Formazione pratica in nanotecnologie biomediche e terapie avanzate

Formazione pratica in nanotecnologie biomediche e terapie avanzate

07.10.2019

Lezione introduttiva

La differenza fra le cappe chimiche e le cappe biologiche è che le cappe chimiche non sono mai a ricircolo

d’aria mentre nella cappa biologica l’aria può anche tornare indietro. Le cappe biologiche non sono

compatibili coi solventi chimici mentre le cappe chimiche non possono garantire le condizioni di sterilità che

si garantiscono sotto la cappa biologica.

Tesine: obbligatorie!

C’è differenza fra risultati e discussione: i risultati sono una parte concisa la discussione spiega le

motivazioni e le implicazioni dei risultati.

NUMERARE FIGURE E TABELLE e mettere le didascalie

Le tesine valgono 9 punti dell’esame

Una tesina va presentata e vale 3 punti, l’esame è orale. Per accedere all’esame si devono fare almeno 5

su 9 laboratori. 08.10.2019

Esercitazione 1

La concentrazione è la quantità di soluto in un dato volume di solvente ed è costante su tutto il volume

della soluzione. Concentrazione volume/volume: ml

Ø

di liquido presenti in 100ml di volume

totale

Concentrazione peso/volume: g di

Ø

soluto per 100 ml di solvente

Molarità o concentrazione molare:

Ø

moli di soluto in 1l di solvente

Diluizioni

C1=concentrazione nota C2=concentrazione finale

V1=volume iniziale V2=volume finale 1

Ci sono due tipi di colture cellulari: le cellule aderenti e le cellule che crescono in sospensione, inoltre ci

sono altri tipi di cellule che crescono come aggregati di cellule detti sferoidi. Quando si utilizza una certa

coltura cellulare si deve sapere come crescono le cellule. i conti che si fanno per le diluizioni non dovrebbero

valere per le sospensioni ma per le cellule è comunemente accettato utilizzare le tecniche utilizzate per le

diluizioni MA si tratta sempre e comunque di una sospensione di cellule, non è una diluizione omogenea, LE

CELLULE SEDIMENTANO ALTERANDO LA CONCENTRAZIONE!!

Diluire una sospensione di cellule può servire per molti motivi:

Voglio fare una diluizione di farmaco e valutare gli effetti sulle cellule, devo assicurarmi che la stessa

concentrazione di farmaco venga data allo stesso numero di cellule. sulle piastre di coltura devo mettere lo

stesso numero di cellule. Una piastra ha molti pozzetti, la prima cosa da fare è portare le cellule in

sospensione e devo assicurarmi che la sospensione sia omogenea: devo spipettare la soluzione tante volte

in modo da garantire che le cellule siano circa dello stesso numero in ogni soluzione. Se le cellule sono del

tipo che cresce in sospensione allora siamo ragionevolmente sicuri che le cellule siano sospese allo stesso

modo. Se le cellule sono aderenti devono prima essere staccate, contate e poi diluite. Per staccare le cellule

dalla piastra si utilizza la tripsina, dopo qualche minuto le cellule si staccano e si deve inattivare la tripsina e

questo si fa aggiungendo altro mezzo di coltura che rende l’enzima inattivo dopo di che le cellule vengono

pellettate e vengono diluite in altro mezzo di coltura. lo sferoide normalmente cresce in sospensione, si

preleva e lo si diluisce in un volume noto di mezzo di coltura.

Ottengo così le cellule in un volume noto e a questo punto le posso contare, finché non so quante cellule

ho non so la concentrazione. Per contare le cellule si utilizza l’emocitometro che mi da il numero di cellule

per ml di soluzione. L’emocitometro è uno strumento in vetro che contiene due camere, prelevo un volume

piccolo di soluzione e lo diluisco con un'altra sostanza che marca le cellule morte di blu e le cellule vive si

riescono a vedere abbastanza bene. Conto il numero di cellule vive per quadrante, se ne fa la media e la si

moltiplica per il fattore di diluizione e per un coefficiente dato dal produttore dello strumento 2

15.10.19

Chiono

Idrogeli e applicazioni

Un idrogelo è un network polimerico 3D con caratteristiche idrofiliche, materiale che assorbe molta

acqua ma pur avendo questa affinità è un materiale che non si scoglie in acqua. Se abbiamo un gel in forma

di cilindro secco se lo mettiamo in acqua inizia a richiamarla e a gonfiarsi. Questo processo continua fino ad

arrivare a un valore di equilibrio del rigonfiamento oltre al quale non viene più assorbita acqua. Quanta acqua

può essere assorbita dipende dal tipo di idrogelo ma si va da un 20% fino a un contenuto di acqua del 99%

quindi sostanzialmente questi tipi di gel vengono chiamati idrogeli super-assorbenti. Questi idrogeli possono

essere molto utili in situazioni in cui c’è bisogno di assorbire molti fluidi (pannolini). Se gli idrogeli assorbono

molta acqua ma sono stabili vuol dire che le catene sono idrofiliche ma sono legate fra di loro, un materiale

idrofilico qualsiasi in acqua si scoglie, in questo caso questo non succede perché le catene sono legate fra di

loro, possono esserci dei legami covalenti (cross-link) nel caso di idrogeli reticolati chimicamente ma

all’interno di un gel ci sono altri tipi di interazioni che possono essere delle interazioni fisiche. L’ultima

giunzione che può esserci è un’altra giunzione di tipo fisico però in questo caso si tratta di una sorta di

attorcigliamento fra le catene questa è una giunzione che da stabilità alla struttura.

