Genetica medica

Genetica medica

La genetica medica studia le malattie che hanno causa scatenante essenzialmente ereditaria. Uno degli approcci della genetica medica è la consulenza genetica. Grazie alle scoperte della genetica medica, è ora possibile eseguire studi che prevedono l'incidenza di una certa patologia su un individuo.

Ambiti della genetica medica

La genetica medica si occupa quindi prevalentemente di:

• Malattie ereditarie: qualsiasi malattia che si trasmette ai figli, partendo da genitori malati o semplicemente portatori sani; implica sempre la presenza di una malattia genetica e la mutazione deve colpire, quindi essere presente, nel genoma delle cellule germinali dei genitori e non solo in quelle somatiche affinché venga trasmessa alla prole.
• Malattie congenite: malattie già presenti alla nascita, ma non genetiche, in quanto può essere stata contratta e poi trasmessa dalla madre al figlio durante la gestazione oppure durante il parto (es.: sifilide).
• Malattie genetiche: malattie causate da alterazioni del genoma (mutazioni), quindi mutazioni geniche, cromosomiche, mitocondriali; sono malattie genetiche anche le neoplasie, perché dipendono da una mutazione genetica ex-novo, ma date dall'interazione tra genoma e ambiente, quindi sono multifattoriali.

Genetica

Il corredo genetico umano è formato da 46 cromosomi: 23 coppie di omologhi, ovvero 22 autosomi e una coppia di cromosomi sessuali (XX per le femmine e XY per i maschi). I cromosomi si vedono in metafase, perché è la fase del ciclo cellulare in cui la cromatina è più condensata e spiralizzata.

Il genoma è organizzato in triplette o codoni, cioè ogni tripletta codifica per un amminoacido: gli amminoacidi sono i mattoncini che formano le proteine. Esistono anche codoni di inizio e di stop.

Il genotipo è la costituzione genetica dell'individuo; il fenotipo è la manifestazione dell'interazione tra genoma e ambiente; il fenotipo clinico indica una patologia.

Esiste un genoma extranucleare, ovvero il mitocondriale che si trova dentro i mitocondri, organelli responsabili della produzione di energia della cellula e che hanno delle molecole circolari di DNA: di questi nella cellula ce ne sono centinaia.

Mentre a livello nucleare abbiamo la struttura del DNA spiralizzata in cromosomi, a livello mitocondriale abbiamo molecole a doppio filamento circolari.

Il codice genetico è caratterizzato da una ridondanza, è degenerato, cioè non c'è una corrispondenza "una tripletta-un amminoacido", ma in realtà ci possono essere più triplette diverse che codificano per uno stesso amminoacido.

Struttura di un gene

È una sequenza di basi di DNA che dirige la sintesi proteica, è l'unità funzionale del genoma ed è formato da:

• Esoni (porzione codificante di DNA)
• Introni (porzione non codificante di DNA, poi rimossa attraverso il processo di splicing)
• Promotore (regione a cui si attacca la RNA polimerasi per attivare la trascrizione)

Il locus cromosomico è la posizione fisica del gene d'interesse nel cromosoma. Gli alleli sono le forme alternative di un gene, cioè un gene può avere una sequenza o una sequenza con una sua variante e derivano uno da origine materna e uno da origine paterna. Se il carattere/malattia espresso da un gene è dominante, allora basta un allele perché si esprima nel fenotipo; se il carattere è recessivo, allora sono necessari entrambi gli alleli per l'espressione nel fenotipo. Un eterozigote è un individuo con alleli diversi in uno stesso locus sui due cromosomi omologhi: Aa; un omozigote è un individuo con alleli identici in uno stesso locus sui due cromosomi omologhi: AA/aa.

La regione del promotore a 5' del gene ha delle sequenze caratteristiche che sono le CCAT boxes e le TATAA boxes, sequenze ripetute che servono per l'attacco dei macchinari di trascrizione al DNA. La trascrizione viene attivata a partire dal codone d'inizio ATG, cioè tutti i trascritti iniziano con ATG che codifica per l'amminoacido metionina.

GT e AG sono porzioni introniche e sono caratteristiche, perché si trovano sempre a 5' e a 3' di ogni introne: GT a 5' e AG a 3'. Esse indicano dove i macchinari di splicing si devono attaccare per tagliare gli introni e unire gli esoni per costruire poi il trascritto maturo, cioè quello che andrà a codificare per la proteina. I codoni di terminazione o di stop sono sequenze che indicano la fine della proteina e possono essere di tre tipi: UAG, UAA, UGA.

