Genetica medica

Citogenetica

La citogenetica studia la morfologia, il numero e il ruolo dei cromosomi nell'ereditarietà. L'analisi dei cromosomi si basa sulla costruzione del cariotipo, ossia l'insieme dei cromosomi in una cellula. Ogni specie presenta uno preciso cariotipo con un certo numero di cromosomi, in cui ogni coppia di cromosomi ha una particolare morfologia: nell'uomo le prime 22 coppie sono autosomi, mentre l'ultima coppia è costituita da due eterosomi.

Ogni specie è quindi riconoscibile a partire dal cariotipo; se però il numero di cromosomi è caratteristico, esso non corrisponde alla scala evolutiva (l'uomo ha 46 cromosomi, la scimmia 48), così come il numero di geni codificanti. Lo studio del cariotipo in medicina è importante poiché 1 su 200 neonati ha una patologia cromosomica, più del 50% degli aborti spontanei è dovuto ad anomalie cromosomiche ed 1 su 100 individui è portatore di anomalia bilanciata che può essere associata ad infertilità/abortività.

I cromosomi di ciascuna coppia vengono definiti omologhi (e non identici) poiché le forme alleliche che possiedono possono essere diverse e quindi non portano la stessa informazione. Il contenuto di DNA (C) rappresenta la quantità di DNA per set aploide: durante la fase S è pari a 2C, alla fine della fase S è pari a 4C ma il numero dei cromosomi è sempre uguale a 46, per tutto il ciclo cellulare (ad eccezione della fase di divisione).

Ogni cromosoma presenta una costrizione primaria, il centromero, a livello del quale si forma il cinetocore durante la divisione cellulare in modo che esso possa legarsi alle fibre del fuso mitotico. Il centromero inoltre divide il cromosoma in un braccio corto p ed un braccio lungo q.

Telomeri

Le estremità dei cromosomi invece sono costituite dai telomeri, essenziali per il mantenimento dell'integrità del cromosoma; i telomeri sono costituiti da eterocromatina ed in particolare dalla sequenza ripetuta TTAGGG (3-20Kb). I telomeri assicurano quindi la completa replicazione del DNA: le sequenze ripetute TTAGGG sono riconosciute dalla telomerasi, la cui attività contrasta l'accorciamento progressivo dei cromosomi dovuto al susseguirsi dei cicli normali di replicazione del DNA.

L'invecchiamento delle cellule somatiche è associato all'accorciamento dei telomeri a causa dell'assenza della telomerasi; nelle cellule germinali e tumorali la telomerasi è invece presente in modo da consentire la continua replicazione della cellula. I segnali telomerici possono trovarsi anche all'interno del cromosoma stesso: il cromosoma 2 deriva dalla fusione di due cromosomi dello scimpanzé (che infatti ne presenta 48) e quindi porta dei segnali telomerici all'interno.

I telomeri sono anche essenziali per il mantenimento dell'integrità del cromosoma: i telomeri infatti favoriscono il legame con le proteine telomeriche che costituiscono la capsula protettiva dell'estremità del cromosoma; la perdita dei telomeri determina instabilità delle estremità cromosomiche, che infatti tendono a:

• Associarsi con le estremità rotte di altri cromosomi
• Essere coinvolti in eventi di ricombinazione
• Essere degradati

I telomeri quindi svolgono un ruolo fondamentale nella protezione delle estremità dei cromosomi dalla degradazione e dalla fusione coda-coda con altri cromosomi. Inoltre, sono coinvolti anche nello stabilire un'architettura tridimensionale nel nucleo.

Analisi del cariotipo

Per lo studio del cariotipo è fondamentale l'allestimento della coltura, in quanto lo studio può avvenire solo in cellule proliferanti bloccate in metafase, dove i cromosomi raggiungono la massima compattazione. Le fonti cellulari possono essere diverse a seconda dello studio che si vuole effettuare:

• Sangue periferico → uso di eparina come anticoagulante
• Midollo
• Colture da tessuti solidi
• Fibroblasti → in caso di mosaico genetico
• Linee cellulari immortalizzate

Per allestire tali colture vengono utilizzati anche mitogeni che stimolano la proliferazione cellulare; per bloccare poi le cellule in metafase si utilizza la colchicina, un veleno mitotico, che blocca la formazione del fuso mitotico e bloccando la cellule in metafase. Le cellule vengono poi risospese in una quantità opportuna di fissativo fresco e fatte cadere mediante sgocciolamento (2-3 gocce) su vetrini pretrattati (miscela di alcol assoluto e HCL) posti in acqua distillata; questo permette di gonfiare le cellule in modo da poter aprire la membrana e visualizzare i cromosomi all'interno.

