenti tra due cromosomi è una traslocazione reciproca. La traslocazione tipicamente influenza il prodotto

della meiosi. Traslocazione reciproca

Si genera perché rottura in due cromosomi non omologhi e c’è uno

scambio dei segmenti tra i due cromosomi coinvolti.

Se avviene tra un uno comprendente centromero e uno no si ha

formazione di una cellula con un cromosoma dicentrico e uno senza

centromero.

Nel momento in cui i cromosomi presentano una singola sequenza

centromerica questi si dividono normalmente, non è perturbata: la cellula

è stabile.

Più cromosomi possono essere coinvolti in traslocazioni bilanciate, ma

sono più difficili da individuare.

Per convenzione i cromosomi sono identificati come derivativi e sono

chiamati, in questo caso, derN e derM, in base a quale centromero

contengono.

Può esserci correlazione tra traslocazione e aborti spontanei;

Nella meiosi l’appaiamento degli omologhi dà origina a una figura tetravalente, con le

seguenti possibilità di segregazione:

A) Adiacente I: è la più frequente. Uno dei due cromosomi riarrangiati segrega con quello

non omologo normale. Risulta che uno dei due segmenti traslocati è duplicato e l’altro

deficiente (trisomia parziale per un cromosoma e monosomia parziale per il non omologo)

B) Adiacente 2: centromeri adiacenti omologhi migrano allo stesso polo

.

C) Alternata: i centromeri migrano allo stesso polo in modo alternato

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Traslocazione con sbilanciati dà luogo a trisomie o

monosimie parziali

Possono dar luogo a poliabortività, infertilità. Se

sbilanciamento non è grave c’è sviluppo del feto ma si ha

un bambino con ritardo mentale e malformazioni multiple.

La traslocazione prevede quindi che un segmento cromosomico si sposti dalla sua normale posizione a una anormale

posizione. Può essere di due tipi:

Robertsoniana: coinvolge solo i cromosomi acrocentrici

Reciproca: coinvolge qualsiasi cromosoma

Traslocazione robertsoniana: coinvolge solo i 5 cromosomi acrocentrici (13, 14, 15, 22, 21).

La rottura in questo caso avviene a livello del braccio corto, c’è scambio tra bracci corti e bracci

lunghi. Si ha la formazione di un cromosoma con due centromeri, il che è tuttavia stabile, perché

uno dei due si inattiva, non ha più struttura compatta, i due cromatidi sono separati in questa

regione e si inattivano.

Gli acrocentrici vengono invece persi senza dare problemi.

Questo riarrangiamento è presente con la frequenza 1:1000.

La maggior parte dei casi, circa l’85%, coinvolge t (14,21) e t (13, 14) che portano

a trisomie.

I portatori di questa traslocazione presentano 45 cromosomi, ma il cariotipo è

bilanciato perché due sono legati tra loro.

L’unico problema a cui si può andare incontro è costituito da poliabortività,

infertitlità e nascita di bambini con trisomie (trisomia 13 se è coinvolto 13).

Il 4-5% dei Down ha una cariotipo anomalo a causa di una traslocazione tra

il cromosoma 21 e un altro cromosoma acrocentrico, solitamente il 14.

Possiede un cariotipo a 46 cromosomi, ma le copie del cromosoma 21 sono

tre.

Se è la madre a essere portatrice bilanciata, il rischio di ricorrenza è di circa

il 14%.

Se il portatore è il padre il rischio è pari a 1-2%.

Estensione della consulenza genetica a tutta la famiglia.

Se abbiamo un portatore di traslocazione robertsoniana t(21;21), il rischio

di ricorrenza è del 100%.

Alla meiosi non si formano gameti normali - sono disomici o nullisomici

Prole

- trisomia 21

- monosomia 21 letale

-aborto 26

INSERZIONE

INVERSIONE Un’inversione è una mutazione cromosomica che si verifica

quando un segmento cromosomico viene exciso e poi reintegrato

nel cromosoma dopo una rotazione di 180° rispetto

all’orientamento originale. Quando il segmento invertito

comprende il centromero l’inversione è detta inversione

pericentrica, se non lo comprende è detta paracentrica.

L’inversione pericentrica

Fenotipo generalmente normale

•Problemi alla meiosi

•Formazione di un loop alla meiosi

•Crossing over fuori dalla regione cromosomica coinvolta nell’inversione:

nessun problema

•Crossing over dentro la regione cromosomica coinvolta nell’inversione:

delezioni e duplicazioni

L’inversione paracentrica

Crossing-over fuori dalla regione cromosomica coinvolta nell’inversione:

-Gameti normali

-Gameti bilanciati (con inversione)

Crossing-over dentro la regione cromosomica coinvolta nell’inversione:

- gameti normali

- gameti bilanciati (con inversione)

- Prodotti acentrici e dicentrici

Il materiale genetico non viene perduto quando si verifica un’inversione, benché possano esservi delle

conseguenze fenotipiche quando i punti di rottura sono all’interno di un gene o entro regioni che controllano

l’espressione di un gene. Le inversioni possono alterare la regolazione genica, in quanto l’ordine dei geni

cambia.

In entrambi i casi la presenza di questo riarrangiamento non è associato a un fenotipico clinico.

Non ci sono grandi sbilanciamenti cromosomici né varianti fenotipiche; tuttavia causa infertilità, dovuta allo

sbilanciamento dei gameti.

La conseguenza dell’inversione è quindi identificabile nella poliabortività: nel caso in cui una coppia ha tre

aborti consecutivi potrebbero esserci alterazioni di questo tipo. Prodotti meiotici dell’inversione pericentrica:

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se il crossing over avviene dove c’è stata l’inversione si forma una forcina. Il 50% del prodotto dei gameti di

questo individuo non è vitale. Prodotti meiotici dell’inversione paracentrica: anche qui il 50% del prodotto

dei gameti non è vitale, perché non essendoci il centromero c’è stata perdita di materiale.

NB: La frequenza di Crossing over non viene diminuita rispetto a quella che è normalmente, ma i gameti

risultanti non sono vitali. La non vitalità deriva dal fatto che nel gamete vi è uno sbilanciamento di geni – uno

o più geni sono mancanti e/o uno o più geni sono presenti in doppia copia anziché in singola.

In paracentrica c’è alta probabilità di avere gameti non funzionali o vitali: azospermia

I portatori di:

-traslocazioni reciproche bilanciate

-traslocazioni robertsoniane

-inversioni pericentriche

-inversioni paracentriche

-inserzioni

Hanno generalmente fenotipo normale, ma possono avere problemi nella riproduzione. Infatti, durante la meiosi,

possono verificarsi errori nella corretta separazione degli omologhi interessati dalla traslocazione, dalla inserzione o

dalla inversione. Questi errori di segregazione degli omologhi portano alla formazione di gameti anomali con

sbilanciamento del materiale ereditario. Questo può causare:

- ridotta fertilità

- poliabortività

- nascita di bambini con fenotipo patologico

Le alterazioni cromosomiche nei tumori possono essere sia bilanciate che quantitative che a loro volta possono essere

distinte in anomalie specifiche (frequentemente riscontrate in un determinato tipo istologico) e anomalie aspecifiche

(si presentano solo occasionalmente).

Le anomalie specifiche hanno un ruolo primario nello sviluppo del tumore.

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Leucemia mieloide cronica E’ un tumore sempre fatale che implica la

moltiplicazione incontrollata di mieloblasti, cellule

staminali dei globuli bianchi del sangue. Il cromosoma

Ph (Da Philadelphia, città in cui venne scoperto) è il

risultato della traslocazione del gene Abelson (ABL)

dal cromosoma 9 ad una regione del cromosoma 22

denominata regione di raggruppamento dei punti di

rottura, breakpoint cluster region (BCR) in inglese, con

la formazione di un gene chimera BCR/ABL. Tale

difetto cromosomico è presente in circa il 90% di tutti

i pazienti con LMC. Nella parte di ABL che partecipa

alla fusione è contenuto un dominio ad attività tirosino-chinasica, cioè con capacità di fosforilare (cioè di trasferire

gruppi fosfato donati da una molecola di ATP) residui di tirosine appartenenti a proteine in grado di legarsi ad ABL e

per questo dette substrati. Il risultato di questa fusione è quello di rendere l’attività chinasica di BCR/ABL (eredidata

da ABL) costitutiva; in altre parole l'attività tirosinico-chinasica di BCR/ABL non è più regolata.

Linfoma di Burkitt e Leucemia linfatica acuta di tipo L3

Il protoncogene MYC, che di per sé non determina la trasformazione

tumorale, è un fattore di trascrizione nucleare che induce l’espressione di

geni che promuovono la proliferazione

Il promotore viene giustapposto alla sequenza enhancer del gene per le

catene pesanti delle immunoglobuline (IgH) e attivo nelle cellule della line B

linfoctaria. 29

Campi di applicazione della citogenetica

Ricerca di anomalie costituzionali

Diagnosi Prenatale (LA, CVS, SF)

Diagnosi Postnatale (SP, Tessuti solidi)

Ricerca di anomalie acquisite

Citogenetica oncologica (SP, MO, Biopsie)

Studi di mutagenesi

1. La diagnosi prenatale

Per diagnosi prenatale si intende l’insieme di indagini strumentali e di laboratorio, finalizzate ad individuare definite

patologie, siano esse su base genetica, infettiva, o ambientale.

