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Genetica medica

Appunti di genetica medica.
Argomenti trattati:
-Gene
-Espressione genica
-Malattie genetiche
-Mutazioni
-Cromosomi
-Albero genealogico
-Eredità
-Patologie cromosomiche
-Cariotipo
-Tecniche
-Test genetici
-Estrazione DNA
-Sequenziamento
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Esame di Genetica medica docente Prof. F. Ariani

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ALTERAZIONE QUANTITA'

-mutazioni del promotore o degli enhancers: una mutazione in questi livelli alterano la quantità di

espressione, perciò il gene risulta essere espresso troppo o troppo poco, quindi la proteina in sé è

corretta, ma ne avremo più del normale o meno del normale.

Quali sono le convenzioni per indicare una mutazione:

ad esempio, nel caso ci sia una missenso, nel referto posso indicarla così:

-in base alla sequenza genomica: G.76AT (in posizione genomica 76 ho una sostituzione di una A

con una T)

-in base al cDNA: C.76AT (posizione nucleotidica 76 a partire da ATG, calcolata sul filamento

complementare all'RNA maturo, quindi il filamento sarà più corto rispetto alla sequenza genomica

essendo privo di introni)

-in base al DNA mitocondriale: M.76AT

-in base al filamento di RNA: R.76AT

-in base all'amminoacido della proteina: possono essere indicati con una singola lettera o con un

codice a tre lettere, per esempio L76A (o Leu76Arg) significa che l’aminoacido 76 è stato cambiato

da leucina in arginina. Se sono in posizione 76 amminoacidica, dovrò moltiplicare per 3 per sapere

in che posizione nucleotidica mi trovo.

Come si distinguono i cromosomi:

i cromosomi si distinguono l'uno dall'altro in base alla posizione del centromero e all'alternarsi di

bande chiare e bande scure, colorazione che si vede al cariotipo, analisi di numero e struttura dei

cromosomi con risoluzione dalle 5 alle 10000 bp e che permette di avere un panorama completo di

quello che è l'assetto cromosomico di un individuo.

Dopo aver svolto le prime fasi del cariotipo, cioè aver bloccato cromosomi in metafase, aver fatto

scoppiare le membrane nucleari per poter apprezzare i cromosomi sul vetrino, si devono colorare i

cromosomi utilizzando le tecniche di bandeggio colorano i cromosomi con alternanza di bande

chiare e scure. Quindi i cromosomi si ordinano in base alla dimensione, alla posizione del

centromero e al bandeggio che colora più o meno intensamente zone di eterocromatina ed

eucromatina, ecc...

La meiosi è quel processo che nell'organismo produce i gameti, cioè le cellule germinali maschili e

femminili (spermatozoi e ovuli).

Un maschio con un cariotipo normale 46 XY produrrà un 50% di gameti con cromosoma X e 50%

di gameti con cromosoma Y, perché la meiosi è quel processo che parte da un corredo diploide e

arriva ad un corredo aploide, perciò i gameti hanno 23 cromosomi, perché al momento della

fecondazione il corredo verrà ripristinato a 46 grazie all'unione dei due gameti n.

Dunque si differenzia dalla mitosi, perché quest'ultima produce sempre cellule diploidi.

Una femmina con un cariotipo normale 46 XX produrrà un 100% di gameti con cromosoma X.

Come si disegna un albero genealogico:

i pazienti, per accedere ai test di laboratorio, devono prima passare dal percorso di consulenza

genetica in cui viene costruito l'albero genealogico della famiglia. In consulenza viene quindi la

famiglia, perché si devono raccogliere dati su più membri possibili, dato che si tratta di malattie

ereditarie. In seguito si acquisiscono i dati anamnesici, cioè si vanno a raccogliere più dati possibili

circa la storia clinica di ogni soggetto della famiglia e poi viene fatta una valutazione in sede di

consulenza clinica, in cui vengono fatte misurazioni necessarie, ma anche foto e filmati che

dimostrino particolari comportamenti e caratteristiche fisiche.

I simboli da usare sono: Malattie genetiche mendeliane:

Sono state teorizzate da Mendel e sono malattie genetiche dovute a mutazioni in un singolo gene

(monogeniche) e sono i modelli più semplici da studiare.