Per una buona qualità dei preparati, l'umidità e la temperatura dell'ambiente devono essere controllate: le condizioni migliori sono offerte da 20°C con un'umidità relativa di poco superiore al 50%. Il preparato viene poi colorato con colorazioni differenziali e osservato al microscopio.

Tipi di cromosomi

In base alla posizione del centromero i cromosomi vengono morfologicamente distinti in:

• Metacentrici → centromero posto a metà (1, 3, 19, 20)
• Sub-metacentrici → centromero vicino alla metà
• Acrocentrici → centromero posto verso l'estremità: il braccio corto di questi cromosomi è costituito in genere da sequenze ripetute e il DNA satellite che contiene le sequenze codificanti rRNA (13, 15, 16, 21, 22, Y)

Bandeggio cromosomico

L'abilità di identificare con certezza specifici cromosomi è stata conquistata con la scoperta di alcuni fluorocromi e la messa a punto di protocolli di bandeggio cromosomico che creano un'alternanza di bande chiare e scure lungo l'asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi. Il bandeggio cromosomico è diventato standard ed indispensabile per l'analisi citogenetica.

Ognuna di queste tecniche produce un pattern riproducibile di bande chiare e scure (fluorescenti e non) lungo l'intero cromosoma: ogni coppia di cromosomi mostra un unico pattern di bandeggio, analogo ad un "bar code" che permette di differenziare i cromosomi gli uni dagli altri con stessa taglia e stessa posizione del centromero.

Le tecniche di bandeggio sono diverse:

• Bandeggio G → i cromosomi vengono trattati con tripsina, che degrada la porzione proteica del cromosoma, e vengono colorati poi con GIEMSA: le bande chiare sono ricche in GC (cromatina meno condensata, replicano precocemente e contengono molti geni) e quelle scure ricche in AT (cromatina più condensata, replicano tardivamente e contengono pochi geni)
• Bandeggio Q → il vetrino viene immerso in una soluzione di quinacrina, colorante fluorescente che non si lega preferenzialmente alle regioni ricche in AT. Le regioni ricche in AT risultano però più colorate poiché la fluorescenza decade più lentamente rispetto alle regioni ricche in GC
• Bandeggio R → i cromosomi vengono denaturati al calore in soluzione salina e colorati con GIEMSA; a causa della denaturazione delle regioni ricche in AT, il pattern di bandeggio è opposto (R = reverse) rispetto ai due precedenti
• Un'altra tecnica di bandeggio R si aggiunge bromodiossiuridina (BrdU) nell'ultima fase di replicazione del DNA: questa si intercala nel DNA che si replica tardivamente e permette di individuare le bande ricche in AT, più chiare di quelle ricche in GC. Questo tipo di bandeggio viene utilizzato per individuare il cromosoma X attivo od inattivo in una cellula. Quando la BrdU è presente per due interi cicli cellulari, un cromatide conterrà una sola catena polinucleotidica con l'incorporazione, mentre l'altra avrà incorporato su entrambe le catene: il bandeggio permette quindi di visualizzare anche il numero di scambi tra i cromatidi fratelli durante i vari cicli cellulari
• Bandeggio C → denaturazione in una soluzione di idrossido di bario e colorazione con GIEMSA. Tale bandeggio viene utilizzato per evidenziare l'eterocromatina costitutiva.

Per effettuare un cariotipo si seguono diversi step:

1. Si contano i cromosomi per individuare eventuali alterazioni del numero cromosomico
2. Si appaiano gli omologhi per similarità
3. Si mettono in ordine secondo la convenzione

Come si identificano i cromosomi?

I cromosomi possono essere identificati mediante colorazioni specifiche e mediante l'utilizzo del codice ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) che prevede una suddivisione dei due bracci in regioni numerate a partire dalla regione vicina al centromero; ogni regione poi presenta a sua volta più bande anch'esse numerate. Il cariotipo può avere diverse risoluzioni ovvero diversi numeri di bande per set aploide: gli ideogrammi sono rappresentazioni schematiche di ciascun tipo di cromosoma. Per ottenere una maggiore risoluzione è necessario bloccare il ciclo cellulare in profase in modo da evitare la completa compattazione del cromosoma.