Le tecniche oggi disponibili consentono di affrontare la diagnosi prenatale in maniera non-invasiva

oppure invasiva.

Comprendono ecografia fetale e indagini citogenetiche, biochimiche e molecolari effettuate su

materiale fetale, ottenuto mediante prelievo di villi coriali, liquido amniotico, sangue fetale.

Test non invasivi

Isolamento dalla circolazione materna o analisi delle cellule fetali o DNA fetale (free DNA): NIPT

Screening siero materno: effettuato durante primo e secondo trimestre di gravidanza.

Questo test viene spesso sostituito da NIPD (non invasive prenatal testing) permette di stimare il rischio (alto

o basso) per aneuploidie cromosmiche e difetti del tubo neurale.

-primo trimestre (11a-13a settimana di gestazione) con valutazione dei livelli di PAPP-A, una proteina

associata alla gravidanza (pregnancy-associated plasma protein) e ormone gonadotropina corionica (hCG).

-secondo trimeste, valutazione alfa feto proteina (AFP), estradiolo e hCG.

Valuta il rischio per una donna in gravidanza che il figlio abbia anomalie cromosomiche.

Nel primo trimestre di gravidanza in combinazione con l’ecografia (10 settimana di gestazione) si

esegue il bi-test che combina il dosaggio della plasma proteina A associata alla gravidanza PAPP-A e

della frazione libera delle β-HGC ad un parametro ecografico, la cosiddetta translucenza nucale.

Queste misurazioni vengono quindi confrontate con quelle cosiddette mediane di riferimento. Il

risultato è un indice di rischio per le aneuploidie (chr 21, 18,13). che è possibile attribuire ad ogni

madre per quella specifica gravidanza.

La corretta esecuzione del test identifica il 90% delle gravidanze con feto affetto da sindrome di Down,

con una percentuale di falsi positivi, cioè amniocentesi inutili, del 5%.

Il test è fatto in contemporanea con un’analisi ecografica che valuta la traslucenza nuccale,

rappresentata da una regione che nel feto con trisomia 21 è più spessa e più larga rispetto a un feto

normale.

Il rischio empirico per un’aneuploidia è calcolato in base all’età della madre.

Esempio 1: gestante di 25 anni con un

rischio a priori di avere un bambino con

sindrome di Down di 1:1500.

Il risultato del test predittivo potrebbe innalzare tale

rischio a 1:100. E’ meglio fare amniocentesi.

Esempio 2: gestante di 40 anni con un rischio a priori di

avere un bambino con sindrome di Down di 1:100.

Il risultato del test predittivo potrebbe ridurre questo

rischio a 1:500. La donna può decidere di non fare amniocentesi (0.5-1% di rischio di perdita gravidanza)

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In base alle sindromi ci sono aumenti o decrementi di fattori. I

parametri variano in base al tipo di aneuploidia.

Questo test non viene quasi più effettuato ed è sostituito

dalla NIPT.

Questo perché essendo predittivo, dovendo fare nel II

semestre il test diagnostico, si preferisce fare quest’ultimo.

L’isolamento di DNA free in circolo materno viene estratto e viene clonato, amplificato e sequenziato e in base al

numero di sequenze ottenute e allineate si avrà idea se c’è o meno una condizione di trisomia.

Permette identificazioni di sequenze non rilevabili tramite metodo Sanger, rilevando casi di mosaicismo.

Test invasivi

Sono invasivi perché c’è un minimo rischio di perdita del feto durante il prelievo, perché richiedono prelievo di parte di

embrione o a esso inerenti.

Amniocentesi

Villocentesi

Cordocentesi

Diagnosi genetica preimpianto

Dato che le malformazioni fetali si visualizzano più tardi nello sviluppo, si può fare amniocentesi.

Il materiale recuperato può essere usato per analisi del cariotipo o per un test molecolare. Ultimamente l’analisi del

cariotipo è sostituita o fatta in contemporanea con RCGH, perché la citogenetica non rileva delezioni di piccole basse.

Questi test sono possibili da fare per:

- Test biochimici alterati

- Riscontro ecografico di malformazioni fetali

- Età avanzata

- Ansietà materna (è a pagamento)

- Anomalia cromosomica bilanciata di un genitore

- Anamnesi familiari per alterazioni cromosomiche

Prelievi:

- recupero un blastomero per analisi preimpianto

- 12° settimana di gestazione per test villocoriale

- 16° settimana di gestazione per amniocentesi

- 20° settimana di gestazione prelievo di sangue fetale mediante cordocentesi (estremamente rara)

L’amniocentesi

Si esegue nel secondo trimestre di gravidanza (16° settimana)

Il numero di cellule vitali nel liquido amniotico si va progressivamente riducendo con il proseguire della gravidanza; il

periodo più adatto è intorno alla 16a settimana.

E’ stata la prima ed è la più comune tecnica utilizzata per la diagnosi prenatale del cariotipo fetale (Mangiagalli 1975).

Consistenel prelievo di liquido amniotico (LA) mediante introduzione ecoguidata (con ecografo) di ago sottile

per via trans addominale.

Il rischio di aborto legata all’invasività della tecnica è circa 0,5-1%.

Il liquido amniotico è costituito da una parte non corpuscolata, cioè priva di cellule, ottenuta per

centrifugazione del prelievo, e una corpuscolata contenete amniociti, cioè cellule di diversa provenienza:

•epidermide del feto,

•cellule delle vie genitourinarie e della membrana amniotica,

•cellule delle mucose e dell’apparato digerente

E' quindi possibile tramite il dosaggio dei livelli di AFP ( αfetoproteina) nel liquido amniotico identificare un rischio

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aumentato che quel determinato feto sia affetto da difetti del tubo neurale.

Le cellule possono essere messe in coltura per costruire un cariotipo.

Esistono due modi per farlo: 1. Le cellule hanno capacità di aderire alla superficie della flask formando delle

colonie. Si possono staccare con tripsine e processarle per poi bloccarle sul

vetrino.

2. Le cellule che formano le colonie non sono staccate dal vetrino ma vi

vengono lasciate, dove viene fatto il trattamento. Le metafasi si analizzano

all'i’terno delle colonie.

Le linee guida iternazionali suggeriscono di utilizzare questo secondo metodo,

lasciando le cellule in colonie.

Perché? Per il mosaicismo, perché in vitro durante la coltura si può incorrere in

pseudomosaicismo, che avviene in coltura. In questa metodica distinguere lo

pseudomosaicismo è possibile perché se c’è questa condizione non sarà in tutte

le colture e spesso si presenza in solo mezza colonia.

Sul referto non viene commentato nulla. Se è un mosaicismo vero ci saranno

più colture con trisomia e più colonie con trisomia.

Se c’è un cariotipo anomalo è consigliata consulenza col genetista.

Analisi dei villi coriali

Il rischio di aborto legata all’invasività della tecnica è circa 1%.

Si prelevano dei villi terziari costituiti da due strati: interno di origine mesenchimale e dall’esterno che è il trofoblasto,

che a sua volta è formato da due strati: uno interno detto citotrofolblasto, costituito da cellule e forma cubica o

piramidale aventi la caratteristica di potersi dividere spontaneamente e la parte esterna detta sincizio trofoblasto,

costituito da tessuti polinucleati dove non si evidenziano cellule singole con un singolo nucleo.

Si utilizzano il citotrofoblasto e il tratto di origine mesenchimale.

Questi due tessuti vengono separati e vengono messi a crescere in due flask differenti.

Vengono quindi effettuate due colture: una coltura con il citotrofoblasto e una coltura proveniente dal mesenchima.

I citotrofoblasti e le cellule mesenchimali sono diverse.

Le prime si dividono spontaneamente così che è possibile ottenere metafasi mediante raccolta diretta di queste

cellule e analizzarle dopo poco. 32

Le cellule del mesenchima, invece, per ottenere le mitosi si devono allestire colture in vitro, in una coltura a medio

termine insieme al siero fetale, perché la crescita va stimolata.

Preparato diretto

Sfrutta l’attività mitotica spontanea del citotrofoblasto

Risultato in 24 ore

Preparato indiretto

Coltura del mesoderma coriale

Risultato in 8-15 giorni

Risultati ambigui CVS

1-2% CVS danno risultati ambigui legati a problemi di mosaicismo cromosomico

- Mosaicismo fetale vero

- Mosaicsmo confinato alla placenta (CPM)

- Contaminazione materna (più facilmente osservabile nella coltura rispetto al preparato diretto): andando a valutare

cellule con XX e cellule con XY se ci sono polimorfismi si verifica che ciò è dato da contaminazione materna.