Per sequenziare il genoma, occorrono circa 5 giorni, mentre nel passato ci volevano 13 anni: la

parte più lunga è l'analisi dei dati, perché dall'analisi dell'intero esoma (parte codificante genoma)

vengono fuori 20mila-50mila varianti e bisogna capire se queste varianti possono avere un risvolto

clinico. Adesso la tecnologia ha fatto passi da gigante e guida le scoperte, tanto che nel giro di pochi

anni riusciremo a sequenziare e conoscere tutte le malattie mendeliane.

Si può parlare sia di trasmissioni di caratteri a livello fenotipico (occhi azzurri, capelli castani,

ecc…), ma anche di trasmissione di malattie (genetica clinica).

Le malattie possono essere autosomiche se le mutazioni avvengono nei cromosomi dalla

• coppia 1 alla coppia 22 e possono essere dominanti o recessive.

Le malattie X-legate sono legate a mutazioni che avvengono su geni del cromosoma X e

• possono essere dominanti o recessive.

Le malattie Y-legate sono legate a mutazioni che avvengono su geni del cromosoma Y, sono

• pochissime, perché Y è un cromosoma molto piccolo e contiene pochissimi geni,

responsabili della maturazione sessuale in senso maschile.

Una malattia con trasmissione recessiva necessita che entrambi gli alleli di un gene siano

• mutati.

Una malattia con trasmissione dominante basta un solo allele del gene mutato.

• Per la trasmissione della malattia dominante basta un eterozigote, mentre per la recessiva è

• necessario un omozigote.

Una malattia si definisce dominante quando il fenotipo degli eterozigoti è uguale a quello

• degli eterozigoti affetti (es.: sindrome di Malfan, acondroplasia).

Una malattia si definisce recessiva quando il fenotipo degli eterozigoti (portatori sani) è

• uguale a quello degli omozigoti normali (es.: fibrosi cistica, talassemia). L'omozigosi si

osserva molto in isolati genetici (ad esempio, in Sardegna) oppure quando c'è un incrocio tra

consaguinei.

Può succedere molto più frequentemente il caso dell'eterozigosi composta, ovvero quando si hanno

mutazioni diverse sullo stesso allele: l'effetto è lo stesso di un'omozigosi, cioè la proteina risulta

modificata. Malattie autosomiche dominanti:

Per fare un albero genealogico di una malattia autosomica dominante, è necessario farne uno in cui

la trasmissione sia in verticale, cioè passa da una generazione all'altra, da genitore a figlio e così

via. Non è necessario fare una prevalenza di maschi o femmine, perché la malattia è autosomica e

colpisce indifferentemente sia maschi che femmine. In una malattia dominante, generalmente il

genitore è malato.

In una malattia autosomica dominante, l'allele mutato si indica con la lettera A, mentre quello sano

con la lettera a. Nel caso che la madre sia Aa (malata) e il padre aa (sano), le probabilità ad ogni

gravidanza sono: 50% malati (e a rischio trasmissione), 50% sani.

Eccezioni:

Ci può essere un difetto di penetranza:

-penetranza completa: quando il genotipo corrisponde al fenotipo al 100%, quindi se il gene è

mutato, l'individuo sarà malato per forza.

-penetranza incompleta: quando il genotipo non corrisponde al fenotipo al 100%, quindi individui

che hanno la malattia, ma non sono affetti, però la trasmettono ai figli; dunque il gene è mutato, ma

l'individuo è sano e nell'albero genealogico risulta un apparente salto di generazione; si calcola

facendo il rapporto tra n° individuo affetti e n° di individui mutati (es. Retinoblastoma, un tumore

della retina infantile, ha una trasmissione autosomica dominante, causata dalla mutazione di un

gene che sta nel cromosoma 13, ha una penetranza del 90%, cioè ci sarà un 10% di individui che

hanno il gene mutato, ma non lo esprimono, perché molto probabilmente ci sono fattori del genoma

che proteggono questi individui rispetto agli altri).

-espressività variabile: l'individuo non è completamente sano, ha dei segni della malattia, ma non è

grave come gli altri individui affetti; è un quadro più lieve della malattia, ma è presente. Nel caso

del Rb, se si vanno a fare delle analisi, risulterà esserci un retinoma, quindi una lesione benigna.