Tappe dell'espressione genica

• Nucleo con doppia elica di DNA → il DNA si replica e attiva la trascrizione → RNA esce dal nucleo → subisce maturazione (splicing) → RNA maturo tradotto in proteica

La regolazione dell'espressione genica può essere pre-trascrizionale o post-trascrizionale: entrambi i meccanismi creano un'alterazione della quantità della proteina prodotta, perché, a seconda di quanto viene prodotto il trascritto maturo, avremo una corrispondenza in quantità di proteina. La proteina però verrà anche degradata, dunque la sua quantità non solo dipende dalla quantità di trascritto, ma anche da quanto viene degradata: perciò c'è un meccanismo sia pre-trascrizionale che post-trascrizionale, proprio per determinare l'esatta quantità necessaria.

Regolazione pre-trascrizionale

Ci sono delle sequenze all'interno del promotore che servono proprio per regolare la quantità di produzione del trascritto che sono le TATAA boxes e CCAT boxes. Inoltre ci sono gli enhancers, delle porzioni di regolazione che aumentano la trascrizione del gene, quindi promuovono una maggiore trascrizione del gene; possono essere anche lontani dal gene stesso come posizione genomica.

Un altro meccanismo di regolazione pre-trascrizionale è la metilazione, un processo epigenetico, cioè non viene cambiata la sequenza del DNA, ma viene apportata una modifica al DNA, aggiungendo dei gruppi metile; quando un promotore è metilato, l'espressione viene solitamente annullata o diminuita, a seconda della percentuale della metilazione. Comunque l'aggiunta di gruppi metile serve a "spegnere" l'espressione del gene, quindi anche questo regola la produzione e quantità di proteina finale.

Ci sono anche delle proteine specifiche che fanno da repressore trascrizionale, quindi che legandosi provocano una diminuzione del trascritto.

Regolazione post-trascrizionale

Consiste nella degradazione dell'mRNA, perché il trascritto maturo viene non solo prodotto, ma anche degradato, quindi questo corrisponde a una mancanza della proteina. Inoltre, se si vanno a vedere nel dettaglio le modifiche fatte al trascritto, abbiamo inizialmente il gene, in seguito la trascrizione e poi vengono fatte tutta una serie di modifiche prima che il filamento maturo possa passare nel citoplasma ed essere tradotto: queste modifiche consistono nell'addizione a 5' di un cap all'RNA e di una poli-A, cioè una ripetizione di A (adenina). Gli introni vengono tagliati e viene riunita solo la parte codificante: a questo punto il trascritto maturo viene esportato e avviene la traduzione.

Malattie genetiche

Quando si parla di malattie genetiche si parla di malattie causate da alterazioni nel genoma di un individuo e possono essere:

• Cromosomiche: quando c'è un'alterazione del numero o della struttura del cromosoma (esempio di anomalia numerica è la sindrome di Down o Trisomia 21; alterazione della struttura significa che il numero di cromosomi è comunque 46, ma può esserci una delezione, duplicazione, traslocazione, etc.). Le alterazioni possono essere più grandi e visibili con l'esame del cariotipo.
• Geniche: dovute all'alterazione di basi del DNA che costituiscono la doppia elica. In questo caso, le alterazioni possono essere più piccole e visibili con un sequenziamento delle basi, nel quale risulta un'alterazione.
• Mitocondriali: dovute a un'alterazione del DNA mitocondriale.
• Multifattoriali: dovute a una combinazione di fattori interni ed esterni, quindi alterazioni del DNA (suscettibilità individuo) insieme all'ambiente. Esempi di malattie multifattoriali sono i tumori (campana gaussiana → pochi solo ereditari e solo ambientali, molti genetici+ambientali).

