Genetica medica

PATOLOGIE GENOMICHE

Riarrangiamenti del DNA coinvolgenti regioni genomiche "instabili". Si presentano generalmente come casi sporadici anche se esistono casi familiari. I riarrangiamenti solitamente sono rappresentati da duplicazioni o delezioni, alcune volte da inversioni. Possono essere sia ricorrenti che non ricorrenti; sono definiti ricorrenti quando i breakpoint cadono sempre nella stessa regione e danno quindi duplicazioni, delezioni o inversioni sempre della stessa grandezza. Solitamente in questi disordini il fenotipo clinico è la conseguenza di un dosaggio non corretto di uno o più geni sensibili al dosaggio localizzati nel frammento genomico coinvolto nella delezione o duplicazione; oppure della rottura di un singolo gene con perdita della sua normale funzione. Le duplicazioni segmentali (5% del genoma) mediano riarrangiamenti ricorrenti. L'alto grado di omologia, l'estensione, l'orientamento e la distanza reciproca tra due o più DS fa sì che

Queste sequenze sono un "terreno fertile" per eventi di ricombinazione omologa non allelica (NAHR). Le alterazioni citogenetiche mediate da DS includono delezioni, duplicazioni, inversioni, traslocazioni, la formazione di piccoli cromosomi marcatori o altri riarrangiamenti più complessi.

Delezione 22q11.2: Sindrome di Di George o Sindrome velocardio-facciale:

• Ipoplasia del timo e delle paratiroidi, cardiopatia congenita anomalie cono-troncali cuore, caratteristiche facciali tipiche, anomalie del palato (labio/palatoschisi), ritardo nello sviluppo, ritardo del linguaggio
• Incidenza 1:5.000

La delezione non è quasi mai visibile mediante citogenetica classica, nemmeno con bandeggio ad alta risoluzione. L'indagine di laboratorio per evidenziare la delezione è effettuata mediante FISH con sonde locus-specifiche.

Del 7q11.13: Sindrome di Williams:

• Ritardo psicomotorio, cardiopatie (solitamente stenosi)
• Incidenza 1:10.000-20.000

sopra-valvolare dell'aorta)

Profilo cognitivo e comportamentale peculiare

Dismorfismi facciali caratteristici

Presentano un comportamento iper-sociale e interagiscono bene con le altre persone. Sono molto sensibili al rumore e hanno buone capacità musicali. (percepisce i componenti dell'oggetto ma non vengono disposti correttamente, disorganizzati. Non si ha una visione globale precisa di un oggetto), che contrasta con le buone capacità di linguaggio. PUNTO 2.

Es.: Metafase di un portatore della traslocazione sbilanciata der(2)t(2;16) ibridata con sonda che riconosce le regioni subtelomeriche del cromosoma 16 (16p e 16q). PUNTO 3.

L'interruzione del gene FOG-2

Es.: (Friend of GATA 2 gene) mediata da una traslocazione bilanciata t(8;10)(23.1;21.1) è associata a difetti endocrinologici e difetti cardiaci.

Le FISH sono importanti anche per l'identificazione di tumori →

La citogenetica oncologica è una branca della genetica che studia le alterazioni cromosomiche associate ai tumori. Queste alterazioni possono fornire informazioni importanti sulla prognosi e sul decorso della patologia.

La diagnosi del cancro può avvenire attraverso un approccio citogenetico, che include l'analisi dei cromosomi. Ad esempio, nella leucemia mieloide cronica, la presenza del cromosoma Philadelphia (traslocazione t(9;22)) è un importante fattore prognostico.

Un altro approccio utilizzato è la citogenetica molecolare, che utilizza tecniche come la FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). La FISH permette di individuare specifiche alterazioni cromosomiche, anche quelle che non sono visibili tramite l'analisi del cariotipo. Ad esempio, la traslocazione t(15;17) (q22;q21) è associata alla leucemia acuta promielocitica (APL).