-mosaicismo: normalmente la mutazione avviene a livello delle cellule germinali, mentre in questo

caso avviene in fase post-zigotica, cioè a quel punto nell'individuo coesisteranno linee cellulari

normali e linee cellulari mutate, perché tutte le cellule che deriveranno dalla cellula mutata

porteranno la mutazione, mentre quelle che derivano dalla cellula normale non la porteranno; a

seconda di quanto prima avviene questa mutazione, tanto più il fenotipo sarà grave, perché più

cellule saranno coinvolte; se invece la mutazione avviene negli ultimi stadi dello sviluppo

embrionale, il numero delle cellule coinvolte sarà inferiore e il fenotipo sarà meno grave; quindi il

mosaicismo è uno dei motivi per cui esiste un'espressività variabile oppure se il mosaico è presente

al 3% delle cellule non si avranno manifestazioni fenotipiche.

Malattie autosomiche recessive:

Nel caso in cui l'incrocio tra due portatori sani consanguinei ha portato alla presenza della malattia

in omozigosi nei figli, quindi la trasmissione non è più verticale (da genitori a figli), ma

orizzontale, cioè qui individui affetti nella stessa generazione; anche in questo caso, sono affetti sia

maschi che femmine indistintamente; l'individuo malato ha solitamente genitori sani. E' necessario

anche sapere il luogo di nascita dell'individuo, perché se i genitori sono nati in paesi vicini, in isolati

genetici, è più probabile che si tratti di mutazioni in omozigosi. Nel caso che la madre sia Aa

(portatrice sana) e il padre Aa (portatore sano), le probabilità ad ogni gravidanza sono: 50%

portatori sani (e a rischio trasmissione), 25% sani (omozigoti AA), 25% affetti (omozigoti aa).

GENETICA 2 Malattie X-legate:

Se una mutazione è presente nel cromosoma X, ci sarà una differenza tra maschi e femmine, perché

le femmine presentano un altro cromosoma X che può compensare in parte.

Eredità X-legata recessiva:

nel caso di un maschio (XY), non si può dire di essere eterozigote od omozigote, perché in realtà

nell'altro allele la stessa mutazione non può esserci, perciò si dice di essere emizigote.

Avendo una copia mutata, non c'è l'altra che compensa, perciò il maschio sarà affetto.

Nel caso di una femmina (XX), se l'allele mutato è solo uno, allora l'individuo sarà eterozigote; se

gli alleli mutati sono entrambi, allora l'individuo sarà omozigote.

Se l'eredità è XLR, nel maschio basta una sola copia mutata perché la malattia si manifesti, perché

non c'è l'analogo sull'altro cromosoma che può compensare parzialmente; invece nella femmina

eterozigote, la malattia non si manifesta, però sarà portatrice sana; al contrario, se la femmina è

omozigote, sarà affetta (unico caso di femmina malata, caso raro).

Le malattie XLR colpiscono prevalentemente i maschi; non può esserci trasmissione maschio-

maschio, perché il padre dona un cromosoma Y al maschio; i figli maschi di un padre affetto

saranno quindi sani; le figlie di un maschio affetto sono portatrici al 100%; da una madre portatrice,

il 50% dei figli maschi potrà nascere affetto; un apparente trasmissione maschio a maschio può

esserci quando la madre è portatrice; in questo caso l'allele malato si chiamerà Xa.

Va considerato il fenomeno dell'inattivazione del cromosoma X o Lyonizzazione che prevede

l'inattivazione di uno dei due cromosomi X, tramite metilazione del DNA, durante le fasi precoci

dello sviluppo embrionale: in questo modo non vi è un sovraddosaggio di geni nelle femmine

rispetto ai maschi.

Si può avere un fenomeno di inattivazione sbilanciata che può essere sia a favore dell'allele sano

che dell'allele malato: se viene inattivato principalmente l'allele con la mutazione, l'individuo sarà

sano, mentre se viene inattivato principalmente quello sano, la femmina può manifestare sintomi

della malattia.

Quindi una femmina con malattia XLR può essere affetta quando c'è un fenomeno di inattivazione

sbilanciata del cromosoma X a favore dell'allele mutato.