Mutazioni puntiformi

Alterazioni di basi del DNA che danno origine a malattie geniche:

Alterazione della qualità

• Sostituzione: in una porzione esonica, quindi codificante, può avere tre tipi di effetti, a seconda delle conseguenze che ha sulla sintesi proteica. Può essere una mutazione silente (che non provoca niente; ad esempio, se abbiamo un codone TGT che viene trasformato in TGC attraverso sostituzione, nonostante sia cambiata una base del DNA, l'effetto non cambia, perché entrambi i codoni codificano per lo stesso amminoacido → cisteina; a livello della proteina che andrà a svolgere diverse funzioni all'interno della cellula, non cambia niente; non sono varianti che andranno a creare fenotipi clinici, perché fanno parte di una normale variazione del genoma della popolazione sana; sono polimorfismi); missenso (cambia di senso, perché si ha una sostituzione di un nucleotide che quindi dà un altro amminoacido; ad esempio, se TGT cambia in TGG, codifica per un altro amminoacido; non è sempre patogenetica, perché se si cambia un amminoacido con un altro delle stesse dimensioni e proprietà chimico-fisiche simili, può essere che la proteina non ne risenta e quindi sia compatibile con un fenotipo normale; se invece si cambia un amminoacido come la cisteina, quindi piccolo, con un altro più grande e di caratteristiche chimico-fisiche diverse, l'effetto patogenetico ci può essere); non senso (viene sempre sostituito un nucleotide, però viene trasformato una tripletta in un codone di stop; ad esempio, se da TGT codificante per la cisteina, si passa a TGA che è un codone di stop, la proteina che ne risulta sarà più corta del normale e quindi non funzionale; solitamente sono patogenetiche, ma se lo stop avviene alla fine della sequenza, nell'ultimo esone, la proteina può essere compatibile con la normalità).
• Delezioni/inserzioni: perdita/inserimento di uno o più nucleotidi; le conseguenze possono essere più o meno gravi, a seconda della quantità di nucleotidi che viene persa o inserita; ad esempio, se perdo un numero di nucleotidi pari a 3 o multipli di 3, perdo solo quell'amminoacido (o multipli), mentre il resto della proteina è sano (vale anche per inserzioni; del/ins in frame, ovvero in cornice di lettura); se viene perso/inserito un nucleotide oppure non multipli di 3 si parla di mutazioni frameshift (slittamento della cornice di lettura; conseguenza è la produzione di una proteina incompleta, tronca, quindi patogenetica); tra le in frame e le frameshift sono più patogenetiche le frameshift; se una proteina svolge una funzione, ha all'interno delle porzioni di amminoacidi che si chiamano domini funzionali che sono quelli che svolgono la funzione, quindi se ho una mutazione interdominio non cambia nulla, se avviene nel dominio sarà patogenetica.
• Mutazioni di splicing: fondamentali per il meccanismo di splicing sono le basi di segnalazione dello splicing, alla giunzione introne-esone, a 5'-3' dell'introne; sono basi GT (a 5') e AG (3') che si trovano nel pre-mRNA al quale vengono tagliati poi gli introni attraverso l'esistenza di queste basi, per poi legare le porzioni codificanti andando a creare il trascritto maturo; quando c'è una mutazione nelle basi GT e AG, il macchinario di splicing andrà a tagliare alla prossima base di segnalazione che trova, quindi nel trascritto maturo verrà a mancare un esone (skipping dell'esone → esclusione dell'esone), dunque la proteina da quel punto in poi sarà diversa e probabilmente tronca; l'effetto di una mutazione di splicing ha come conseguenza lo skipping dell'esone; lo splicing è quel processo per cui dal DNA si arriva all'RNA maturo attraverso un taglio di introni e riunione di esoni; quando c'è una mutazione di splicing significa che coinvolge le basi di splicing che stanno a 5' e a 3' dell'introne e sono GT e AG; se la mutazione avviene a livello delle coppie di basi di splicing che stanno a 3', l'effetto è quello di non includere un esone nel trascritto maturo e quindi la proteina prodotta sarà molto probabilmente una proteina tronca, in quanto si creerà da lì in poi una proteina completamente diversa con uno stop più o meno prematuro; è come l'effetto di una frameshift; invece se la mutazione avviene a 5', cioè coinvolge coppie di basi GT, succede che le proteine dello splicing arrivano a 5' e non possono tagliare, perciò vanno al prossimo controllo e tagliano, quindi la conseguenza è che un introne viene incluso nell'RNA maturo, perciò in questo caso avremo un frameshift, perché slitta la cornice di lettura, lo stop sarà prematuro e la proteina prodotta sarà tronca e non funzionale.

Alterazione della quantità

• Mutazioni del promotore o degli enhancers: una mutazione in questi livelli altera la quantità di espressione, perciò il gene risulta essere espresso troppo o troppo poco, quindi la proteina in sé è corretta, ma ne avremo più del normale o meno del normale.

