Genetica medica

GENETICA MEDICA

CITOGENETICA E ANALISI DEL CARIOTIPO

Studio dei cromosomi, molecole di DNA assemblate con proteine istoniche e non istoniche

diverse patologie in cui è implicato riarrangiamento cromosomico

CARIOTIPO

Insieme di cromosomi, certo numero e certa morfologia, specie specifico

⇾

tutte le specie che si riproducono sessualmente diploidia, numero pari di cromosomi

coppia di cromosomi omologhi (autosomi), oltre i sessuali che sono eterosomi

ogni specie animale è caratterizzata da un proprio assetto di cromosomi che si mantiene costante, per numero e morfologia, di

generazione in generazione

Negli individui appartenenti a specie a riproduzione sessuata, questo aspetto è costituito da n paia di cromosomi, che nel loro

insieme costituiscono il corredo cromosomico, o cariotipo diploide 2n

per ogni coppia: un cromosoma di origine materna e uno di origine paterna

No correlazione tra numero cromosomi e numero di geni

Importanza studio del cariotipo in medicina:

- 1:200 neonati ha una patologia cromosomica

oltre il 50% degli aborti spontanei ha anomalie cromosomiche (soprattutto aneuploidia)

- 1:100 individui sani, ha anomalia bilanciata che può essere associata a infertilità/poliabortività, rischio di trasmissione alla

progenie in modo non bilanciato

La maggior parte dei tumori ha anomalie cromosomiche multiple

CROMOSOMI OMOLOGHI

Uno di derivazione materna, uno di derivazione paterna

membri di una coppia di cromosomi sono chiamati omologhi, sono uguali per forma e posizione dei loro centromeri

Portano l'informazione per il controllo dello stesso tipo di caratteristiche genetiche, sebbene non necessariamente un'identica

informazione (uno potrebbe avere un gene mutato e l'altro no)

I cromosomi omologhi contengono DNA che codifica per le stesse proteine

hanno gli stessi geni nella medesima posizione, ma possono presentare varianti diverse (allele)

Nell'analisi del cariotipo, cromosoma formato da due cromatidi

possibile da effettuare solo su cellule in grado di diversi, cellule bloccate durante la mitosi

già avvenuta replicazione (per questo sono due) e in fase di divisione

Importanza dell'analisi dei cromosomi durante divisione, cromatina superavvolta, visibile al microscopio ottico

impacchettamento della cromatina all'interno del nucleo, necessario soprattutto per la regolazione dell'espressione genica

Variazione del contenuto di DNA nei cromosomi durante ciclo cellulare

fase S: 46 cromosomi lineari, una doppia elica per cromosoma 2C

fase G2: 46 cromosomi, due doppie eliche per cromosoma 4C

sempre stesso numero, ma cambia contenuto di DNA

Componenti strutturali e funzionali di un cromosoma:

⇾

Regione centromerica costrizione primaria, importanza durante la divisione lungo asse in un punto

mantiene uniti i cromatidi fratelli

braccio lungo q, braccio corto p

cinetocore: componente del centromero su cui prendono attacco i microtubuli del fuso

duplice, uno per ciascun cromatidio

⇾

Regione telomerica DNA ripetuto, essenziali per il mantenimento dell'integrità del cromosoma

hanno una sequenza comune, nell'uomo TTAGGG

assicurano la completa replicazione del DNA, le sequenze ripetute sono riconosciute dalla

telomerasi, la cui attività contrasta l’accorciamento progressivo dei cromosomi dovuto al

susseguirsi dei cicli normali di replicazione del DNA

TELOMERI sono essenziali per la stabilità dei cromosomi, favoriscono i legami con le proteine telomeriche che costituiscono la

capsula protettiva. La loro perdita determina instabilità delle estremità con la tendenza ad associarsi con altre estremità rotte di

altri cromosomi, coinvolti in eventi di ricombinazione o degradazione. Protezione delle estremità dei cromosomi dalla

degradazione e dalla fusione coda-coda con altri cromosomi.

1950 Si pensava il numero dei cromosomi fosse 48 (come gorilla), nell'uomo una copia è fusa

errore perché a volte si usavano cellule tumorale per valutare numero dei cromosomi

1956 Individuato numero corretto dei cromosomi, tecniche di bandeggio

fondamentale per conoscere sindromi e patologie genetiche

1959 Lejeune, analisi di sangue periferico di pazienti con sindrome di Down, scoprì un cromosoma 21 in più

1960 Cromosoma Philadelpia in leucemia mieloide cronica, piccolo cromosoma 22

1960 Conferenza di Denver, assegnare nome ai cromosomi

classificazione dal più grande al più piccolo (21 più piccolo di 22)

suddivisione in gruppi

1970 Bandeggi, colorazioni particolari, alternanza bande chiare/scure, fluo/no fluo

serie di bande caratteristica per ogni cromosoma A sinistra:

Bande Q con mostarda di Quinacrina

A destra:

Bande G con tripsina-Giemsa

1986 Inizio dell’epoca della citogenetica molecolare

Ibridazione in situ: applicazione di tecniche molecolare di ibridazione su preparati citologici, basati sull’osservazione che

sequenze nucleotidiche erano in grado di appaiarsi e formare degli ibridi stabili

prima utilizzo di anticorpi marcati con molecole fluorescenti in grado di individuare in modo specifico ibridi di DNA/RNA,

successivamente si fu un grado di marcare direttamente e indirettamente sonde con fluorocromi

ANALISI DEL CARIOTIPO

Necessario per lo studio dei cromosomi

- Allestimento di una coltura

- Preparazione vetrini

- Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

- Osservazione al microscopio ottico, selezione delle metafasi, conta dei cromosomi delle diverse metafasi, acquisizione delle

immagini e ricostruzione del cariotipo

1) Allestimento colture

Necessario avere cellule proliferanti da bloccare in metafase

Fonti di cellule in divisione: prelievo di sangue periferico con eparina

oppure utilizzo di midollo osseo, colture da tessuti ossei (fibroblasti, linfonodi, tumori solidi), colture da tessuti abortivi, liquido

amniotico, villi coriali, sangue fetale, linee cellulari immortalizzate (scopo di ricerca)

Sono necessari: ⇾

- anticoagulanti eparina (anticoagulante)

- terreno con soluzioni saline isotoniche, aminoacidi, vitamine, nucleotidi,

indicatore pH

- siero con fattori di crescita, zuccheri, proteine

- mitogeni:

fitoemoagglutinina PHA stimola proliferazione clonale di linfociti T

lipopolisaccaridi LPS inducono proliferazione dei linfociti B

specifici in base a cosa si deve analizzare

- veleni mitotici: bloccano cellule durante la metafase

colchicina impedisce formazione del fuso mitotico, impedisce

completamento della divisione cellulare

Fibroblasti hanno capacità di aderire alla flaxs, a confluenza si staccano con tripsina e si dividono in più flaxs diverse

Cellule in via di divisione non sono adese alla flaxs, ma assumono morfologia tondeggiante (non si usa tripsina ma si batte la

flaxs)

2) Preparazione dei vetrini

Utilizzate stanze con cappe in modo da creare ambiente ideale per le cellule

Le cellule vengono risospese in una quantità opportuna di fissativo fresco

fatte cadere mediante sgocciolamento (2/3 gocce) su vetrini pretrattati con miscela di alcool assoluto e HCl posti in acqua

distillata ⇾

Dropping cellule man mano si asciugano, spread e distribuzione dei cromosomi

se condizioni non ottimali, citoplasma resta adeso ai cromosomi, oppure possono disporsi troppo lontani fra loro

Cromosomi della stessa cellula devono rimanere vicini fra loro

Umidità e temperatura dell'ambiente devono essere controllate: temperatura di 20 °C con un'umidità di poco superiore al 50%

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali

Cromosomi vengono classificati in base alla loro dimensione e alla posizione del centromero

⇾

In base alla posizione del centromero si distinguono in metacentrico

centromero a metà, le braccio sono molto simili

⇾ submetacentrico

centromero verso l’alto, braccio corto sopra e braccio lungo sotto

⇾ acrocentrico

braccio corto molto piccolo, presenza di DNA satellite altamente

ripetuto

Sebbene la posizione del centromero e la lunghezza relativa dei due bracci aiutino

l’identificazione di specifiche coppie di cromosomi, alcuni cromosomi sembrano

identici utilizzando solo questo criterio

TECNICHE DI BANDEGGIO CROMOSOMICO

L’abilità di identificare con certezza specifici cromosomi è stata conquistata con la scoperta di alcuni fluorocromi e con la messa

a punto di protocolli di bandeggio cromosomico che usati creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del

cromosoma, specifica per ogni coppia di omologhi (pattern riproducibile di bande)

Il bandeggio cromosomico è da allora diventato standard e indispensabile per l’analisi citogenetica

Ognuna di queste tecniche produce un pattern di bande chiare e scure (fluorescenti e non) lungo l’intero cromosoma

Ogni coppia di cromosomi mostra un unico pattern di bandeggio, analogo ad un ‘bar code’ che ci permette di differenziare l’uno

dall’altro cromosomi della stessa dimensione e stessa posizione del centromero

⇾

BANDE G trattamento con Tripsina, colorazione con Giemsa

bande scure ricche in AT

⇾

BANDE Q colorazione con Quinacrina, colorante fluorescente che non si lega alle zone ricche in AT

nelle regioni ricche in AT la fluorescenza è più stabile e quindi più luminosa perché decade lentamente

