Fosforilazione ossidativa - Schemi riassuntivi di Biochimica

O.

molecolare, riducendolo a H

2

Il complesso IV è un enzima di grandi dimensioni della membrana

mitocondriale interna.

3 sono le subunità fondamentali per la funzionalità del complesso IV. La

subunità II contiene due ioni Cu che formano complessi con gruppi –SH di due

, la subunità I contiene due

residui di Cys in un centro binucleare chiamato C A

, e un altro ione rameico (Cu ). L’eme a e il Cu formano un

gruppi eme, a e a

3 B 3 B

secondo centro binucleare, che accetta elettroni dal gruppo eme a e li

.

trasferisce all’ossigeno che si lega al gruppo eme a 3

Il flusso degli elettroni attraverso il complesso determina lo spostamento di +

protoni dalla matrice allo spazio intermembrana, terza pompa protonica: ‐2 H

per ogni coppia di elettroni.

In sintesi il flusso di elettroni e protoni attraverso i quattro complessi della catena

respiratoria:

La NADH deidrogenasi della membrana mitocondriale interna delle cellule animali

accetta elettroni solo dal NADH presente nella matrice. Dato che la membrana

interna non è permeabile al NADH citosolitico, come viene riossidato il NADH

prodotto dalla glicolisi nel citosol e come arrivano i suoi elettroni alla catena

respiratoria e quindi all’ossigeno? Speciali sistemi navetta (shuttle) trasportano gli

equivalenti riducenti dal NADH citosolitico all’interno dei mitocondri mediante via

indiretta.

Il sistema navetta più attivo è lo shuttle del malato‐aspartato. Gli equivalenti

riducenti del NADH citosolitico sono prima trasferiti all’ossalacetato citosolitico,

producendo malato, mediante l’azione della malato deidrogenasi citosolitica. Il

malato attraversa poi la membrana interna ed entra nella matrice, traslocato dal

sistema di trasporto dell’α‐chetoglutarato. All’interno della matrice gli equivalenti

+ , formando NADH, in una reazione catalizzata dalla malato

riducenti tornano al NAD

deidrogenasi della matrice mitocondriale. L’ossalacetato citosolitico viene

rigenerato da reazioni di transamminazione e dall’azione di trasportatori specifici, in

modo da iniziare un altro ciclo del sistema navetta.

In sintesi:

1. Il NADH citosolitico entra nello spazio intramembrana attraverso delle

aperture nella membrana esterna, poi passa i suoi due equivalenti riducenti

all’ossalacetato per produrre malato

2. Il malato viene trasportato attraverso la membrana interna dal trasportatore

malato‐α‐chetoglutarato + , il

3. Nella matrice il malato trasferisce i suoi due equivalenti riducenti al NAD

NADH così generato viene poi riossidato dalla catena respiratoria

mitocondriale.

4. L’ossalacetato, il prodotto di ossidazione del malato, non può ritornare

direttamente nel citosol e quindi viene prima transamminato ad aspartato

5. L’ossalacetato viene rigenerato nel citosol

6. Il ciclo è così completato

LA SINTESI DELL’ATP

Il modello chemiosmotico proposto da Peter Mitchell afferma che l’energia

elettrochimica contenuta nella differenza di concentrazione protonica e nella

separazione delle cariche attraverso la membrana mitocondriale interna, cioè la

forza motrice protonica, porta alla sintesi di ATP quando il flusso protonico inverte la

sua direzione e i protoni ritornano nella matrice attraverso un canale protonico

associato all’ATP sintasi.

Mitchell definì “chemiosmotiche” quelle trasformazioni che comportano

simultaneamente una reazione chimica e un processo di trasferimento; questo

processo viene spesso chiamato “accoppiamento chemiosmotico”. Il termine

“accoppiamento” si riferisce all’assoluta dipendenza della sintesi di ATP nei

mitocondri dal flusso degli elettroni attraverso la catena respiratoria.

Il consumo di ossigeno e la sintesi di ATP dipendono dalla presenza di un substrato

.

ossidabile, di ADP e P i

Dato che l’energia rilasciata dall’ossidazione del substrato favorisce la sintesi di ATP,

ci si può aspettare che l’inibizione del flusso di elettroni verso l’ossigeno blocchi la

sintesi di ATP. È invece sorprendente che il contrario sia altrettanto vero: l’inibizione

della sintesi di ATP blocca anche il trasferimento di elettroni nei mitocondri intatti.

La teoria chemiosmotica spiega la stretta dipendenza del trasferimento di elettroni

dalla sintesi di ATP mitocondriale.

La forza motrice protonica si accumula fino a che l’energia libera necessaria per il

pompaggio protonico contro gradiente fuori della matrice non eguaglia o addirittura

supera l’energia rilasciata dal trasferimento elettronico dal NADH all’ossigeno.

In altri termini: il flusso di elettroni è accompagnato dalla traslocazione dei protoni

attraverso la membrana che produce un gradiente elettrochimico. La membrana

mitocondriale interna è impermeabile ai protoni, che per rientrare devono

.

attraversare i canali proteici del complesso F 0

La forza motrice protonica che spinge i protoni verso la matrice fornisce l’energia

associato ad F (ATP sintasi).

per la sintesi di ATP, catalizzata dal complesso F 1 0

L’ATP sintasi mitocondriale è un’ATPasi di tipo F. Questo grande complesso

enzimatico della membrana mitocondriale interna catalizza la formazione di ATP da

ADP e P , accompagnata dal flusso protonico dal lato P al lato N della membrana.

i

L’ATP sintasi, detta anche complesso V, è formata da 2 componenti distinti:



‐ F una proteina periferica della membrana

1  una proteina integrale della membrana.