L'inattivazione sbilanciata è un evento che favorisce l'inattivazione o del cromosoma normale o del

cromosoma mutato; se c'è un fenomeno di inattivazione sbilanciata per X può essere a favore

dell'allele mutato o dell'allele normale, quindi si potranno avere delle femmine malate.

Se si ha una femmina con un solo cromosoma X (45, X0), allora avrà sia l'allele mutato sia la

sindrome che si esprime, perché, come nel caso del maschio, ha un solo cromosoma X e non l'altro

che può compensare.

Esempi di malattie XLR sono: distrofia muscolare di Duchenne e Becker, Emofilia A e B,

Ritardo mentale, Sindrome dell'X-fragile.

Eredità X-legata dominante:

Sono affetti sia maschi che femmine, perché la mutazione è dominante, perciò basta che sia mutato

un solo allele perché la mutazione si esprima; non può esserci trasmissione da maschio a maschio; il

100% delle figlie di un maschio affetto saranno affette; una madre affetta ha il rischio del 50% di

avere figli affetti, indipendentemente da sesso; le femmine però generalmente sono affette in modo

più lieve e variabile rispetto ai maschi; in questo caso l'allele mutato si chiamerà XA.

Esempi di malattie XLD sono: incontinentia pigmenti, sindrome di Rett.

Sindrome di Rett:

E' una forma di autismo che colpisce solo le bambine.

Le neonate nascono normali e lo rimangono fino a che non inizia una fase di stasi dello sviluppo

(intorno ai 5-6 mesi) ed in seguito ad una regressione con conseguente peggioramento con sintomi

quali grave ritardo nell'acquisizione del linguaggio e della coordinazione motoria, oltre a grave

ritardo mentale ed epilessia.

Colpisce solo le bambine, perché i maschi sono talmente tanto compromessi da morire prima della

nascita, a meno che la mutazione non si presenti in fase post-zigotica.

Eredità mitocondriale:

Siccome è una mutazione a livello del DNA mitocondriale, ha un'eredità diversa rispetto ad una

mutazione che insorge a livello nucleare.

Il DNA mitocondriale è una molecola circolare a doppio filamento e contiene solo 37 geni, i quali

13 codificano per peptidi, 22 per l'rRNA e 2 per il tRNA. Tutti i peptidi codificati dal DNA

mitocondriale si occupano di una funzione specifica, cioè servono esclusivamente per il

meccanismo della fosforilazione ossidativa.

Ci sono strutture nell'organismo che necessitano e dipendono più o meno dalla fosforilazione

ossidativa (muscoli e cervello), perciò quando c'è una mutazione mitocondriale le malattie

colpiranno queste strutture (encefalopatie, distrofie...).

Alcuni esempi di malattie mitocondriali sono: neuropatia ottica di Leber (LHON), encefalopatia

mitocondriale con acidosi lattica (MELAS), mioclono-epilessia con raggruppamento di fibre

rosse sfilacciare (MERRF)

Disegnare un albero genealogico di una malattia mitocondriale è semplice, perché la trasmissione è

matrilineare, ovvero trasmessa solo dalla madre, in quanto il figlio riceve il DNA mitocondriale

solo dal citoplasma della cellula uovo, infatti lo spermatozoo contiene mitocondri solo nella coda

che non entra nell'oocita.

Le patologie mitocondriali sono caratterizzate da una variabilità fenotipica estrema, cioè non si

può prevedere in nessun modo quanto sarà grave la malattia. Tutto dipende da come vengono divisi

tra le cellula uovo i mitocondri durate l'ovogenesi: infatti la divisione degli organuli è puramente

casuale, quindi un figlio può nascere da una cellula uovo con molti mitocondri mutati (la malattia

sarà grave) o da una con pochi mitocondri mutati (la malattia sarà più lieve).

L'eteroplasmia è la coesistenza di mitocondri mutati e mitocondri normali (WT→ wild type)

all'interno della stessa cellula/tessuto. E' responsabile della espressività variabile delle patologie

mitocondriali. C'è una segregazione passiva dei mitocondri durante la divisione cellulare e quindi

le cellule avranno percentuali diverse di copie mutate e copie normali, allora anche i diversi tessuti

di un individuo avranno percentuali diverse di eteroplasmia.

In caso di un’etereoplasmia, la madre può trasmetterla con gradi diversi ai propri figli, di

conseguenza, nella stessa generazione, i fratelli potranno presentare fenotipi molto gravi, addirittura

letali, accanto a fenotipi molto lievi.