⇾

BANDE R denaturazione al colore in soluzione salina, poi colorazione con Giemsa

denaturazione delle zone ricche in A e T, quindi si ottiene un pattern di bandeggio reverse rispetto al bandeggio G

⇾

BANDE C denaturazione in soluzione satura di idrossido di bario, poi colorazione con Giemsa

mettono in evidenza l’eterocromatina costitutiva

Bandeggio G Prodotto dalla colorazione con Giemsa dopo la digestione enzimatica con tripsina

- bande scure (bande G) replicano tardivamente, hanno cromatina condensata e ricche in AT

- bande chiare (G negative) replicano precocemente, hanno cromatina meno condensata e

ricche in GC

Bande scure contengono pochi geni, quelle chiare ne contengono molti

Bandeggio Q Cromosomi vengono colorati con Quinacrina fluorescente e osservati in fluorescenza

- bande fluorescenti sono ricche in AT

- bande spente sono ricche in GC

Bandeggio R Bande chiare regioni ricche in AT

Bande scure regioni ricche in CG

Esistono due metodiche:

- RHG

Denaturazione con il calore (85°C) delle regioni AT che contengono solo due legami a idrogeno,

per questo si denaturano velocemente, mentre le regioni CG restano in forma nativa

Colorazione con Giemsa, si colorano solo le regioni ricche in GC (bande scure)

- RBA

Si ottiene aggiungendo in coltura nella fase tardiva S del BrdU (bromodiossiuridina) con incorporazione dello stesso solo nel

DNA che si replica tardivamente, i cromosomi ottenuti vengono colorati con Arancio di Acridina

Le bande fluorescenti sono quelle ricche in GC, le bande più spente sono quelle ricche in AT

Zone di replicazione tardiva incorporano il BrdU e non si colorano molto perché la fluorescenza decade subito

regioni con replicazione tardiva hanno aspetto più pallido

Metodica per distinguere quale cromosoma X è attivo: quelle inattiva ha un aspetto più pallido, no distinzione di basi per la

colorazione omogenea

Bandeggio C Non consente la composizione del cariotipo

Colorazione di regioni di eterocromatina costitutiva

Cromosomi denaturati con idrossido di bario e colorazione con Giemsa

Visualizzazione degli scambi tra cromatidi fratelli:

quando BrdU è presente per due interi cicli cellulari, un cromatide conterrà una sola catena polinucleotidica con l’incorporazione

mentre l’altra avrà incorporato su entrambe le catena Colorazione NOR

Permette la visualizzazione delle braccia corte dei cromosomi

acrocentrici (RNA ribosomiale altamente ripetuto)

Come si fa il cariotipo?

1- Si contano i cromosomi: importante per escludere la presenza di alterazioni del numero cromosomico

2- Appaiamento degli omologhi per similarità

3- Si mettono in ordine secondo la convenzione

Terminologia:

46, XX cariotipo normale femminile

46, XY cariotipo normale maschile

Numero totale dei cromosomi e sesso

⇾

Sistema internazionale nomenclatura ISCN

Ogni braccio è suddiviso in regioni, ogni regione è numerata a partire della regione più vicina al centromero (prossimale) a quella

più lontana (distale), numerazione da centromero verso telomero

Braccio corto p

Braccio lungo q

Risoluzione diversa in bandeggio, di solito utilizzata quella di 400 bande

per avere una risoluzione diversa deve variare il grado di condensazione della cromatina

Con un cariotipo standard si riesce a vedere un riarrangiamento che si maggiore di 5/10 Mb

Vi possono essere alcune varianti fra i cromosomi omologhi, ma sono

POLIMORFISMI

di solito coinvolgono regioni eterocromatiche e con sequenze ripetute

(1, 6, 16 cromosomi acrocentrici)

variazioni dell’eterocromatina pericentromerica

Un cromosoma diverso dall’altro (differenze tra cromosomi omologhi)

Può esserci polimorfismo per il cromosoma Y, variazioni di grandezza del

braccio lungo

Esistono anche dei polimorfismi eucromatici che non sortiscono effetto patologico (cromosoma 9/18)

⇾

Quando le cellule vengono messe in coltura, possono riscontrarsi delle regioni soggette a rottura regioni fragili

Siti fragili sono una specifica regione cromosomica che appare come un intervallo non colorato (gap) o come una franca rottura

sul cromosoma metafasico

ANOMALIE CROMOSOMICHE

La citogenetica clinica studia i cromosomi, la loro struttura ed eredità

applicati alla pratica della genetica medica

Le anomalie cromosomiche rappresentano la classe principale delle malattie genetiche