- Pseudomosaicismo: artefatto avvenuto in vitro.

Potrebbe servire l’amniocentesi.

Se si trova discrepanza a livello del villo si ha una condizione presente sia a livello della placenta sia a livello del

feto

A volte il mosaicismo può essere confinato al villo (falso positivo) e a volte al feto (falso negativo, non

verificabile con villo centesi, solo con amniocentesi, probabilità dello 0.04%).

L’80% dei casi il mosaicismo è confinato alla placenta.

Perché ci sono più falsi positivi rispetto che a falsi negativi? Perché si trova più spesso aneuplodia nella

plascenta rispetto al feto?

E’ la discrepanza del feto placentare.

Raramente si possono osservare discordanze tra i dati citogenetici trovati in corso di diagnosi prenatale e

quelli che si osservano alla nascita.

La discordanza può essere dovuta, a mosaicismi confinati alla placenta oppure ai villi coriali.

Si tratta di eventi post-zigotici che non vanno confusi con gli pseudomosaicismi che sono dovuti ad aberrazioni

in vitro delle cellule coltivate e quindi privi di significato patologico.

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Il fatto che mosaicismi cromosomici possano essere confinati alla placenta, deriva dal

fatto che solo poche cellule della blastocisti (2 o 3 cellule su 64) danno origine

all’embrione; tutte le altre formano tessuto extraembrionali.

la mutazione cromosomica avviene nelle cellule destinate a dare origine all’embrione,

si avrà un mosaicismo vero nel feto che non appare nel citotrofoblasto (RISULTATO

FALSO NEGATIVO).

Se la mutazione cromosomica avviene nelle cellule destinate a dare origine alle cellule

corioniche, si avrà un mosaicismo vero che non appare nel feto (RISULTATO FALSO POSITIVO).

Non concordanza si può osservare tra metodo diretto (analisi del citotrofoblasto) e le colture (cellule del

mesenchima). Questa situazione è stata trovata analizzando sia il citotrofoblasto (metodo “diretto”) sia le

cellule mesenchimali (metodo “coltura”) della placenta.

Il cariotipo anomalo può essere in forma:

- omogenea

- a mosaico (la più frequente)

Per quanto detto la percentuale di falsi positivi è prevalente rispetto ai falsi negativi (1-2% contro

0.04%).

Nel caso di falsi positivi gli effetti sul feto sono in genere del tutto trascurabili. Ciò è vero quando le

anomalie sono trovate solo nel citotrofoblasto con il metodo diretto.

Quando invece le anomalie citogenetiche riguardano la componente mesenchimale del villo (scopribile

mediante colture a lungo termine), è possibile l’associazione, se pur rara , di ritardo della accrescimento

intrauterino.

Nel caso di linea cellulare anomala presente sia nel citotrofoblasto che nel mesenchima, la possibilità di

iposviluppo e perfino morte del feto è elevato (fino al 50 %).

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LA GENETICA MOLECOLARE

LA FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

E’ una tecnica microscopica che permette di rilevare e localizzare specifiche sequenze di DNA su preparati

citologici.

E’ a ponte tra le tecniche di citogenetica convenzionale e tecniche di biologia molecolare

Citogenetica molecolare FISH (Fluorescence in situ Hybridization)

Dai primi esperimenti allestiti ad oggi questa tecnica ha fatto numerosi passi in avanti riuscendo ad

aumentare sia la risoluzione, alla quale siamo in grado di individuare un riarrangiamento, che le sue

applicazioni, non soltanto nel campo diagnostico. A questo si è arrivati grazie:

•all’utilizzo di vari target citologici

•allo sviluppo di strategie di marcatura

•alla ampia disponibilità di sonde dopo il raggiungimento del sequenziamento dell’intero genoma

- Metafasi (5-6 Mb)

- Nuclei in interfase (50 Kb a 2Mb)

- Fibre cromatiniche (5 Kb a 500 Kb)

Per ibridazione si intende l’appaiamento di due sequenze di DNA complementari.

La sequenza di DNA utilizzata come sonda è marcata in modo che si possa poi evidenziare l’avvenuta

ibridazione Il DNA su vetrino viene denaturato con soluzioni o con

calore: la sonda marcata è denaturata a sua volta e si

appaiano.

Esistono oggi delle piastre scaldabili e raffreddabili

ciclicamanete, qui i vetrini vengono disposti insieme

alla sonda, partendo da 75°C a 37°C, permettendo la

denaturazione e l’ibridazione.

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L’ibridazione competitiva

Prende questo nome perché viene utilizzato DNA non marcato che rappresenta il DNA genomico altamente ripetuto: è

chiamato Cot1

CISS (Competitive in situ Suppression) è necessaria quando vengono utilizzate sonde di DNA di grandi dimensioni (40-

400kb) che contengono oltre che sequenze singole, sequenze ripetute intersperse come Alu e L1.

Si utilizza un eccesso di DNA genomico totale o di DNA arricchito in sequenze ripetute come il DNA Cot1 .

Sonda e DNA Cot1 vengono denaturati insieme e lasciati in pre-annealing per permettere al DNA Cot1 di

saturare gli elementi ripetuti contenuti all’interno della sonda.

Quando si utilizzano sonde abbastanza grandi è importante, durante l’ibridazione, utilizzare una parte di

DNA altamente ripetuto (solitamente il Cot1).

Marcati sia sequenze ripetute (blu)sia no (bianco), usato

target che riconsoce solo sequenze ripetute

Mettendo DNA altamente ripetuto (blu) la sonda riesce a

legarsi e gli unici pezzi di sonda che riconoscono il

filamento complementare sono le singole sequenze

Non si usa questa tecnica quando il DNA è lungo e non

contiene sonde ripetute

Post ibridazione:

LAVAGGI

Sono effettuati con condizioni appropriate di forza ionica e temperatura che dipenderanno dall’entità di omologia

della sonda con la sequenza bersaglio:

- temperatura (alta temperatura diminuisce la stabilità dell’ibrido e favorisce la denaturazione)

- forza ionica (aumenta la stabilità dell’ibrido e favorisce la rinaturazione).

Si utilizzano lavaggi a:

stringenza alta per sonde con omologia alta (temperatura alta e forza ionica bassa)

stringenza bassa con omologia bassa (temperatura bassa e forza ionica alta)

BLOCCAGGIO

trattamento con BSA (siero albumina di bovino), blocca i siti a cui si potrebbero legare in maniera aspecifica

l’anticorpo/avidina coniugati al fluorocromo.

DETECTION

se la sonda non è marcata direttamente bisogna visualizzare la sonda ibridata trattando l’ibrido con molecole

fluorescinate in grado di riconoscere in modo

specifico le sonde marcate: 36

La marcatura avviene:

•mediante l’incorporazione di un precursore nucleotidico (dUTP) legato direttamente a coloranti fluorescenti come

AMCA; DEAC; CB; FITC; OG; A48; RGr; R6G; TAMRA; TxR; Cy3; Cy3.5; Cy5, Cy5.5 (metodo diretto)

•mediante l’incorporazione di dUTP legato ad una molecola indicatrice (reporter) come la biotina (BIO) e la

digoxigenina (DIG) che vengono rilevate mediante anticorpi fluorescenti (metodo indiretto).

è possibile usare più fluorocromi ma ci saranno problemi al microscopio

NICK TRANSLATION

IL RANDOM PRIMING

Utilizzata per marcare sonde più piccole, solitamente ottenute mediante Long Range PCR, dell’ordine di 6-8 Kb grazie

al segnale più intenso.

Marcatura enzimatica che utilizza una serie di 9-meri primers degenerati capace di amplificare l’intero frammento di

DNA linearizzato.

Si possono oppure usare oligonucleotidi degenerati in grado di amplificare.

MARCATURA DI TIPO CLINICO

Molecole con atomo di platino in grado di riconoscere proteine, DNA e RNA.

Mettendo molecola con il prodotto da marcare mediante reazione si marcano le sostanze.

FISH: MICROSCOPIO A FLUORESCENZA Osservazione al microscopio

il microscopio a fluorescenza è corredato di filtri

specifici per i fluorocromi utilizzati per

“visualizzare” la sonda.

Al microscopio è collegata una fotocamera in grado

di captare l’immagine vista al microscopio e

trasmetterla ad un computer come immagine in

bianco e nero.

Fotografando la stessa metafase utilizzando i vari

filtri si ottengono singole immagini che vengono

registrate separatamente e che con programmi

appropriati vengono pseudocolorate.

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Nel microscopio ci sono tre filtri: uno che emette nel rosso, uno nel verde e uno nel blu.

Si possono utilizzare però più di tre sonde perché alcune possono essere marcate con combinazioni di fluorocromi.

Si preferiscono usare le immagini in bianco e nero perché hanno una risoluzione maggiore e vengono colorate solo

successivamente. (Dapi: blu chiaro).

Si individuano le sonde e si fa merge.