Convenzioni per indicare una mutazione

Ad esempio, nel caso ci sia una missenso, nel referto posso indicarla così:

• In base alla sequenza genomica: G.76AT (in posizione genomica 76 ho una sostituzione di una A con una T)
• In base al cDNA: C.76AT (posizione nucleotidica 76 a partire da ATG, calcolata sul filamento complementare all'RNA maturo, quindi il filamento sarà più corto rispetto alla sequenza genomica essendo privo di introni)
• In base al DNA mitocondriale: M.76AT
• In base al filamento di RNA: R.76AT
• In base all'amminoacido della proteina: possono essere indicati con una singola lettera o con un codice a tre lettere, per esempio L76A (o Leu76Arg) significa che l’aminoacido 76 è stato cambiato da leucina in arginina. Se sono in posizione 76 amminoacidica, dovrò moltiplicare per 3 per sapere in che posizione nucleotidica mi trovo.

Identificazione dei cromosomi

I cromosomi si distinguono l'uno dall'altro in base alla posizione del centromero e all'alternarsi di bande chiare e bande scure, colorazione che si vede al cariotipo, analisi di numero e struttura dei cromosomi con risoluzione dalle 5 alle 10000 bp e che permette di avere un panorama completo di quello che è l'assetto cromosomico di un individuo.

Dopo aver svolto le prime fasi del cariotipo, cioè aver bloccato cromosomi in metafase, aver fatto scoppiare le membrane nucleari per poter apprezzare i cromosomi sul vetrino, si devono colorare i cromosomi utilizzando le tecniche di bandeggio colorano i cromosomi con alternanza di bande chiare e scure. Quindi i cromosomi si ordinano in base alla dimensione, alla posizione del centromero e al bandeggio che colora più o meno intensamente zone di eterocromatina ed eucromatina, etc...

Meiosi

La meiosi è quel processo che nell'organismo produce i gameti, cioè le cellule germinali maschili e femminili (spermatozoi e ovuli). Un maschio con un cariotipo normale 46 XY produrrà un 50% di gameti con cromosoma X e 50% di gameti con cromosoma Y, perché la meiosi è quel processo che parte da un corredo diploide e arriva a un corredo aploide, perciò i gameti hanno 23 cromosomi, perché al momento della fecondazione il corredo verrà ripristinato a 46 grazie all'unione dei due gameti n. Dunque si differenzia dalla mitosi, perché quest'ultima produce sempre cellule diploidi. Una femmina con un cariotipo normale 46 XX produrrà un 100% di gameti con cromosoma X.

Albero genealogico

I pazienti, per accedere ai test di laboratorio, devono prima passare dal percorso di consulenza genetica in cui viene costruito l'albero genealogico della famiglia. In consulenza viene quindi la famiglia, perché si devono raccogliere dati su più membri possibili, dato che si tratta di malattie ereditarie. In seguito si acquisiscono i dati anamnesici, cioè si vanno a raccogliere più dati possibili circa la storia clinica di ogni soggetto della famiglia e poi viene fatta una valutazione in sede di consulenza clinica, in cui vengono fatte misurazioni necessarie, ma anche foto e filmati che dimostrino particolari comportamenti e caratteristiche fisiche.

Malattie genetiche mendeliane

Sono state teorizzate da Mendel e sono malattie genetiche dovute a mutazioni in un singolo gene (monogeniche) e sono i modelli più semplici da studiare.

Per sequenziare il genoma, occorrono circa 5 giorni, mentre nel passato ci volevano 13 anni: la parte più lunga è l'analisi dei dati, perché dall'analisi dell'intero esoma (parte codificante genoma) vengono fuori 20mila-50mila varianti e bisogna capire se queste varianti possono avere un risvolto clinico. Adesso la tecnologia ha fatto passi da gigante e guida le scoperte, tanto che nel giro di pochi anni riusciremo a sequenziare e conoscere tutte le malattie mendeliane.

Si può parlare sia di trasmissioni di caratteri a livello fenotipico (occhi azzurri, capelli castani, etc...), ma anche di trasmissione di malattie (genetica clinica).

• Le malattie possono essere autosomiche se le mutazioni avvengono nei cromosomi dalla coppia 1 alla coppia 22 e possono essere dominanti o recessive.
• Le malattie X-legate sono legate a mutazioni che avvengono su geni del cromosoma X e possono essere dominanti o recessive.
• Le malattie Y-legate sono legate a mutazioni che avvengono su geni del cromosoma Y.