Polimorfismi cromosomici

Il cariotipo viene fatto attraverso il confronto tra i bandeggi cromosomici. È possibile però che alcuni cromosomi presentino una variante di bandeggio non associata a nessun fenotipo patologico: in questi casi si parla di polimorfismo cromosomico, ovvero una variante cromosomica presente nell'almeno 1% della popolazione. I polimorfismi più frequenti si ritrovano a livello del braccio corto dei cromosomi acrocentrici e sono evidenziabili mediante bandeggio C. Altri polimorfismi si trovano nelle porzioni di eterocromatina pericentromerica: questi polimorfismi consistono in variazioni di grandezza, espansioni ma anche riduzioni o inversioni, soprattutto nei cromosomi 1, 9 e 16. Polimorfismi si ritrovano anche a livello dei siti fragili, regioni cromosomiche che appaiono come dei gap non colorati o come una rottura del cromosoma; tali regioni sono considerati polimorfismi innocui dal punto di vista clinico, ad eccezione dell'X fragile. Esistono anche polimorfismi eucromatici, ovvero relativi a regioni trascrizionalmente attive, in particolare a livello del cromosoma 9.

Anomalie cromosomiche

La citogenetica clinica studia i cromosomi, la loro struttura ed eredità applicati alla pratica della genetica medica. Specifiche anomalie cromosomiche sono associate a centinaia di sindromi che sono nell'insieme più comuni di tutte le malattie genetiche mendeliane. Per anomalie cromosomiche si intendono le mutazioni che producono un'alterazione cromosomica; le anomalie possono essere:

• Bilanciate → non sono associate ad un fenotipo patologico; un esempio se il cromosoma 21 si attacca ad un altro cromosoma acrocentrico
• Sbilanciate → correlano con un fenotipo patologico, in genere malformazioni e/o ritardo mentale.

La gravità delle anomalie cromosomiche è correlata al tipo di cromosoma e al numero di geni interessati: tanto più è grave lo sbilanciamento, tanto più grave sarà il fenotipo o precoce l'aborto spontaneo. Le anomalie cromosomiche possono anche essere distinte in:

• Numeriche → varia il numero dei cromosomi (sono di solito sbilanciate) e possono essere:
  • Aneuploidie → coinvolgono singoli cromosomi
  • Poliploidie → coinvolgono l'intero set cromosomico
• Di struttura → la mutazione determina la rottura in uno o più punti di uno o più cromosomi che porta poi ad uno scorretto ricongiungimento dei punti di rottura. I riarrangiamenti strutturali possono essere individuati mediante bandeggio del cariotipo ma con limiti di risoluzione: la grandezza della regione coinvolta deve essere di almeno 10Mbasi. Possono essere sia bilanciate (inversioni, traslocazioni, inserzioni) che sbilanciate (delezioni, duplicazioni, cromosomi ad anello, isocromosomi..).

Entrambe queste anomalie possono essere inoltre suddivise in:

• Costitutive → se presente alla nascita
• Somatiche o acquisite → se acquisita in un secondo momento (es. cancro).

Le anomalie cromosomiche rappresentano la patologia più frequente del concepimento e, nonostante la fortissima selezione naturale mediante l'aborto spontaneo, la loro frequenza alla nascita è elevata. Non tutte le alterazioni cromosomiche possono essere identificate perché esiste un limite di risoluzione della citogenetica standard pari a 5 Mb. Le cellule tumorali sono caratterizzate da instabilità cromosomica, sono in grado di accumulare riarrangiamenti cromosomici sia numerici che strutturali. Questi riarrangiamenti sono molto frequenti anche durante le prime fasi di sviluppo embrionale; durante lo sviluppo poi le cellule che presentano i riarrangiamenti possono poi andare incontro ad una selezione negativa oppure generare un mosaico a livello dell'embrione. Questi riarrangiamenti sono stati individuati in uno studio che ha evidenziato che l'assenza di cellule riarrangiate rappresenta più un'eccezione.

Anomalie numeriche

Le anomalie numeriche vengono distinte in poliploidie e aneuploidie.