Merge: si sovrappongono le immagini vedendo la posizione della sonda su un particolare cromosoma.

Applicazioni generali della FISH

Identificazione di anomalie di numero (poliploidie, trisomie, monosomie)

La FISH è utilizzata quando le metafasi a disposizioni sono brutte o assenti o nel caso in cui si vogliono avere risultati in

tempi molto brevi (in citogenetica ci vogliono almeno 15-20 giorni)

Identificazione di riarrangiamenti strutturali e loro caratterizzazione

- Microdelezioni

- Microduplicazioni

- Traslocazioni criptiche

- Inversioni

- Cromosomi marcatori o ad anello

La FISH è utilizzata per vedere bene qual è la zona coinvolta nei riarrangiamenti strutturali.

E’ utilizzata, ad esempio, per microdelezioni e microduplicazioni che danno patologie specifiche dette patologie

genomiche, dovute e piccole delezioni o duplicazioni, non visibili con la citogenetica. Queste possono coinvogere 2-3

Mb. Molte di queste patologie danno luogo a delezioni o duplicazioni definite ricorrenti, dove il break-point cade

sempre nelle stesse regioni e coinvolge sempre la stessa grandezza di materiale genetico.

I pazienti con questa patologia hanno un fenotipo particolare che li caratterizza.

Il clinico vede questo paziente e deduce che sia presente una particolare delezione, viene effettuata una FISH per dare

diagnosi molecolare solo successivamente alla diagnosi clinica.

E’ usata inoltre per traslocazioni criptiche, inversioni e cromosomi marcatori o ad anello.

Mappaggio cromosomico di una regione specifica

Sviluppo della FISH su metafase e sonde

1. Chromosome painting: sonde marcate per un singolo paio di cromosomi omologhi (painting cromosoma

1, painting cromosoma 2 ecc).

La prima modalità di costruzione di questa libreria è stata fatta partendo da singoli cromosomi, che venivano

frammentati e messi in plasmidi. Questa libreria era messa a crescere, veniva estratto il DNA dai plasmidi,

isolato mediante flow sorting e marcato. Flow Sorting:

La selezione di cromosomi avviene mediane painting cromosoma

specifiche di cromosomi isolati mediante flow-sorting e

amplificati con DOP-PCR.

Questa tecnica prevede la separazione dei cromosomi in base

alla loro composizione in basi (contenuto G-C, A-T) e dalla

quantità di DNA. I cromosomi vengono trattati con coloranti che

si legano al DNA e che emettono fluorescenza quando colpiti da

raggio laser e separati in base alla diversa entità di emissione.

I cromosomi vengono fatti passare come flusso continuo e sono

colpiti da due laser, successivamente passano attraverso due

piastre, una carica positivamente e una negativamente.

Ciò fa sì che i cromosomi siano deviati in base al contenuto CG e

AT e in base al contenuto di DNA: ogni cromosoma ha la propria

caratteristica e la proprio deflezione all’interno di queste due

piastre.

Ibridi somatici:

Venivano utilizzati per il mappaggio genico.

Si ottengono utilizzando cellule umane e cellule di topo/criceto. L’ibrido, man mano che va incontro a divisioni

successive, si libera pian piano dei cromosomi umani. Quando l’ibrido è stabilizzato contiene tutto il genoma di

topo/criceto e pochi geni del genoma umano. 38

Di qui viene estratto il genomico e per arricchire il genoma umano si usano sequenze ripetute presenti solo nel

genoma umano e non nel criceto (in particolare primer ALU, in grado di amplificare le sequenza inter-ALU).

L’amplificato veniva quindi marcato nel suo tratto umano e amplificato.

Questo tipo di amplificazione è detta alu-PCR.

Microdissezione:

L’intero cromosoma o il frammento cromosomico ottenuto è sottoporto a DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide

PCR).

C’è collegato un manipolatore cui sono collocati bastoncini di vetro con cui, al microscopio, si è in grado di riconoscere

sequenze ricercate e recuperarle. Alcune volte è importante capire il riarrangiamento: con la citogenetica si vede

l’inversione ma non si apprezza il break-point.

Si riesce a capire con le painting.

Painting largamente utilizzato per diagnostica di tumori dovuti a traslocazioni,

che sono talvolta specifiche per quel particolare tumore. E’ importante

riconoscere la specificità perché la presenza o meno del riarrangiamento dà

indicazioni al medico per capire il tipo di trattamento da utilizzare.

2. Reverse painting

E’ una tecnica utilizzata per identificare materiale cromosomico di origine sconosciuto.

La painting che si utilizza non deriva dai cromosomi normali, ma dai cromosomi con traslocazione.

Flow sorting: del cromosoma marcatore di cui si ignora l’origine (solitamente 300 cromosomi)

Microdissezione: una regione cromosomica viene dissezionata da circa 15-20 cromosomi metafasici.

E’ una sequenza usabile come sonda, rappresentata da sequenze ripetute, in particolare le sequenze centromeriche

alfoidi. Esse sono cromosoma specifiche, sono loci del DNA satellite che, in base alla loro organizzazione genomica,

sono esclusivi di alcuni cromosomi.

Il frammento cromosomico/cromosoma marcatore ottenuto viene sottoposto a DOP-PCR (Degenerate

Oligonucleotide PCR). La miscela di frammenti ottenuti vengono marcati ed utilizzati come sonda per FISH su

preparazioni di cromosomi metafasici normali.

3. Tecniche che fanno uso di più sonde

La FISH ha la peculiarità di permettere l’utilizzo di più sonde contemporaneamente: marcare contemporaneamente

tutti i cromosomi umani richiede l’utilizzo di cinque fluorocromi diversi, che vengono combinati tra loro.

Esempio: tre fluorocromi portano a sette diverse sonde 39

Ci sono due tecniche che fanno uso di questa tecnica di marcatura, ma che devono affrontare tre svantaggi:

1.Esse sono utilizzate soprattutto in laboratori di citogenetica tumorale, laboratori che con poche metafasi devono

capire il tipo di riarrangiamento. Solitamente non si ha molto materiale.

2. E’ un metodo molto costoso.

3. Sono state sostituite dal bandeggio, dato che i riarrangiamenti visti con questi metodi sono più o meno i medesimi

di quelli visti con la genetica molecolare.

Prendono nome di cross-species perché usando un cromosoma di gibbone si creano pannelli bare-code.

Multicolor-FISH (M-FISH)

SKY

In entrambi metodi si ha l’uso di 24 sonde painting in fluorescenza per tutti i cromosomi,

sono utili per lo studio dei riarrangiamenti cromosomici complessi e dei cromosomi

marcatori, soprattutto nei casi in cui non si ha tanto materiale da poter analizzare tramite

FISH (es. citogenetica dei tumori)

Sonde locus specifiche Applicazioni: Permettono di evidenziare la presenza di una regione

cromosomica riarrangiata (delezioni, duplicazioni, inversioni)

Le microdelezioni di 1Mb circa sono troppo piccole per poter essere rilevate

dalla citogenetica classica.

In diagnostica, normalmente, si utilizzano sonde comprate mirate per una data patologia.

Per fare indagini, invece, si utilizzano solitamente sonde genomiche di grandezza maggiore di 3Kb (risoluzione minima

se si utilizza una CCD camera) inseriti in vettori quali:

plasmidi (raramente), cosmidi, fagi, anche se ultimamente hanno preso largo uso BAC, PAC, e YAC, che hanno

grandezza maggiore.

I cloni BAC contengono 100-150 Kb e vengono selezionati utilizzando genome browser appositi.

Queste sonde erano utilizzate nel periodo in cui non v’era tecnica che potesse sostituire la citogenetica in grado di

identificare l’intero genoma.

Utilizzando queste sonde in diagnostica, contenenti sequenze uniche, quindi:

1. E’ possibile identificare riarrangiamenti submicroscopici, come quella che identifica la sindrome di Williams

E’ possibile tra questi identificare microdelezioni, che porta ad esempio

- alla sindrome DiGeorge, se manca una zona del cromosoma 22

- sindrome di Prader Willi/Angelma, che hanno delezione sul cromosoma 15, in particolare in 15q11-13 e una regione

più in basso che fa da controllo.

E’ possibile identificare traslocazioni criptiche subtelomeriche.

E’ possibile identificare microduplicazioni

E’ possibile identificare inversioni

2. Identificare il RING

3. SRY è un marcatore su p del Y.

Qui ci sono i geni AZFA-B-C sul braccio corto, se delete danno luogo a casi di azospermia

La FISH quindi:

- è utilizzata per confermare la diagnosi clinica di patologie associate alla presenza di microdelezione o

micoduplicazione.

Questo approccio di conferma diagnostica è fatto su quelle patologie con particolare fenotipo associato a particolare

delezione.

Rappresentano disordini genetici che sono riconosciuti essere dovuti a riarrangiamenti del DNA coinvolgenti regioni

genomiche “instabili”.

Si presentano generalmente come casi sporadici anche se esistono casi familiari.