Possono essere:

- bilanciate: no perdita di materiale genomico, nella maggioranza dei casi non vi è fenotipo anomalo

⇾

- non bilanciate: perdita o acquisizione di materiale genetico fenotipo patologico (malformazioni e/o ritardi mentali)

La gravità è correlata al tipo di cromosoma e alla quantità dei geni interessati

Tanto più grave è lo sbilanciamento cromosomico, tanto più grave sarà il fenotipo o più precoce l'aborto spontaneo

Severità dipende dal numero di geni presenti e dalla grandezza del segmento coinvolto

se sono geni sensibili al dosaggio o meno

Per anomalie cromosomiche si intendono le mutazioni che producono un'alterazione cromosomica

possono essere suddivise in anomalie di numero e anomalie di struttura

Le anomalie cromosomiche possono essere:

⇾

- costitutive tutte le cellule sono portatrici di un riarrangiamento, difetto già nello zigote

⇾

- acquisite post-zigotico, mosaicismo, cellula tumorale

Non tutte le alterazioni possono essere identificate perché esiste un limite di risoluzione pari a 5-10 Mb (citogenetica standard)

ANOMALIE CROMOSOMICHE

⇾

del NUMERO poliploidie (triploidie, tetraploidie)

⇾ aneuploidie (trisomie, monosomie)

⇾

della STRUTTURA SBILANCIATE

delezioni, duplicazioni, isocromosomi, cromosomi ad anello, marcatori sovrannumerari

⇾ BILANCIATE

traslocazioni (reciproche e robertsoniane), inversioni (paracentriche e pericentriche), inserzioni

Le anomalie cromosomiche rappresentano la patologia più frequente del concepimento e, nonostante la fortissima selezione

naturale mediante l'aborto spontaneo, la loro frequenza alla nascita è elevata

Alta instabilità genomica e cromosomica durante le prime divisioni cellulari a livello embrionale

Solo 25/30% dei concepimenti riesce a sopravvivere, alto livello di riarrangiamenti che provocano aborto durante le prime

divisioni cellulari

La presenza di questi riarrangiamenti spiega la presenza di mosaicismo a livello placentare che può essere visibile durante

l'analisi dei villi coriali Nel caso B

il mosaicismo è confinato alla placenta e agli annessi embrionali

embrione ha cellule normali

Come si è capito che questo evento non è così raro?

Analisi blastomero per blastomero di 23 embrioni (tecniche di fecondazione assistita)

solo 2/23 non presentano riarrangiamenti

instabilità cromosomica molto comune nelle prime fasi di sviluppo embrionale

ANOMALIE DI NUMERO

⇾

EUPLOIDIE cellula che contiene set cromosomico completo, esatto multiplo del numero cromosomico aploide

⇾

POLIPLOIDIA costituzione di cellule o organismi che contengono un set cromosomico in più

triploidi: contengono un set completo in più di cromosomi (3n)

tetraploidi: contengono due set in più (4n)

⇾

ANEUPLOIDE coinvolge solo alcuni cromosomi, non intero set cromosomico

singoli cromosomi in copia aggiuntiva, anomalie di singoli cromosomi

trisomia se vi è la presenza di un cromosoma in più

monosomia se presente solo una copia

⇾

NULLISOMIA mancano entrambi i cromosomi di una coppia (no compatibile con la vita)

Triploidia

Cellule che hanno 69 cromosomi (3n)

cariotipo 69XXX, 69XYY, 69XXY

Causata da una doppia fertilizzazione

Causate da un’errata divisione meiotica della cellula uovo (causata ad esempio dalla ritenzione del corpo

polare) o del gamete maschile

15% degli aborti spontanei, una delle cause più comuni

Due apporti materni causano un aborto molto precoce ⇾

Set di geni espressi solo da cromosoma paterno, certi solo da cromosoma materno loro apporto

non è lo stesso

Tetraploidie ⇾

Cariotipo 92, XXXX o XXXY risultato di una non corretta divisione mitotica di una cellula 2n

6% aborti spontanei con causa cromosomica, si possono trovare in tumori solidi

⇾

Endomitosi replicazione non seguita da divisione cellulare

ANEUPLOIDIE

Cellule con cromosomi in più e in meno, ma non equivalente ad un multiplo esatto del corredo aploide

Sovrannumero o mancanza di un cromosoma

Rappresentano le più frequenti aberrazioni cromosomiche numeriche

- trisomia: presenza di un cromosoma aggiuntivo

- tetrasomia: presenza di due cromosomi aggiuntivi

- monosomie: mancanza di un cromosoma

Rappresentano il principale fattore eziologico alla base di un alterato sviluppo fetale

spesso aborto nelle prime settimane (alta selezio