L'omoplasmia mutata è la presenza solo di mitocondri con DNA mutato, mentre l'omoplasmia

normale è la presenza di soli mitocondri con DNA normale. In caso di omoplasmia, la madre

trasmette lo stesso grado di gravità della malattia ai figli.

Patologie cromosomiche:

I cromosomi metafasici appaiono con una strozzatura (centromero) a cui si legano i cromatidi, i

quali hanno delle estremità (telomeri). In base a quanto è centrale il centromero, si distinguono

diverse strutture cromosomiche:

-metacentrici: strozzatura al centro, braccia uguali

-submetacentrici: strozzatura spostata verso una delle estremità, braccio piccolo e braccio lungo

-acrocentrici: strozzatura spostata tutta verso una delle estremità, il braccio piccolo è ridotto al

minimo e il suo DNA è detto satellite, di eterocromatina, quindi non espresso

-telocentrici: strozzatura totalmente spostata verso una delle estremità, il braccio piccolo non esiste

più, nel cariotipo umano non esistono

Come si fa un cariotipo:

Il cariotipo è l'assetto cromosomico di un individuo e permette di vedere sia anomalie di numero

che di struttura, quindi è possibile osservare mutazioni come delezioni, inserzioni, traslocazioni,

ecc…

Il cariotipo prenatale serve per vedere se il feto è sano, utilizzando le cellule della placenta,

intervenendo con un'amniocentesi o una villocentesi (più precoce), piuttosto invasivi.

Il cariotipo postnatale serve quando si sospetta ci sia una sindrome, quindi è una conferma o

smentita al sospetto; in questo caso le cellule si prelevano da un prelievo di sangue periferico.

Il sangue viene messo in un mezzo di coltura, nello specifico vengono messe in coltura le cellule

linfocitarie, poi per stimolare la divisione cellulare si utilizza una sostanza chiamata

fitoemoagglutinina. Passate 48-72 ore, viene aggiunta un'altra sostanza, la colchicina, che arresta

la cellula in metafase; a questo punto le cellule verranno trattate con una soluzione ipotonica, così

da far scoppiare la membrana nucleare e causare la dispersione dei cromosomi. Adesso si prende il

tutto e lo si fissa su un vetrino con metanolo e acido acetico, per poi colorare il preparato

attraverso le tecniche di bandeggio, le quali permettono di visualizzare i cromosomi.

I cromosomi vengono ordinati dalla coppia 1 fino alla coppia di cromosomi sessuali; le coppie si

individuano in base alle dimensioni (dalla più grande alla più piccola), poi vengono raggruppati in

base alla posizione del centromero. I cromosomi, una volta osservati al microscopio, vengono

accoppiati fino a formare le 23 coppie.

I bandeggi sono di vario tipo:

-G: il colorante usato è il giemsa dopo pretrattamento enzimatico con tripsina; dà alternanza di

bande G scure e bande chiare.

-Q: il colorante usato è la chinacrina; dà alternanza di bande fluorescenti e non fluorescenti; le

bande fluorescenti corrispondono alle bande G scure.

-R: rever, pattern invertito le bande rispetto a G e Q; utile per definire le estremità dei cromosomi.

-C: estrazione di proteine e DNA seguito da colorazione giemsa; evidenzia soprattutto il

centromero.

-NOR: la colorazione è argentica; colora le regioni del nucleolo organizzatrici, in particolare i

cromosomi acrocentrici.

Esiste uno screening prenatale non invasivo che permette di analizzare il DNA fetale libero

circolante isolato da un campione di sangue materno e con il quale si può valutare la presenza di

anomalie cromosomiche. Con il cariotipo si vedono tutti i cromosomi, mentre con lo screening

prenatale non invasivo si vedono solo le anomalie cromosomiche più frequenti.