I riarrangiamenti solitamente sono rappresentati da duplicazioni o delezioni, alcune volte da inversioni. Possono

essere sia ricorrenti sia non ricorrenti. 40

Sono definiti ricorrenti perché pazienti diversi hanno esattamente la stessa regione; la regione deleta è infatti

fiancheggiata da blocchi di sequenze ripetute dette sequenze segmentali a elevata omologia ma a basso numero di

copie, che mediano le duplicazioni e i riarrangiamenti.

Sono non ricorrenti, invece, quando le delezioni hanno grandezza diversa ma comportano lo stesso fenotipo, dal

momento che il gene causativo è compreso in questa zona. Questi pazienti sono rari ma permettono di identificare il

gene responsabile della patologia.

Solitamente in questi disordini il fenotipo clinico è la conseguenza:

• di un dosaggio non corretto di uno o più geni localizzati nel frammento genomico coinvolto nella delezione o

duplicazione e sensibili al dosaggio: sono geni aploinsufficienti.

•oppure della rottura di un singolo gene con perdita della sua normale funzione.

In base alla grandezza del segmento genomico coinvolto ed il potenziale numero di geni “dosage-sensitive” localizzati

nel segmento riarrangiato, delezione e/o duplicazioni possono risultare o in una patologia mendeliana o in una

sindrome da geni contigui o disordini cromosomici.

La maggior parte delle sindromi di questo tipo sono definite sindromi da geni continui, perché più geni sono

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implicabili nella patologia. Quando le dimensioni del DNA sono grandi (10 bp) si parla di riarrangiamenti

cromosomici.

LE DUPLICAZIONI SEGMENTALI

Classe di DNA ripetuto, identificato nel genoma umano, costituito da grossi segmenti genomici con elevata omologia

di sequenza.

Il 5% del genoma umano è duplicato ed è costituito da grosse e quasi identiche copie di DNA genomico la cui

lunghezza varia da 1 a 200-400 Kb, con una identità di sequenza che varia dal 90% al 100 %.

Sono separate solitamente da sequenze uniche con lunghezza >1Mb.

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La distribuzione di questi segmenti tra i cromosomi umani non è uniform

Le duplicazioni segmentali mediano i riarrangiamenti ricorrenti e sono divise in intracromosomiche (raggruppate

dentro un singolo cromosomico, braccio lungo o braccio corto) e intercromosomiche (localizzate in zone

centromeriche o telomeriche, si ritrovano su più cromosomi)

L’alto grado di omologia, l’estensione, l’orientamento e la distanza reciproca tra due o più duplicazioni segmentali fa sì

che queste sequenze siano un “terreno fertile” per eventi di ricombinazione omologa non allelica (NAHR).

Esempio A1

Riarrangiamento media ricombinazione con un omologia tra il 90 e il 99%.

Questa elevata omologia fa sì che durante gli eventi di apapiamento questi sia sbagliato tra gli LCR.

E’ ricombinazione omologa ma non allelica.

Se c’è un evento di ricombinazione di questo tipo ci sono due prodotti: un prodotto che dà luogo a duplicazione e un

prodotto che dà luogo a una delezione.

NB: l’orientamento delle duplicazioni segmentali è diretto, stesso orientamento

Esempio A2

C’è orientamento opposto.

Con crossing over si ha un’inversione della regione tra le due duplicazioni.

Esempi di regioni genomiche associate a patologie genomiche:

→ Delezione cromosoma 22: sindrome Di George o Sindrome velocardio-facciale

Ipoplasia del timo e delle paratiroidi, cardiopatia congenita anomalie conotroncali

cuore, caratteristiche facciali tipiche, anomalie del palato (labio/palatoschisi), ritardo

nello sviluppo, ritardo del linguaggio . Incidenza 1:5.000.

La delezione non è quasi mai visibile mediante citogenetica classica, nemmeno con

bandeggio ad alta risoluzione.

L’indagine di laboratorio per evidenziare la delezione per evidenziarla è effettuata

mediante FISH con sonde locus-specifiche

→ Delezione del cromosoma 7: sindrome di Williams

Incidenza 1:10.000-20.000

Ritardo psicomotorio

Cardiopatie (solitamente stenosi sopravalvolare dell'aorta)

Profilo cognitivo e comportamentale peculiare

Dismorfismi facciali caratteristici.

Il profilo cognitivo è caratterizzato da deficit visivo-spaziale, che

contrasta con le buone capacità di linguaggio. I bambini affetti

presentano un comportamento ipersociale e interagiscono bene

con le altre persone. Sono molto sensibili al rumore e hanno buone capacità musicali.

42 → Emofilia – X-linked

Mutazione del gene sul cromosoma X che codifica per il

fattore VIII: individuato in pazienti con deficit del fattore

8° emofilia. Non c’è perdita di materiale, ma c’è

un’inversione nell’introne 22.

Cosa rende instabile determinate regioni caratterizzate da riarrangiamenti ricorrenti?

L’instabilità è dovuta alla presenza di motivi di sequenza denominati Duplicazioni segmentali (DS) o LCR (ripetizioni a

basso numero di copie)

2. Escludere la presenza di traslocazioni criptiche in pazienti con RM (sporadico o ricorrente in famiglia) associato a

malformazioni non inquadrabili in sindromi note

3. Permette la caratterizzazione fine di riarrangiamenti strutturali (traslocazioni apparentemente bilanciate,

duplicazioni, delezioni, inversioni, marcatori sovranumerari o più complessi riarrangiamenti) in pazienti che

presentano un quadro clinico sindromico non noto o disordini geneticamente complessi ma clinicamente ben

inquadrati allo scopo di tentare una correlazione tra fenotipo e genotipo

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FISH INTERFASICA

→ FISH effettuata sui nuclei interfasici permette di evidenziare la presenza di aneuploidie

→ Viene utilizzata in diagnostica prenatale per le più comuni trisomie come +13, +18 e +21 e per le anomalie di

numero dei cromosomi del sesso (X, XXY e XYY)

→ Sonde utilizzate sono le sonde per il DNA alfa satellite dei corrispondenti centromeri o sonde locus specifiche.

→ In genere l’analisi citogenetica pre-natale viene effettuata in circa 10 giorni questa tecnica invece risulta molto

rapida (24-48), viene infatti effettuata su amniociti non in coltura.

Con questa tecnica, rispetto all’analisi delle metafasi, si accorciano i tempi.

→Un altro esempio di utilizzo è quando non c’è disposizione di metafasi, in particolare viene utilizzato in cellule

tumorale. In questo caso si utilizzano due sonde, una che copre il 3’ del gene e un’altra che copre il 5’ del

gene, poiché c’è un’interruzione nel mezzo dove sono presenti parecchie sequenze ripetute.

Quando le due sonde colorano insieme significa che il gene è integro, altrimenti ci saranno dei

derivativi cromosomici, dove c’è stata l’interruzione di un determinato gene.

CML: la tecnica della FISH INTERFASICA è usata sulla leucemia mieloide cronica, dopo che il paziente è stato trattato,

per vedere se il cromosoma Philadelphia è residuo o meno, con la possibilità concreta di analizzare più cellule.

Nell’immagine qui a fianco è analizzato il cariotipo di un paziente con una neodisplasia:

nelle cellule tumorali è presente una traslocazione tra cromosoma 1 e cromosoma 7.

C’è un derivativo, con una congiunzione a livello del centromero dei due cromosomi.

Si utilizzano anche qui le sonde centromeriche dei due cromosomi per analizzare più nuclei

possibili → ciò che emerge è la presenza di una traslocazione

FISH su nuclei interfasici

La cromatina nei nuclei interfasici è meno compattata.

Con un locus di riferimento permette di ottenere un ordine centromero-telomero.

Permette in ogni caso di ordinare sequenze nell’ordine di 500kb (range di risoluzione: 50-2Mb)

Utilizzando contemporaneamente tre sonde si ha infatti la possibilità di evidenziare un ordine dei tre loci (nel caso

della presenza di una inversione) diverso da quello atteso.

Identificazione di inversioni criptiche mediante FISH su nuclei interfasici

Si cerca di escludere un riarrangiamento bilanciato che in qualche modo

distrugge i geni coinvolti in una determinata sindrome. Nel caso qui a lato,

mediante FISH su metafasi, non si capiva l’orientamento rispetto a centromeri e

telomeri.

Si utilizzano quindi tre sonde, di cui due contenenti la regione dell’inversione

dante la malattia e una esterna alla regione. In questo modo si noteranno le

eventuali inversioni criptiche.

E’ necessario però osservare diversi nuclei, perché la cromatina possiede diversi ripiegamenti e non sempre è

distinguibile. Si sono trovati alla fine, alcuni nuclei (idonei all’analisi) dove l’inversione è presente ( )

Rilevamento della micro-duplicazione mediante FISH su nuclei interfasitici

In questo caso, la FISH viene utilizzata facendo uso di una sonda che copre il break-

point caratterizzante una malattia.

