Formazione pratica in nanotecnologie biomediche e terapie avanzate

Congelamento del tessuto

Se congeliamo non è obbligatorio fissare il tessuto prima, il tessuto viene immerso o in azoto liquido, NON DIRETTAMENTE si mette il tessuto in un contenitore, o a contatto con il ghiaccio secco o utilizzando deisolventi opportuni che servono per controllare la temperatura (isopentano). Questo induce la solidificazione del mezzo, è un metodo soft di inglobazione del tessuto all'interno di una resina, si presenta in modo completamente diverso, il taglio è diverso e la temperatura ovviamente sarà diversa. Nel caso dell'OCT si taglia a -20°C col triostato, le sezioni ottenute sono molto meno belle di quelle ottenute con la paraffina, è richiesta una certa capacità di tagliare il tessuto senza danneggiarlo bisogna fare attenzione che non rimangano delle bolle nell'OCT. Con questa procedura c'è da livellare in modo da esporre il tessuto dove vogliamo incominciare a tagliare, questi strumenti.

tagliano in modo continuo quindi man mano che tagliamo il campione viene verso la lama una volta che il tessuto è ben esposto si inizia a tagliarlo. Con un vetrino ci avviciniamo alla sezione e il tessuto si attacca al vetrino che è stato caricato positivamente e l'OCT si scioglie e quindi non ce l'abbiamo più questo è un grande vantaggio dell'OCT, la paraffina deve essere rimossa mentre nel caso dell'OCT rimane solo il tessuto attaccato al vetrino. Se non era stato fatto precedentemente il tessuto deve essere fissato dopo che è stato sezionato, una volta tagliato deve essere fissato. Per quanto riguarda i tessuti in OCT bastano un paio di minuti in formalina e il tessuto si crosslinka immediatamente e avrà uno spessore di max 50 micron.

RECUPER DELL'ANTIGENE

Specialmente se siamo in paraffina e quindi abbiamo crosslinkato il tessuto prima dell'embedding si deve fare questo processo perché quando crosslinko il

Il tessuto si nascondono gli epitopi. Per recuperare l'antigene dobbiamo rompere i ponti che si sono formati durante la fase di fissazione, si può fare in due modi: col calore o con l'azione enzimatica. Nel primo caso parliamo di HIER o PIER se usiamo gli enzimi. Queste due tecniche si possono anche sovrapporre, lo scopo finale è quello di recuperare la posizione degli antigeni di interesse e liberare l'epitopo di interesse in modo che l'anticorpo primario lo possa riconoscere. Solitamente si usa la tecnica con il calore in quanto spesso gli enzimi ci servono nel riconoscimento e quindi la presenza di enzimi estranei aggiunti per rimuovere il crosslinking che poi non vengono rimossi correttamente può essere rilevato dall'anticorpo primario o può danneggiare l'anticorpo primario. Tutte e due le tecniche sono da ottimizzare, devo scegliere le condizioni più opportune di preparazione del campione in base a quello che voglio.

vedere.Il vantaggio del calore è che ci sono meno parametri da ottimizzare, la temperatura, la durata dell'esposizione e il pH normalmente si utilizzano pH da 6 in su mentre la tecnica enzimatica si fa a pH 7.4 a temperatura ambiente mentre con il calore si arriva a 90-95°C però è una tecnica veloce mentre per la degradazione enzimatica può durare da 5 min a mezz'ora, la tecnica con gli enzimi richiede una serie di ottimizzazioni in più che non sono richieste quando si usa il calore.La tecnica con il calore può danneggiare il campione se scaldiamo troppo mentre utilizzando una degradazione enzimatica troppo spinta si possono danneggiare gli epitopi. A seconda del buffer, del pH e delle condizioni in cui recuperiamo l'antigene otterremo risultati diversi. Sostanzialmente quando fissiamo il tessuto introduciamo dei crosslink che si rompono con il calore, la scelta del buffer e del pH influirà sulla conformazione che la

proteinaassumerà una volta rotti i legami di cross-link. A seconda del pH se basico o acido la proteina esporrà l'epitopo in modo diverso e questo è ciò che dobbiamo ottimizzare. Ci sono diversi modi di scaldare, si possono usare le bande di acqua calda, non rischio di danneggiare il campione per eccessivo calore, oppure si può usare un generatore di pressione, il microonde o la pentola a pressione che mi consente di lavorare con grandi quantità di campione, è molto riproducibile, poco operatore dipendente, c'è qualche rischio per quanto riguarda l'eccessiva esposizione ma è il metodo di elezione. Devo bloccare il tessuto per impedire che ci sia un legame aspecifico con altre proteine presenti sul tessuto, non voglio che l'anticorpo si adsorba sul tessuto senza legarsi in modo specifico utilizzando una qualunque proteina che non contenga l'epitopo di nostro interesse, normalmente si utilizza il siero.