Anomalie cromosomiche di numero:

Le anomalie cromosomiche di numero si distinguono in:

-aneuploidie: cromosoma in più o in meno rispetto ad un assetto cromosomico normale, solo

alcune sono compatibili con la vita (es.:47XY+21 trisomia 21; 45X monosomia). Le principali

aneuploidie compatibili con la vita sono la sindrome di Down, di Turner, di Klinefelter, di Patau, di

Edwards, X triplo e XXY. Avviene per una non-disgiunzione alla prima o alla seconda divisione

meiotica (prima→ conseguenze peggiori; più aumenta l'età materna e più c'è rischio di aneuploidia)

oppure per non-disgiunzione mitotica (mosaicismi cromosomici)

-poliploidie: uno o più assetti cromosomici completi, solitamente incompatibile con la vita (es.:

69XXX triploidia→ presente nel 7% degli aborti, letale, figli muoiono entro le 24 ore;

sopravvivenza nel caso di mosaicismo; avviene se 2 spermatozoi n fecondano un ovulo n oppure se

uno spermatozoo n feconda un ovulo 2 n oppure se uno spermatozoo 2n feconda un ovulo n).

Le principali sindromi conseguenti da anomalie cromosomiche di numero sono:

-Sindrome di Down: trisomia 21; sintomi come caratteristiche facciali (brachicefalia, viso

rotondeggiante, occhi particolari, rime palpebrali dirette verso l'alto, epicanto, naso piccolo con

ipoplasia, lingua grossa, padiglioni auricolari piccoli), mani piccole e dita corte, clinodattilia del V

dito, linea palmare traversa, ritardo mentale di grado variabile, ipotonia (scarso tono muscolare),

Alzheimer dopo i 40 anni, rischio di leucemia e tumore testicolare; frequenza di 1/1000.

-Sindrome di Edwards: trisomia 18;prevalenza di femmine affette rispetto ai maschi; sintomi

come anomalie molto gravi, microcefalia, facies particolare (volto e naso piccolo, microretrognazia,

orecchie a basso impianto e con padiglioni a punta), mani strette a pugno, accavallamento delle dita,

piede a piccozza, calcagno prominente, malformazioni congenite cardiovascolari, scheletriche,

gastrointestinali e renali; frequenza 1:7700; mortalità del 90% nel primo anno di vita.

-Sindrome di Patau: trisomia 13; labiopalatoschisi, oloprososencefalia, polidattilia, microftalmia,

anomalie dei padiglioni auricolari e scheletriche, convulsioni, malformazioni cardiache, renali,

intestinali, ritardo psicomotorio grave; frequenza 1:10000; mortalità alta nel primo anno di vita; nel

97% dei casi aborto spontaneo; 75% dei casi dovuta a trisomia 13; 15% dei casi dovuta a

traslocazione quasi sempre robertsoniana; 5% dei casi a mosaico; correlata ad età materna avanzata.

-Sindrome di Turner: 45X; unica monosomia compatibile con la vita; femmine; sintomi come

bassa statura, immaturità dei caratteri sessuali secondari, amenorrea, infertilità, pterigio del collo,

anomalie scheletriche, facies caratteristica (ptosi palpebrale, rime palpebrali verso il basso,

epicanto); non si riscontrano disabilità intellettive; possibile cura con ormone della crescita e

raggiungimento dell'età adulta.

-Sindrome di Klinefelter: trisomia 47XXY; maschi; sintomi come alta statura, ipogonadismo,

ginecomastia, caratteri sessuali secondari poco sviluppati, azoospermia, infertilità, scoliosi,

osteoporosi, diabete nell'8% nei casi.

-Sindrome dell'X triplo: trisomia 47XXX; femmine; sintomi come ritardo nell'apprendimento,

frequente alta statura; nessuna anomalia fisica, fenotipo normale; figli di donne XXX hanno

cariotipo normale.

-Sindrome di Jacobs: trisomia 47XYY; maschi; in alcuni soggetti, sintomi come difficoltà di

apprendimento e problemi comportamentali.

GENETICA 3 Tecnica QF-PCR:

Alle donne in gravidanza, oltre all'esame del cariotipo, viene proposta anche la QF-PCR.

L'amniocentesi viene fatta intorno alla 12°-14° settimana (se si vuole una diagnosi precoce, si opta

per la villocentesi). Rispetto al cariotipo, con la QF-PCR non c'è necessità di una coltura cellulare,

quindi non necessita del tempo del cariotipo (circa 20 giorni), perché è possibile ottenere risultati in

48 ore.