Si utilizza anche un controllo.

Il mappaggio fisico di specifici loci

1. Mappaggio a bassa risoluzione → FISH su cromosomi metafasici mappaggio fisico dell’ordine di 5 Mb. I cromosomi

metafasici sono condensati e quindi il potere di risoluzione è basso

2. Mappaggio ad alta risoluzione → FISH su cromosomi stirati meccanicamente

Viene effettuata su cromosomi metafasici sottoposti a centrifugazione. Cromosomi sono ancora visibili ma più lunghi.

Potere di risoluzione 0.5-1 Mb

Esempio: sonda che riconosce duplicazioni segmentali

FISH su fibre di cromatina

Si utilizzano soluzioni contenenti detergenti che rompono le proteine e allungano le fibre.

Innanzitutto si utilizzano preparati cromosomici, viene posto poi un fissativo e si strisciano su un vetrino.

Successivamente vengono fatti agire dei detergenti a basse concentrazioni, come l’SDS e il vetrino, mantenuto in

maniera verticale, permette l’allungamento del campione.

Difficoltà: l’allungamento deve essere omogeneo. Due regioni molto vicine tra loro devono essere distinguibili e

bisogna eventualmente stabilire il numero di copie per un particolare gene su un particolare allele.

Preparazione delle fibre:

Si utilizza un cadenza coverslip, che permette alle fibre di allungarsi evitando la loro

rottura e permette l’inserimento del fissativo

A livello dei centromeri per alcuni cromosomi ci sono più famiglie di α-satelliti e, utilizzando questa tecnica, si nota che

alcuni sono interspersi tra di loro. Utilizzando cromosomi di diverse famiglie si vedono segnali sovrapposti nella fibra.

In altri cromosomi questi blocchi che riconoscono diverse famiglie di DNA satellite sono separati, questi utilizzando

sonde diverse saranno chiaramente distinguibili e non sovrapposti.

Nel 2004 si è scoperto che il genoma è estremamente complesso e la complessità che determina la diversità inter

individuale nella stessa specie è dovuta alla presenza di sequenze genomiche che cambiano il numero di copie nei vari

individui e il loro orientamento.

Esempio sul cromosoma 1 c’è il gene dell’ α-amilasi.

Sonde usate in FISH

Il limite della FISH

La FISH è una tecnica estremamente duttile applicabile in molteplici campi non sol diagnostici, ma anch’essa ha un

limite molto grande rispetto alla citogenetica.

Bisogna sapere a priori la regione da investigare, a meno che non si ha qualche indizio utile quale ad es nella

situazione in cui il paziente presenta un quadro clinico noto associato ad una precisa regione/gene che non sembra

apparentemente coinvolto.

Molto più spesso esistono situazioni patologiche che sospettano fortemente il coinvolgimento di un riarrangiamento

cromosomico con un quadro clinico però non assimilabile a patologie ad eziologia nota. In queste situazioni non è

possibile utilizzare queste tecniche perché non sappiamo quale regione potrebbe essere coinvolta.

Soluzione: utilizzo di tecniche di ibridazioni comparativa CGH e array-CGH (Comparative Genomic H)

La tecnica dell’CGH

E’ una tecnica che consiste nella comparazione delle intensità

relative dei fluorocromi evidenziando le variazioni nel numero di

copie di DNA tra i DNA test e di controllo.

L’intensità di ibridazione in una data localzizazione è, idealmente,

direttamente proporzionale al numero di copie delle sequenze nel

DNA test e DNA reference.

Aumento o diminuzione dell’intensità relativ di ibridazione indica

un aumento o diminuito numero di copie rispetto al contrllo.

Questa tecnica è stata messa a punto per anomalie numeriche sui

tumori, dove spesso non c’è possibilità di analizzare metafasi.

Essa prevede l’utilizzo in contemporanea di due tipi di DNA

marcato: un DNA reference marcato con un tipo di fluorocromo e

la stessa quantità di DNA tumorale marcato con un altro

fluorocromo.

Esse vengono contemporaneamente ibridati su metafasi normali

non del paziente; successivamente, in base all’intensità dei segnali

si capirà se si trova in una normale condizione.

Se si presenta un segnale maggiore rispetto all’altro questo può essere indice della presenza di un numero diverso di

copie tra reference e tumore.

Esempio:

maggiore reference in rosso → le delezioni sul tumore avranno il rosso più intenso rispetto al verde

maggiore tumore in verde → ci sono più copie del tumore rispetto al reference

Se uso array e non le metafasi prende nome di array-CGH.

Dalla CGH, con risoluzione di 10-5Mb, utilizzata maggiormente sui tumori e non tanto sulla citogenetica costitutiva

(applicata a individui con un riarrangiamento cromosomico), si usano array.

La tecnica del CGH-array

Gli array si ottengono spottando 60 oligonucleotidi e, in

base al numero di nucleotidi che coprono il genoma,

aumenterà la risoluzione.

Da 1Mb a 1Kb di risoluzione.

NB: trova solamente variazioni numeriche, no

traslocazioni/delezioni bilanciate

Ciò che compare sul software è un profilo abbastanza

stretto su quel valore definito zero, dove le sonde sono rappresentate in logaritmo in base 10.

LA GENETICA DEL DIFFERENZIAMENTO SESSUALE

1. Determinazione del sesso gametico → Il differenziamento del sesso è regolato da eventi innescati a catena che

iniziano col diverso assortimento, indipendente e casuale dei cromosomi (XX o XY).

2 Determinazione del sesso gonadico →.Successivamente si determina il sesso gonadico (Ovaio o testicolo)

3. Determinazione del sesso fenotipico →La produzione delle gonadi e degli ormoni determinano il differenziamento

del sesso fenotipico che coinvolge sia genitali interni sia genitali esterni

4. Acquisizione dell’identità del sesso di genere, maschile o femminile

DETERMINAZIONE GENOTIPICA DEL SESSO

Nella determinazione del sesso ha ruolo chiave il padre, che viene definito eterosomico.

Si può avere una femmina normale XX (sesso omogametico)

si può avere un maschio normale XY (sesso eterogametico)

Tutti gli individui, aventi almeno un Y, possiedono un sintomo caratterizzante il sesso maschile.

- XY maschio normale → è il genotipo necessario per lo sviluppo corretto

- XXY maschio ‘normale’ – Klinefelter

- XXXXY Sindrome severa di Klinefelter

Tutti gli individui, non aventi nessuna Y, avranno fenotipo femminile.

- XX femmina normale

- X fenotipo femminile – infertile (Turner)

- XXX normale, femmina (triplo X)

Il cromosoma X Possiede più di mille geni, alcuni dei quali hanno importanza nella riproduzione, altri nel

differenziamento sessuale, altri hanno funzioni specialistiche (esempio ritardo mentale), e

altri ancora sono housekeeping.

E’ altamente conservato tra le specie, sia per estensione dell’ordine dei geni lungo i

cromosoma sia per il suo contenuto genico.

Rispetto agli autosomi c’è un aumento della frequenza di geni coinvolti nella determinazione del sesso e riproduzione

molti di essi sono coinvolti nel ritardo mentale x-linked.

Il cromosoma Y

Molto piccolo, ha pochi geni di cui solo 50 sono funzionali, alcuni sono X-Y linked, altri Y specifici.

La parte distale del braccio lungo, e quindi la maggior parte del DNA del cromosoma Y, è costituita

da eterocromatina e di sequenze ripetute. L'eterocromatina non è codificante, quindi la sua variabilità in

dimensioni da individuo a individuo non comporta evidenti effetti dannosi. Anche in altri Mammiferi il

cromosoma Y è quello più povero di geni. È approssimativamente lungo un terzo del cromosoma X, quindi la maggior

parte dei geni presenti sull'X non ha il proprio corrispondente sul cromosoma Y.

Le regioni pseudoatosomiche (PAR) Questi due cromosomi possiedono piccole regioni alle

estremità del braccio corto e una piccola parte al

centro che prendono il nome di regioni

pseudoautosomiche, in quanto su entrambi i

cromosomi sono presenti gli stessi geni funzionanti.

NB: le regioni pseudoautosomiche sono sempre

funzionanti, non subiscono inattivazione perché si

bilanciano con i geni di Y.

Il cromosoma Y, pur essendo considerato omologo di X,

non è in grado di effettuare crossing over con esso

durante la meiosi, eccetto che per le regioni PAR, situate a livello dei telomeri di entrambi i cromosomi.

PAR1: mappata sul braccio corto (p), è sempre coinvolta nel crossing over e la sua perdita è associata a infertilità

maschile.

PAR2: mappata sul braccio lungo (q), può non essere presente sul cromosoma Y e non sempre è coinvolta nel crossi

Il confine tra le due regioni cade in una regione di un gene che codifica per il sangue.

Su X: presente in modo continuo, il boundary della PAR1 umana è nel gene del gruppo sanguigno XG.