‐ F 0

Sulla superficie dell’enzima, la reazione ADP + P ↔ ATP + H O è facilmente

i 2

reversibile. dei mitocondri è costituito da 9 subunità di 5 tipi diversi, con la

Ogni complesso F 1

β γδε. Ciascuna delle 3 subunità β ha un sito catalitico per la sintesi

composizione α 3 3

di ATP.

La subunità γ possiede un dominio che costituisce l’asse centrale del complesso e un

dominio che si associa a una delle β, detta subunità vuota.

La conformazione delle β cambia se associata a γ.

ha una forma a pomello simile a una sfera schiacciata ai poli,

La porzione F 1

costituita da un’alternanza di subunità α e β disposte come gli spicchi di un’arancia.

Il complesso F che costituisce il canale protonico è composto da 3 subunità a, b e c

0 c , dove n varia da 8 a 15 a seconda dell’organismo.

nelle seguenti proporzioni: ab 2 n , mantenendolo legato alla membrana.

Le due subunità b si fissano ad α e β di F 1

Quando i protoni fluiscono attraverso F , il cilindro e l’asse ruotano, e le subunità β

0

cambiano conformazione, in questo modo γ si associa a turno con ciascuna di

di F

1

esse.

Paul Boyer propose un meccanismo di catalisi rotazionale in cui i 3 siti attivi di F 1

catalizzano a turno la sintesi di ATP.

Ogni coppia αβ possiede un sito di legame per ATP che può oscillare fra 3 diverse

conformazioni:



‐ β ‐ ATP lega saldamente ATP



‐ α ‐ ADP lega debolmente ATP



‐ β – vuota lega molto debolmente ATP

la forza motrice provoca la rotazione della subunità γ centrale, che entra in contatto

in successione con ciascuna coppia αβ. La conformazione di legame con γ è β‐vuota.

Ciò produce una modificazione conformazionale cooperativa nelle tre subunità che

, ATP, o il rilascio di ATP.

consente il legame alternativo ad ADP + P i

Una data subunità β comincia il ciclo di catalisi nella sua conformazione α‐ADP,

recuperati dall’ambiente circostante. A questo punto la subunità

legando ADP e P i

cambia la sua conformazione, assumendo la forma β‐ATP che lega saldamente e

stabilizza l’ATP, generando uno stato di equilibrio tra ADP + P e ATP sulla superficie

i

dell’enzima. Infine, la subunità modifica ulteriormente la sua conformazione,

assumendo quella β‐vuota, che ha pochissima affinità per l’ATP, e il nucleotide

appena sintetizzato lascia la superficie dell’enzima. Un altro ciclo di catalisi ha inizio

.

quando questa subunità assume di nuovo la forma α‐ADP e lega ADP e P i

La subunità che lega:



‐ ADP + P ADP conformation o Loose

i 

‐ ATP formation ATP conformation o Tight



‐ ATP release empty conformation o Open

Le modificazioni conformazionali alla base di questo meccanismo sono dovute al

passaggio di protoni attraverso la porzione F dell’ATP sintasi. Il flusso di protoni

0

provoca la rotazione del cilindro costituito dalle subunità c e

attraverso il “poro” F 0

dalla subunità γ a esso associata. La subunità γ attraversa il centro della struttura

β , che è tenuta fissa rispetto alla superficie della membrana dalle

sferoidale α 3 3

e δ. Ogni rotazione di 120° pone γ in contatto con una diversa subunità

subunità b 2

β, e questo contatto costringe la subunità β ad assumere la conformazione β –

vuota.

Le 3 subunità β interagiscono tra di loro in modo tale che quando una assume la

conformazione β‐vuota la subunità presente su un lato deve assumere la

conformazione α‐ADP, mentre quella sull’altro lato acquista la forma β‐ATP. In

questo modo per ogni rotazione completa della subunità γ ogni subunità β compie

un ciclo attraverso le 3 possibili conformazioni, e per ogni rotazione vengono

sintetizzate e rilasciate dalla superficie dell’enzima 3 molecole di ATP.

La forza motrice protonica fornisce energia al trasporto attivo.

La funzione principale del gradiente protonico nei mitocondri è di fornire energia

per la sintesi di ATP durante la fosforilazione ossidativa. Tuttavia questa energia può

servire anche a favorire diversi processi di trasporto essenziali per a fosforilazione

ossidativa. Abbiamo visto che la membrana mitocondriale interna è in genere

impermeabile alle specie cariche, ma due sistemi specifici presenti in questa

nella matrice e ATP nel citosol.

membrana trasportano ADP e P

i

La traslocasi dei nucleotidi adninici, una proteina integrale della membrana

3‐ nello spazio intramembrana e la

mitocondriale interna, lega una molecola di ADP 4‐ che

trasporta nella matrice, scambiandola con una molecola di ATP

contemporaneamente esce dalla matrice. La forza motrice protonica favorisce lo

scambio tra ADP e ATP. La traslocasi dei nucleotidi adeninici è inibita selettivamente

dall’atrattiloside. Se questo trasp