La FISH può anche rilevare riarrangiamenti cromosomici che si verificano più tardi nella progressione tumorale. In alcuni casi, la stessa regione cromosomica può essere duplicata molte volte, formando cromosomi anomali.

La FISH può essere effettuata anche sui nuclei interfasici, permettendo di evidenziare la presenza di aneuploidie. Questa tecnica viene utilizzata anche nella diagnostica prenatale per rilevare le trisomie più comuni, come la trisomia 13, 18 e 21, e le anomalie dei cromosomi sessuali (X, XXY e XYY).

Le sonde utilizzate nella FISH sono specifiche per il DNA alfa satellite.

Dei corrispondenti centromeri o sonde locus specifiche. In genere l'analisi citogenetica prenatale viene effettuata in circa 10 giorni questa tecnica invece risulta molto rapida (24-48), viene infatti effettuata su amniociti non in coltura. Nelle FISH su nuclei interfasici la cromatina nei nuclei interfasici è meno compattata.

Un locus di riferimento permette di ottenere un ordine cen-tel. Permette in ogni caso di ordinare sequenze nell'ordine di 500kb (range di risoluzione: 5-2Mb) di inversioni "criptiche" → Identificazione Utilizzando contemporaneamente tre sonde si ha infatti la possibilità di evidenziare un ordine dei tre loci (nel caso della presenza di una inversione) diverso da quello atteso.

Rilevamento della micro-duplicazione mediante FISH su nuclei interfasici: Il 98% dei casi di Charcot Marie Tooth (CMT-1A) sono causate da una duplicazione di 1.5 Mb di una regione localizzata in 17p12 contenente il gene PMP22. Mappaggio fisico di specifici

loci:

- Mappaggio a bassa risoluzione FISH su cromosomi metafasici mappaggio fisico dell'ordine di 5 Mb. I cromosomi metafasici sono condensati e quindi il potere di risoluzione è basso

- Mappaggio ad alta risoluzione FISH su cromosomi stirati meccanicamente viene effettuata su cromosomi metafasici sottoposti a centrifugazione. Cromosomi sono ancora visibili ma più lunghi. Potere di risoluzione 0.5-1 Mb

FISH SU FIBRE CROMATINA

1. Lisi cellulare con un detergente e rilascio della cromatina.
2. Il DNA viene quindi lasciato fluire lungo il vetrino.
3. A questo punto si effettua la FISH. Potere di risoluzione molto elevato (1-500 kb).

un'analisi qualitativa che quantitativa È possibile sia (fibre devono essere altamente uniformi).

Es.: Mappaggio fisico di regioni che contengono clones gaps utilizzando sonde fiancheggianti il gap.

Sonde usate in FISH:

• WCPs (Whole Chromosome Paints)
• PCPs (Partial Chromosome Paints)
• Sequenze ripetute centromeriche (alfoidi)

satelliti→o Sonde YAC/BAC/PAC. subtelomeriche

La FISH è una tecnica estremamente duttile, applicabile in molteplici campi non solo diagnostici, elevata sensibilitàma anch’essa ha un limite →importante bisogna sapere a priori la regione da investigare, a meno che non si haqualche indizio utile quale ad esempio nella situazione in cui il paziente presenta un quadro clinico noto associato aduna precisa regione/gene che non sembra apparentemente coinvolto.

La FISH può essere applicata a diverse condizioni (duttile) aumentando la risoluzione della tecnica (che potrebbeaumentare ulteriormente passando dai nuclei in interfase alle fibre cromatiniche).

Molto più spesso esistono situazioni patologiche che sospettano fortemente il coinvolgimento di un riarrangiamentocromosomico con un quadro clinico però non assimilabile a patologie ad eziologia nota. In queste situazioni nonè possibile utilizzare queste tecniche appena descritte.