Su Y: presente in modo troncato, i gene che controlla l’inizio del differenziamento sessuale (SRY) si trova a sole 5Kb dal

confine.

Le regioni pseudoautosomiche non sono le uniche zone di omologia tra X e Y, ci sono infatti altri geni lungo X e Y che

presentano regioni omologhe.

Quelli riguardanti la Y sono contrassegnati con delle sigle che terminano con le lettere Y, allo stesso modo quelle

riguardanti la X sono contrassegnati con sigle terminanti con X.

Sull’X questi geni sono funzionali, espressi.

Su Y alcuni sono pseudogeni, vengono indicati anche con lettera P (Pseudogene)

La regione PAR1 è in contatto con le regioni sesso-specifiche dei cromosomi X e Y, delle quali sono riportati i primi

geni. Il confine tra le due regioni è a cavallo del gene per il gruppo sanguigno XG. la cui estremitò 5’ si trova dunque

nella PAR1 e l’estremità 3’ nella regione specifica dell’X, mentre l’omologo sul cromosoma Y, è tronco a livello dei

primi esoni.

La regione adiacente specifica dell’Y contiene sequenze prive di omologia sull’X, tra cui i geni SRY e RSP4Y.

Geni comuni suggeriscono una comune storia evolutiva.

I cromosomi sessuali sono evoluti da una coppia di cromosomi omomorfici a cui sarebbe seguita una storia

indipendente (inversioni e trasposizioni duplicative)

Studiando l’evoluzione di X e confrontando l’omologia di sequenza con altri

animali si è notato che il braccio lungo di X è quello più conservato.

Qui è presente sintenia a livello di specie, ad esempio con quella dei

marsupiali.

Il braccio corto di X invece rappresenta la parte più giovane dal punto di vista

evolutivo e contiene le regioni che ha in comune con il cromosoma Y.

S1: Regione ancestralmente più vecchio

S2, S3: più recenti

S4, S5: più recenti, vicini alla regione pseudoautosomica

1. Differenziazione dei cromosomi sessuali

Il cromosoma sessuale Y si è evoluto molto più

velocemente dell'altro cromosoma sessuale,

l'X, tanto da "perdere per strada" numerosi

geni. E se la velocità di cambiamento

continuerà allo stesso ritmo, il cromosoma Y è

destinato a scomparire.

Nei mammiferi euteri, o placentati, i

cromosomi sessuali contengono una regione

di DNA addizionale, che nei mammiferi

marsupiali e monotremi è collocata su

cromosomi non sessuali.

All'inizio, frammenti di DNA all'interno di

questa regione addizionale venivano scambiati

fra i cromosomi X e Y, ma fra gli 80 e i 130

milioni di anni fa la regione si è trasformata in

due entità completamente separate che non si

scambiano più DNA. Una delle regioni è divenuta

specificamente associata al cromosoma X, l'altra al

cromosoma Y.

Oggi il cromosoma Y umano contiene meno di 200

geni, mentre l'X ne contiene circa 1100.

Sappiamo che pochi geni sull'Y sono importanti,

come quelli coivolti nella formazione degli

spermatozoi, ma sappiamo anche che la maggioranza

dei geni non era importante per la sopravvivenza,

dato che sono andati perduti. Sebbene ci siano prove

che il cromosoma Y stia ancora degradandosi, alcuni

dei geni su di esso possono essere essenziali, cosa

che possiamo inferire dal fatto che questi geni si

siano conservati così a lungo.

I ricercatori ritengono che sia possibile che alla fine il cromosoma Y sparisca completamente. Se ciò avverrà, non sarà

comunque la fine dei maschi.

IL CROMOSOMA Y

Nel 1990 il gene che codifica per il fattore determinante lo sviluppo del testicolo è stato isolato nell'uomo e nel topo. Il

gene umano è stato chiamato SRY (sex-determining region of the Y chromosome),

Esistono tre classi di geni sul cromosoma Y:

→ Geni in comune con il cromosoma X che mappano nelle regioni pseudoautosomiali PAR

→ Geni simili a geni che si trovano sull’X, identificati con la dicitura X-Y

→ Geni unici del cromosoma Y che includono il gene SRY (TDF) e i geni delle regioni AZF, deputati

alla spermatogenesi. Delezioni di queste regioni causano infertilità.

La delezione della regione AZF viene presa in considerazione e valutata quando si presentano pazienti manifestanti

azoospermia. Esso vengono sottoposti a PCR multiple allo scopo di confermare o smentire queste delezioni.

In questi casi vengono usati contemporaneamente copie di primer,

successivamente l’amplificato è confrontato con un DNA di controllo di

maschio normale non affetto da azoospermia.

Tra controllo, rappresentato dal maschio sano, e maschio azoospermico

risulterà una differenza: nel campione dell’affetto ci saranno infatti bande

delete che nell’uomo normale non ci sono (nel caso dell’immagine è deleta

AZFb, normalmente l’azoospermia è caratterizzata da AZFa).

Nei casi di azoospermia, infatti, l'analisi genetica ha portato all' identificazione

di microdelezioni di geni localizzati nei loci non polimorfici del gene AZF (AZFa,

AZFb e AZFc)

SRY:

Nature → il ruolo di SRY è determinante testicolare e il suo ruolo venne inequivocabilmente provato da un

esperimento nel topo: topi transgenici XX Sry-positivi, contenenti una o più copie sull’omologo murino di SRY,

sviluppano gonadi (disgenetiche) maschili e un fenotipo maschile.

→ è un fattore trascrizionale che serve alla proteina a interagire direttamente con DNA

→ Singolo esone: la sequenza codificante (ORF, open reading frame) del trascritto sia murino che umano è costituita

da un singolo esone

→ Dominio HMG: Sry codifica per una proteina che presenta un dominio di legame con il DNA, caratteristico delle

proteine High Mobility Group e perciò chiamato HMG.

La HMG box di Sry è altamente conservata in tutti i mammiferi in cui è stata sequenziata, e sono state trovate

mutazioni di questa regione associate a reversione del sesso

∎ Il 20% dei pazienti femmine 46 XY con sindrome di Swyer presentano una mutazione nel gene SRY. In questo caso

le ovaie non funzionano, l’utero sì.

∎ Traslocazione di parte del cromosoma Y contenente SRY sul cromosoma X causa maschi 46XX.

Entrambi, femmine 46XY e maschi 46XX, sono mutanti non voluti (non creati in laboratorio), che dimostrano la

funzione di SRY come primo fattore di determinazione del sesso maschile.

La traslocazione avviene nel momento in cui c’è appaiamento tra PARX e PARY, e poiché le regioni confinanti sono

ricche di duplicazioni segmentali, ciò favorisce che SRY traslochi sul cromosoma X.

2. Determinazione del sesso gonadico

SRY (Sex-determining Region Y) è un gene codificante per il fattore di determinazione del testicolo TDF (Testis-

determining factor),proteina che agisce quale fattore di trascrizione che determina il differenziamento della gonade in

senso maschile durante lo sviluppo embrionale. È membro della famiglia dei geni SOX (SRY-like-box) i quali codificano

per proteine leganti il DNA.

Il ruolo chiave di SRY è quello di dar luogo alla nascita delle gonadi che daranno ormoni, che funzioneranno

successivamente al differenziamento fenotipico.

Fino alla sesta settimana di gestazione le gonadi non sono ancora differenziate; ci sono infatti sia i dotti Mulleriani che,

se vengono differenziati, danno luogo a organi interni femminili, sia i dotti di Wolf che, se si differenziano, danno

luogo a organi interni maschili.

I dotti genitali (o gonodotti) sono le strutture attraverso le quali i gameti vengono portati all'esterno o comunque nel

sito dove avverrà la fecondazione.

Due paia di gonodotti si sviluppano in entrambi i sessi: i dotti mesonefrici o di Wolff e i dotti paramesonefrici o di

Müller. Quando la gonade bipotenziale inizia il suo differenziamento, una delle due strutture degenera, mentre l'altra

evolve nei gonodotti propri del sesso dell'embrione. La presenza di SRY determina il differenziamento

dell’embrione verso il sesso maschile e la produzione

dai testicoli fetali di due ormoni da parte dei cellule del

Sertoli (ormone anrimulleriano) , che portano alla

degenerazione del dotto di Muller.

D’altra parte, le cellule di Laydig (secernono

tesosterone) fanno differenziare il dotto di Wolf.

L’assenza di SRY determina che il dotto di Wolf

degeneri e quello di muller dia luogo alle strutture

femminili.

L’esperimento di Jost

Allo scopo di scoprire il nesso tra il differenziamento delle gonadi e quello dei genitali il professore Alfred Jost

condusse un esperimento sui conigli.

Egli rimosse le gonadi da embrioni di coniglio femmine: non succedeva nulla.

Fece lo stesso con embrioni di coniglio maschio: i feti si differenziavano in femmine.

Ciò che concluse è che la natura realizza spontaneamente il fenotipo femminile anche senza ormoni, il testicolo deve

secernere un qualcosa che inibisca il differenziamento spontaneo femminile.