La QF-PCR utilizza dei marcatori specifici per le aneuploidie più frequenti (marcatori specifici per

cromosoma 13, 18, 21, sessuali), quindi attraverso questa tecnica l'individuo deve essere cosciente

che non vede tutto l'assetto cromosomico, ma solo le aneuploidie più frequenti.

La PCR è un'amplificazione specifica di zone ripetute di DNA, la QF-PCR è una tecnica di PCR

quantitativa fluorescente in determinate zone cromosomiche. Una volta fatta l'amplificazione dei

frammenti, si vanno poi a porre su un sequenziatore e si guarda la fluorescenza. Si vanno ad

amplificare le regioni polimorfiche (i polimorfismi sono varianti che non hanno conseguenze

cliniche nel fenotipo, rappresentano la normale variabilità genomica della popolazione sana). Ci

sono in particolare delle zone ripetute di DNA che vengono amplificate tramite PCR e poi divise

tramite elettroforesi in base al peso (es.: se un allele ha 20 ripetute e l'altro ne ha 25, migreranno in

modo diverso→ ciò significa che l'individuo per quel carattere è eterozigote, perché i segnali sono

diversi; nel caso di un omozigote, si ha un segnale solo; nel caso di una trisomia, si hanno 3 picchi

oppure un picchio è doppio dell'altro).

Anomalie cromosomiche di struttura:

Le anomalie cromosomiche di struttura si dividono in due grandi gruppi:

-riarrangiamenti bilanciati: non si ha perdita né acquisizione di materiale genetico (es.:

traslocazione, si stacca un pezzo dalla coppia del cromosoma 1 si attacca nel cromosoma 3, in

questo caso il materiale genetico si è solo spostato), spesso non provocano conseguenza fenotipiche,

però possono essere pericolose per la prole, perché in questo caso si potrebbe sbilanciare; può

essere patogenetico se il pezzetto che si stacca era all'interno di un gene oppure se si va a riattaccare

sempre all'interno della sequenza codificante di un altro gene, variandola e quindi creando una

proteina modificata.

-riarrangiamenti sbilanciati: c'è perdita o acquisizione di materiale genetico (es.

delezione/inserzione/duplicazione), sono patogenetiche.

Sia i riarrangiamenti bilanciati che sbilanciati comprendono:

-traslocazioni: un pezzo di cromosoma trasloca da una coppia di omologhi ad un'altra coppia di

omologhi; possono essere reciproche (reciproco scambio di segmenti cromosomici; coinvolgono in

particolare i cromosomi submetacentrici; possono essere bilanciate o sbilanciate, cioè il passaggio

reciproco dei segmenti cromosomici può comportare o non comportare perdita o acquisizione di

materiale genetico, cioè può avvenire che quando il frammento si stacca, nel punto di rottura, si

perda del materiale genetico) e robertsoniane (coinvolgono in particolare i cromosomi

acrocentrici; i centromeri si vanno a fondere e ne risulta un unico cromosoma, i cui bracci corti

vengono persi, però essendo materiale di eterocromatina che non incide in niente, quindi il cariotipo

che ne risulta sarà a 45 cromosomi; sono riarrangiamenti bilanciati).

-inserzioni: inserito un segmento di cromosoma.

-delezioni: deleto un segmento di cromosoma (possono essere terminali, se avviene nel segmento

terminale del cromosoma, o interstiziali, se avviene all'interno e ci sono quindi 2 punto di rottura;

riarrangiamenti sbilanciati).

-duplicazioni: duplicato un segmento di cromosoma (riarrangiamenti sbilanciati).

-inversioni: duplice rottura di un segmento che si reinserisce nello stesso punto, però invertito di

180° (pericentriche, cioè coinvolge il centromero e paracentriche, cioè non coinvolge il

centromero; riarrangiamenti sia bilanciati che sbilanciati).

-ring o ad anello: le estremità del cromosoma di legano; cromosoma che perde segmenti alla

estremità e quelli terminali che rimangono sono detti sticky (appiccicosi), perché tendono a formare

un anello ed essendo le estremità complementari, si attaccano l'una all'altra (riarrangiamenti

sbilanciati).