Perché non sappiamo quale regione potrebbe essere coinvolta.→ utilizzo di tecniche di ibridazione comparativa CGH ed array-CGH:

CGHtecnica inizialmente è stata sviluppata per l'analisi di cellule tumorali. La consiste nel marcare con due fluorocromi diversi la stessa quantità di DNA genomico proveniente da un individuonormale/cellule sane (controllo) e dalle cellule tumorali (di solito dello stesso individuo). Mediante l'uso del Cot1 DNA (ibridazione competitiva) viene ibridata la stessa quantità di DNA marcato con due diversifluorocromi che quindi competono per lo stesso DNA target.

A questo punto se la quantità di una particolare regione è identica nei due campioni ci sarà la stessa intensità di fluorescenza (rapporto = 1).

Se invece nel campione tumorale una regione è presente in copie multiple (es.: triplice copia), ci saranno più sonde marcate con un fluorocromo e anche l'intensità.

sarà differente. Si identificano regioni all'interno del cromosoma con un numero di copie maggiore nel tumore rispetto al campione-controllo. È una misurazione relativa che parte dal presupposto che il controllo presenta due copie di tutto il genoma, ma in realtà non è proprio così. La tecnica permette di rilevare riarrangiamenti grossolani con risoluzione identica alla citogenetica classica in quanto si usano sempre le metafasi (stessi limiti di FISH e bandeggio). Nei laboratori di citogenetica clinica si usa per diagnosi post-natali.

• È necessario fotografare e valutare più metafasi e nelle metafasi;
• chr per chr tenendo conto dell'asseAnalizzare del chr;
• Confrontare la fluorescenza di quel particolare chr nelle diverse metafasi:
• Giallo = n° di copie tra controllo e tumore identico;
• Rosso = regioni duplicate;
• Verde = regioni delete.

Tecnica poco usata per analizzare riarrangiamenti di numero nellaLa citogenetica clinica post-natale è spesso utilizzata per individuare piccole delezioni cromosomiche, che possono essere inferiori a 5 Mb (risoluzione minima tecnica). Un approccio metodologico evoluto chiamato ARRAY-CGH viene utilizzato per questo scopo. In questo metodo, non vengono più utilizzate le metafasi (con una risoluzione di 10-5 Mb), ma viene utilizzato un supporto diverso chiamato array. Un array consiste in un vetrino su cui vengono posizionati degli oligonucleotidi (di solito 60 basi) che coprono l'intero genoma. Ogni oligonucleotide rappresenta una sonda che copre una specifica regione del genoma con una risoluzione diversa a seconda del numero di sonde utilizzate. Ogni sonda è riconosciuta da uno spot sul vetrino. Dopo vari lavaggi, simili a quelli utilizzati nella tecnica FISH, l'array viene analizzato utilizzando uno scanner per misurare i diversi gradi di fluorescenza dei fluorocromi in ogni spot. Una volta completata la scansione, viene ottenuta una fotografia che viene caricata su un software apposito. Utilizzando il software, è possibile identificare la regione associata a ciascuno spot e conoscere la posizione cromosomica delle diverse sonde. In questo modo, viene ottenuto il profilo array. Quindi: 1.Al DNA del paziente e del controllo si aggiungono sonde fluorescenti e si pongono negli spot del microarray. Si ha l'ibridizzazione al microarray. Il microarray è scannerizzato e si rileva l'intensità della fluorescenza. Tramite software informatici si genera il plot. Profilo array: Valore = rapporto tra fluorescenza del test e del reference. Il profilo atteso è di 0 log (0) = 1 spot intorno allo 0 no delezione, duplicazioni. Se è delezione il rapporto è log (1/2) = -1 spot saranno spostati a sinistra intorno al -1. Se si ha una copia in più, duplicazione, 3/2 è log (3/2) = 0,58 , spot spostati a destra. Tecnica utile anche per delezioni in omozigosi. Diagnosi e screening prenatale. LEZIONE 5 La condizione per la quale si fanno test e diagnosi.