Si pensava che il differenziamento femminile fosse un differenziamento di default. in realtà non è così, perché

esistono anche nel differenziamento femminile processi che ne mantengono il patway che vedono a capo gli

estrogeni.

Gli estrogeni, la cui fonte è materna e placentare, operano allo scopo di differenziare i dotti di Muller (tube di Fallopio,

utero, porzione superiore della vagina) e differenziamento dei genitali esterni (labbra, clitoride, porzione inferiore

della vagina.

Abbiamo quindi tre fasi:

→ Fase indifferenziata: prevede la distinzione della linea somatica da quella geminale e la migrazione delle cellule

germinali primordiali dalla cavità celomatica alla crescita urogenitale.

→ Fase di differenziamento gonadico: se è presente SRY ci sarà un differenziamento sostenuto da alcuni geni in

direzione dello sviluppo dei testicoli e contrastato da altri geni.

L’attivazione di SOX9, mantenuto e attivato dalla propria trascrizione, e l’innesco di altri geni permette la formazione

delle cellule di Sertoli (ormoni antimulleriani) e delle cellule del Laydig, che produce testosterone.

Differenziamento dei genitali esterni: l’AMH (Antimulleriano) e il testosterone portano al differenziamento

maschile dei genitali interni ed esterni.

Esistono patologie che coinvolgono il differenziamento sessuale che sono state individuate nell’uomo.

SOX9: se c’è la perdita di funzione dà luogo a femmina XY

-Aploinsufficienza di SF1, WT1 e SOX9 causano XY sex reversal. * → se c’è delezione di SOX9 ci saranno casi con

fenotipo femminile e cariotipo maschile.

-Acquisizione di funzione di DAX1 determina XY sex reversal*

-Perdita di funzione di WNT4, FOXL2 determina XX sex reversal *

*(termine non più utilizzato, si parla di disturbi dello sviluppo sessuale)

NB: Tutto ciò indica che il processo di formazione delle ovaie non è “default” ma avviene con l’intervento di geni

soppressori dello sviluppo testicolare.

La determinazione del sesso - la decisione se la gonade primordiale bipotente diventerà un testicolo o ovaio - è un

processo di sviluppo strettamente controllato e molto complessa.

Esistono quindi geni antagonisti coinvolti nel differenziamento maschile che inibiscono il differenziamento sessuale

femminile e viceversa.

Il quadro che emerge è che l’iniziale decisione che determina il sesso non è definitiva, ma deve essere affermata per

tutta la vita sopprimendo il programma di differenziazione sessuale opposto.

Così, mentre la determinazione del sesso iniziale sembra essere il risultato dell'attivazione unilaterale del pathway

maschile in cui SRY attiva Sox9, il successivo mantenimento del destino gonadico può essere visto come una battaglia

tra il network dei geni regolatori "maschili " (Dmrt1, Sox8 e Sox9) e i due network di geni regolatori " femminili " che

coinvolgono il signaling di Foxl2 e Wnt / b-catenina.

Un equilibrio critico tra questi percorsi conflittuali spiega le proprietà primordiale bipotente delle cellule riproduttive.

Se l'equilibrio viene ribaltato in una o l'altra direzione, come conseguenza, si ha l'attivazione del pathway di

determinazione del sesso maschile o femminile nell'embrione.

La dimostrazione

Andando a costruire KO condizionali per DMRT1 (pro differenziamento sessuale maschile) si è visto infatti che,

spegnendolo in diversi momenti, sia nel topo sia nell’uomo c’è la perdita della regolazione negativa dei geni femminili

e, a livello delle cellule del Sertoli, c’è un transdifferenziamento in cellule della granulosa.

La stessa cosa avviene facendo l’esperimento su FOXL2, quando viene silenziato c’è transdifferenziamento delle

cellule della granulosa in Sertoli e Laydig.

1.Disordini dello sviluppo sessuale gonadico:

Condizioni in cui si ha discordanza fra sesso genetico, sesso gonadico e sesso fenotipico.

Sindrome Adreno Genitale o iperplasia congenita del surrene è una malattia ereditaria che colpisce entrambi i sessi. Si

chiama anche iperplasia congenita del surrene.

E’ causata da un difetto enzimatico trasmesso geneticamente, che riguarda la sintesi di due importanti ormoni: il

cortisolo e l’aldosterone, prodotti nelle ghiandole del surrene.

Il cortisolo è il principale ormone della famiglia dei glucocorticoidi: ha l’effetto di aumentare la degradazioe dei grassi

e delle proteine e di indurne la trasformazione in zuccheri e riserve di glicogeno.

L’aldosterone è il principale ormone della famiglia dei mineralcorticoidi. Agisce sul rene, dove regola l’assorbimento di

sodio e l’escrezione di potassio, contribuendo così a regolare la quantità di sali presenti nell’organismo. I

mineralcorticodi e i glucocorticoidi sono prodotti nelle ghiandole surrenali e riversati nel sangue, dove vanno ad agire

su diversi organi e tessuti.

Nella forma più frequente di S.A.G. (circa il 95% dei casi) l’alterazione genetica consiste nel deficit dell’enzima 21-

idrossilasi. La 21-idrossilasi è responsabile di una delle tappa che portano alla sintesi di cortisolo e aldosterone

(ormoni prodotti dalle ghiandole surrenali); il deficit dell’enzima blocca quindi la "catena di montaggio" che

normalmente porta alla produzione di questi ormoni. ad una ridotta sintesi di questi ormoni.

Di conseguenza, si accumulano i composti intermedi, che dovrebbero essere trasformati dall’enzima. Il principale di

questi è 17 idrossi-progesterone.

L’ipofisi (la "centralina" di regolazione ormonale dell’organismo, situata sotto il cervello) registra inoltre l’ assenza in

circolo di cortisolo e produce ACTH, o ormone adrenocorticotropo, che stimola le ghiandole surrenali ad iniziare le

tappe di produzione di cortisolo. Stimolate dal ACTH Le ghiandole si ingrossano (iperplasia del surrene) e potenziano la

"catena di montaggio " del cortisolo, aggravando quindi l’accumulo di 17 idrossi-progesterone.

Dal 17 idrossi-progesterone derivano anche gli ormoni sessuali maschili (androgeni); perciò l’accumulo di 17 idrossi-

progesterone porta ad un aumento di androgeni, che può portare a virilizzazione, cioè la tendenza, anche per le

femmine, ad acquisire caratteri sessuali maschili

2. Disordini dello sviluppo sessuale post-gonadico:

Condizioni in cui si ha concordanza fra sesso genetico e sesso gonadico, ma discordanza fra sesso gonadico e sesso

fenotipico. Questi disordini coinvolgono la produzione e l’azione degli ormoni coinvolti nel differenziamento sessuale

fenotipico..

→Sindrome da insensibilità agli androgeni

(sindrome della femminilizzazione testicolare)

Condizione X-linked dovuta a carenza del recettore degli androgeni AR.

Le mutazioni prevedono: puntiformi missenso o nonsenso, insrzioni o delezioni di nucleotidi che alterano il modulo di

lettura, delezioni parziali del gene (rari).

Mutazioni introniche con conseguenze sullo splicing dell’RNA.

Tutto ciò comporta il riscontro di un’amplia variabilità fenotipica che va dalla femminilizzazione completa (Sindrome di

Morris), a forme intermedie con ambiguità genitale (Sindrome di Reifenstein) a forme lievi con fenotipo maschile e

infertilità.

C’è resistenza agli androgeni.

XY producono antimulleriani, c’è tesosterone che dovrebbe agire a livello dei dotti di Wolff per poterli differenziare,

ma questo non avviene perché c’è una mutazione a livello del recettore del testosterone. Ciò comporta la perdita

completa del funzione del recettore o parziale

→ Perdita completa di funzione: sindrome di 46XY ma con fenotipo femminile: sindrome di Morris

Un soggetto affetto da sindrome di Morris presenta le seguenti caratteristiche:

•Caratterizzata da cariotipo maschile XY

•Genitali esterni femminili

•Pieno sviluppo delle mammelle

•Scarsità di peli ascellari e pubici

•Alta statura

•Vagina a fondo cieco

•Assenza di genitali interni

•Presenza di testicoli disgenetici

variamente posizionati nelle pelvi, nel

canale inguinale o nelle grandi labbra

La diagnosi di questa sindrome talvolta

non avviene alla nascita.

Gli ormoni antimulleriani distruggono i

dotti di Muller, ma mancano i recettori, quindi ci sono i testicoli, che sono spesso scambiati con ernie (pseudoernie

inguinali), dal momento che i testicoli si posizionano nel canale inguinale.

E’ presente la formazione della vagina a fondo cieco.

Queste donne sono donne normali, ma le gonadi vanno rimosse perché la possibilità che si sviluppi un

gonadoblastoma è molto alta.

→ Perdita parziale


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie mediche
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher serena.savoldi di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica umana e medica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Finelli Palma.

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