che sia prodotto da un animale che appartiene alla stessa specie a cui appartiene l'animale che ha prodotto l'anticorpo secondario, ci sono già i buffer per bloccare i tessuti che contengono tutte le sostanze necessarie. Gli anticorpi primari sono quasi tutti prodotti nel topo e quindi questo può produrre una lettura aspecifica, per questo sono stati prodotti dei buffer di bloccaggio commerciali che permettono di usare degli anticorpi anche quando non sono la scelta migliore ma sono l'unica possibilità che abbiamo. Dobbiamo bloccare gli enzimi endogeni, le perossidasi e la fosfatasi alcalina, normalmente usando i buffer commerciali l'attività di questi enzimi viene bloccata. Le perossidasi sono da bloccare in quanto l'HRP è una perossidasi, è un enzima che catalizza una reazione per vedere l'anticorpo secondario, se teniamo gli enzimi endogeni allora rischiamo che questi enzimi attivino la reazione con l'HRP equindi fanno formare il precipitato marrone che non corrisponde all'anticorpo secondario ma viene dalla catalizzazione del substrato in un altro punto non specifico del campione quindi dobbiamo bloccare le perossidasi endogene. Poi dobbiamo rendere il tessuto un po' più permeabile ai nostri anticorpi quindi nel caso delle cellule dobbiamo rompere un po' la membrana cellulare, soprattutto se cerchiamo delle proteine che si trovano all'interno della cellula, non dobbiamo aprire la membrana ma creare dei canali nella membrana usando dei surfattanti molto più soft di quelli usati nel western blot. Incubiamo con l'anticorpo primario che riconosce un epitopo del nostro antigene. L'anticorpo è formato da una struttura a Y in cui abbiamo delle catene leggere e delle catene pesanti, la catena pesante identifica la classe dell'anticorpo mentre le catene leggere contengono la FAb region, il sito di legame è in questa zona quindi non.Bobbiamo per forza usare un anticorpo intero ma possiamo anche solo usare la regione leggera. Ci sono anticorpi che riconoscono più epitopi che non appartengono necessariamente allo stesso antigene, gli anticorpi policlonali mentre quelli monoclonali riconoscono un solo epitopo. Se sappiamo quale proteina stiamo cercando e non ci interessa essere molto specifici possiamo usare un anticorpo policlonale altrimenti spendiamo di più e usiamo un anticorpo monoclonale che ha uno step di produzione in vitro in più e quindi costa di più. Se noi vogliamo produrre un anticorpo che riconosca una proteina presente nel siero umano iniettiamo questa proteina in una specie ospite e questa viene vista come un'agente esterno quindi il sistema immunitario tenderà ad aggredirla, i linfociti B sviluppano degli anticorpi specifici per un epitopo nell'antigene, in questo caso ogni cellula sviluppa più anticorpi specifici per diversi antigeni. Quando estraggo gli.

anticorpi avrò un mix di anticorpi specifici per epitopi diversi, non molto specifici. Se voglio produrre gli anticorpi monoclonali si parte in vivo, do all'animale l'antigene e questo sviluppa una serie di anticorpi contro diversi epitopo dell'antigene, a questo punto prendiamo le cellule immunitarie dalla milza dell'animale, queste cellule non vivono a lungo quindi vengono fuse con delle cellule immunitarie cancerogene e si crea un ibridoma per ottenere una linea cellulare immortalizzata che è in grado di produrre in vitro l'anticorpo, a questo punto si eliminano le cellule di mieloma che non si sono fuse con quelle del sistema immunitario e vice versa e si tiene solo l'ibridoma che viene a sua volta selezionato in funzione dell'anticorpo che produce e quindi selezioniamo solo la popolazione cellulare che produce un certo anticorpo per uno specifico epitopo. In alcuni casi è facile fare questa selezione e in altri casi meno,

dipende da quanto è grande l'epitopo e da quante sequenze complementari hai a disposizione per rilevare l'anticorpo. Altri fattori da considerare sono i contributi di fluorescenza dei fissativi, la formaldeide è auto-fluorescente per esempio quindi se scegliamo di non crosslinkare avremo meno contributo di autofluorescenza mentre in paraffina l'autofluorescenza sarà più elevata quindi si utilizzerà quasi sempre il metodo di rilevazione cromogenico quando usiamo l'embedding in paraffina e un metodo in fluorescenza quando facciamo l'embedding in OCT. Si devono introdurre dei controlli positivi, usiamo il nostro metodo su un tessuto che sappiamo esprimere l'antigene di interesse, e un controllo negativo, su un tessuto che sappiamo non esprimere l'antigene di interesse. Includiamo delle sezioni in cui si mette solo l'anticorpo secondario per vedere se questo si lega a qualcosa che non è l'anticorpo.primario quindi in questo test si spera di NON vedere la fluorescenza. 25I reagenti possono dare autofluorescenza, controlli di absorbimento, si mette un anticorpo non specifico e si valuta se si assorbe sul tessuto, se questo accade vuol dire che non abbiamo bloccato bene il tessuto. Generando molte sezioni del tessuto abbiamo molto tessuto su cui provare. Lo staning non ha nulla a che vedere con il riconoscimento dell'epitopo di interesse, viene anche chiamato controstaning, ma serve per vedere alcune zone del tessuto che servono per capire dove si trova il nostro anticorpo nel tessuto, il controstaining serve per vedere il resto del tessuto e vedere dove si trova l'anticorpo secondario per esempio l'H&E, l'ematossilina-eosina, l'ematossilina colora di blu i nuclei mentre l'eosina colora di rosa gli eritrociti e quindi si riesce a vedere se ci troviamo vicino a un vaso, i Ki67 è un indicatore di proliferazione cellulare e il Caspase 3 è.

Un indicatore di apoptosi. Si vede che è stato usato un metodo di rilevazione cromogenico utilizzando un substrato per l'enzima HRP, in immunoistochimica l'enzima che viene dato al substrato è il DAB che viene ossidato dalla perossidasi.