Poliploidie

Le poliploidie sono anomalie numeriche che interessano tutti i cromosomi di un individuo. Con il termine euploidia si intende un esatto multiplo del numero cromosomico aploide (n): cellule normali con 46 (2n) cromosomi sono cellule euploidi così come cellule che presentano assetti cromosomici multipli (3n, 4n..). Le poliploidie più frequenti in genere sono:

• Triploidie → le cellule triploidi possiedono 69 cromosomi (3n) ed in genere derivano da una doppia fertilizzazione o da una fertilizzazione che coinvolge una cellula spermatozoo diploide o di una cellula uovo diploide. L'effetto che ne deriva è diverso: nel caso di doppia fertilizzazione la placenta che si forma è anomala, mentre il doppio apporto materno determina una placenta normale ma un ritardo di crescita nel feto; questo avviene poiché l'apporto genetico paterno e materno non è uguale. La triploidia rappresenta una delle cause più comuni di aborto spontaneo
• Tetraploidie → le cellule triploidi possiedono 92 cromosomi (4n) e sono il risultato di una scorretta divisione mitotica di una cellula 2n, ovvero derivano da una duplicazione del materiale genetico non seguita da una divisione cellulare. I cariotipi possibili sono quindi solo: 92, XXXX o 92, XXYY.

Aneuploidie

Le aneuploidie sono invece alterazioni numeriche che coinvolgono uno o più cromosomi; le cellule che presentano aneuploidia non sono quindi cellule euploidi! Le aneuploidie rappresentano le più frequenti aberrazioni cromosomiche numeriche ed esempi sono: trisomie, tetrasomie, monosomie; il principale meccanismo è la non disgiunzione dei cromosomi durante la meiosi. È il principale fattore eziologico alla base di un alterato sviluppo fetale e nella maggior parte dei casi determina aborto; la frequenza nei nati vivi portatori di aneuploidie è dello 0,36% ed il rischio di questo tipo di mutazione è correlato ad un'età materna avanzata.

La non disgiunzione può avvenire sia a livello della meiosi I che della meiosi II ma può coinvolgere anche la mitosi, determinando una condizione a mosaico; questo evento quindi può avvenire sia in fase di riduzione meiotica che in fase post-zigotica. Per capire in quale fase è avvenuta la non disgiunzione si valuta la presenza di cromosomi uguali (meiosi II) o diversi (meiosi I) mediante l'utilizzo di marcatori.

In base al momento in cui avviene non disgiunzione mitotica si avranno fenotipi diversi: se avviene in fasi precoci dello sviluppo, l'individuo presenterà solo cellule anomale (es. 45 e 47 cromosomi), se invece avviene in fasi più tardive dello sviluppo l'individuo sarà un mosaico, con un'alternanza di cellule normali e cellule anomale.

Un'altra causa di aneuploidia è il ritardo anafasico, ovvero il ritardo di uno dei due cromatidi durante l'anafase che lo porta a rimanere escluso dal nucleo: il cromatidio rimane nel citoplasma e viene poi degradato; questo processo avviene di solito in fasi post-zigotiche dello sviluppo e causa quindi mosaico genetico.

Aneuploidie degli autosomi

Le monosomie coinvolgenti gli autosomi sono sempre incompatibili con la vita, sono letali nella fase embrionale e si trovano quindi solo nei prodotti abortivi. Le trisomie di alcuni autosomi sono compatibili con la vita ma causano una condizione talmente grave da limitarne la durata; le trisomie degli autosomi compatibili con la vita sono:

• Trisomia del 13 sindrome di Patau → associata a gravi malformazioni, induce morte precoce
• Trisomia del 18 sindrome di Edwards → associata a gravi malformazioni, induce morte precoce
• Trisomia del 21 sindrome di Down

Sono stati osservati anche casi di mosaico che presentano solo in alcune cellule una trisomia del cromosoma 8, che se completa è letale. Gli unici casi diagnosticati sono casi di bambini poiché la crescita dell'individuo determina una diminuzione del numero di cellule anomale. La trisomia più frequente nei casi di aborto spontaneo è quella del cromosoma 16, che determina la morte del feto entro il primo trimestre di gravidanza.

Sindrome di Down – Trisomia del 21

È l'anomalia cromosomica più frequente, l'incidenza media è di 1:750 sui nati vivi. Solo il 20% dei concepimenti con tale trisomia arriva a termine, 2/3 infatti vengono assorbiti spontaneamente mentre il restante 20% nasce morto. L'incidenza aumenta con l'aumentare dell'età materna.

In genere il cariotipo presenta una trisomia libera del 21 ovvero tre copie del cromosoma, ma esistono anche casi dovuti a traslocazioni (in particolare 14-21). Il 95% dei casi deriva da una non disgiunzione cromosomica (in particolare nella meiosi I) materna; il 4% invece è dovuto alla traslocazione robertsoniana. L'1-2% di casi rari presentano una condizione a mosaico della trisomia libera che causa un fenotipo molto più lieve.

Ad oggi non si sa ancora se la patologia sia dovuta ad un particolare gene o a una regione cromosomica specifica.