-isocromosomi: si hanno nel caso in cui, per errore, la divisione avvenga trasversalmente, così da

avere cromosomi o con due braccia corte identiche o con due braccia lunghe identiche; molto grave,

perché si ha o molto meno materiale genetico o troppo materiale genetico (riarrangiamenti

sbilanciati). Tecniche di citogenetica molecolare:

Con il cariotipo è impossibile vedere riarrangiamenti sotto le 5-7 megabasi, perché fa parte della

citogenetica tradizionale, perciò si usano delle tecniche a più alta risoluzione della citogenetica

molecolare:

-FISH: acronimo di “Fluorescent in situ hybridization”; tecnica semplicissima che consiste nella

denaturazione del preparato cromosomico (aprire la la doppia elica, ovvero spezzare i legami tra le

basi azotate complementari, aumentando la temperatura), seguita da immissione di una sonda locus

specifica (segmento di DNA specifico per una determinata regione) che si lega dove trova

complementarietà; dove la sonda si lega, emette un segnale di fluorescenza che si può apprezzare al

microscopio; tecnica utile per vedere se un gene è stato deleto o meno, ma la risoluzione è inferiore

alle 5-7 megabasi, quindi è necessario avere un sospetto clinico forte inizialmente (in consulenza

genetica, si è già individuato ciò che può avere il paziente, ovvero per tutta una serie di

caratteristiche fenotipiche, si ipotizza che si tratti di un paziente con una certa sindrome e si ordina

una specifica sonda per quel riarrangiamento fortemente sospetto); è necessario inserire sempre una

sonda di controllo per vedere che la procedura sia andata bene, infatti se al microscopio si vede il

controllo, possiamo avere la certezza che l'assenza della sonda specifica significa che c'è davvero

una delezione e non è un artefatto tecnico; possono essere utilizzate o sonde locus specifiche per

certi cromosomi (es.: sospetto di delezione in cromosoma 4→ si ha il segnale di controllo, il segnale

terminale, ma non il segnale corrispondente, quindi c'è una delezione) oppure sonde painting che

colorano tutto il cromosoma e vengono utilizzate per caratterizzare e definire punti di rottura di

riarrangiamenti sia bilanciati che sbilanciati oppure sonde telomeriche (terminali).

-ARRAY-CGH: CGH è l'acronimo di “Comparative genomic hybridization”, mentre Array è il

nome del vetrino usato, il quale controluce riscontra tanti “puntini” che corrispondono a delle sonde

che coprono tutto il genoma, dal cromosoma 1 ai cromosomi sessuali; non si propone ancora come

test prenatale, perché è molto costoso e perché si vedono praticamente quasi tutti i riarrangiamenti

(fino alle kilobasi), ma non tutte le mutazioni permettono di prevedere un riscontro clinico; l'Array-

CGH consiste nel fare un prelievo di sangue sia al soggetto “malato” sia al soggetto “sano” e

nell'immediata estrazione del DNA, poi, una volta isolato il materiale genetico, si marca con

fluorescenti diversi (es.: rosa e blu, verde e rosso), in seguito si denatura il DNA e si deposita su

vetrino Array dove verrà effettuata l'ibridazione tra i DNA marcati e le sonde del vetrino: a questo

punto il DNA test (verde) e il DNA reference (rosso) si vanno a legare con le sonde a formare un

DNA balanced di colore giallo, se non c'è nessuna mutazione, perché si legano in modo uguale e

nessun colore prevale sull'altro; se si vede un segnale verde, allora in quella regione ci sarà una

duplicazione del test; se si vede un segnale rosso, allora in quella regione ci sarà una delezione del

test; il risultato dell'esame ora è trasmesso al computer tramite un programma specifico che calcola

il logaritmo del rapporto di intensità di fluorescenza tra test e reference, quindi se il risultato è 0,

allora non c'è alterazione; se il risultato è -1, allora c'è delezione; se il risultato è 0.59, allora c'è

duplicazione; l'Array-CGH, però, non riesce ad individuare i riarrangiamenti bilanciati.

Imprinting genomico:

Forma di controllo dell'espressione genica, ovvero esistono delle specifiche regioni nel genoma

che sono ad espressione tipicamente paterna o materna (in ognuno, ci sono delle regioni che si

esprimono solo con la copia paterna o materna); alcuni geni sono attivi solo quelli ereditati dalla


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in logopedia
SSD:
Università: Siena - Unisi
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher mara.martini di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica medica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Siena - Unisi o del prof Ariani Francesca.

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