Possiamo avere due tipi di idrogeli:

• Idrogeli chimici in cui sono presenti anche legami chimici

• Idrogeli fisici in cui sono presenti solo interazioni fisiche

Gli idrogeli hanno diverse proprietà:

Il contenuto di acqua, si distingue fra acqua legata e acqua free. Il contenuto di acqua si può calcolare

o semplicemente andando a prendere un materiale che inizialmente è secco dopo di che viene

immerso in soluzione. La prima acqua che entra nella struttura è la cosiddetta acqua legata che forma

dei legami a idrogeno, la struttura inizia a rigonfiare e quindi ad aprirsi. In questo modo l’acqua

interagisce anche con le porzioni meno idrofiliche poi entra dell’altra acqua per una sorta di effetto

osmotico, l’acqua è spinta a entrare nella struttura e questa è l’acqua libera. A un certo punto

andiamo a pesare il campione all’istante t e andiamo a calcolare il contenuto di acqua facendo la

differenza fra il peso all’istante t e il peso del gel secco. Le misure vanno ripetute almeno per 3 volte.

Ci possiamo aspettare delle curve di questo tipo (vd slide 8). L’andamento è crescente fino a quando

non si raggiunge una sorta di equilibrio quando l’idrogelo è saturo. A seconda di dove vogliamo

andare a usare l’idrogelo si possono usare delle soluzioni diverse per valutare quanta acqua l’idrogelo

assorbirà effettivamente. Se l’idrogelo si rigonfia la sua porosità intrinseca diventa più grande e si

riduce la rigidezza meccanica, ci sono delle caratteristiche del gel che possono essere influenzate

dall’assorbimento di acqua.

Di solito oltre ai test di assorbimento di acqua si fanno dei test di perdita di peso, il materiale secco

viene messo in acqua dove si lascia per un certo tempo, lo si preleva e lo si fa seccare di nuovo. Si va

a confrontare il peso iniziale secco e il peso finale secco per valutare se si è verificata una perdita di

materiale, si ottengono delle curve crescenti in quanto gli idrogeli devono essere comunque

degradabili in ambiente biologico.

È anche possibile distinguere l’acqua libera da quella legata e lo si può fare con due tecniche:

Analisi DSC: ci permetti di andare a rilevare le caratteristiche termiche dei materiali. Dato un

§ porta-campione con due alloggiamenti: uno per il campione e uno per il riferimento che va

tenuto vuoto. Impongo un certo programma termico, ad esempio un riscaldamento, la

macchina mette in atto il programma termico sia sul campione che per il riferimento e

registra un flusso di calore dal polimero al riferimento. La quantità di calore che viene data

al campione è maggiore in quanto è presente un polimero che ha una sua capacità termica

rispetto al riferimento che è vuoto. In sostanza questa differenza inizialmente viene

registrata come una linea quasi piana. Quando il polimero entra nel range di temperatura di

fusione allora la differenza fra il flusso di calore al polimero e quella fornita al riferimento

aumenta, la macchina registra un picco detto picco di fusione. Lo stesso si verifica nel caso

di raffreddamento (picco di cristallizzazione). Nei polimeri abbiamo anche le transizioni

vetrose che non sono associate a un calore latente ma la macchina le vede come una

differenza di capacità termica, viene rappresentata da un punto di flesso in corrispondenza

3

della Tg che quindi può essere ricavata sia dal raffreddamento che dal riscaldamento nello

stesso range.

Dato un campione di gel, una volta reggiunto l’equilibrio l’idrogelo viene congelato dopo di

che viene fatto il test di riscaldamento. A 0°C abbiamo il picco di fusione in quanto il ghiaccio

si scioglie, l’area del picco è proporzionale all’entalpia di fusione, nel caso del gel abbiamo

l’entalpia di fusione dell’acqua e del gel mentre l’entalpia di fusione del ghiaccio è nota e

quindi in base al calore latente di fusione dell’acqua e il valore ricavato dal test possiamo

andare a calcolare la quantità di acqua presente all’interno del gel, questa è l’acqua libera

perché solo l’acqua che non è chimicamente legata al polimero ha la capacità di diventare

ghiaccio.

L’acqua legata è legata al polimero quindi non può partecipare a altri eventi come la

cristallizzazione e non può solubilizzare altre molecole.

L’idrogelo secco viene messo in una soluzione che contiene una molecola fluorescente,

§ l’idrogelo rigonfia fino alla situazione di equilibrio. A questo punto vado a prendere la

soluzione rimasta fuori e vado a fare delle misure di assorbanza che mi permettono di capire

quale concentrazione di sostanza abbiamo fuori dall’idrogelo all’istante temporale generico.

Quindi possiamo calcolare il numero di moli della sostanza all’esterno. Inizialmente in

soluzione avevamo messo un certo numero di moli quindi possiamo calcolare il numero di

moli entrate all’interno dell’idrogelo, essendo all’equilibrio la concentrazione di soluzione

dentro e fuori dal gel è la stessa. Conoscendo il numero di moli e la concentrazione all’interno

dell’idrogelo posso calcolare il volume di acqua libera presente internamente al gel perché

solo l’acqua libero può solubilizzare sostanze

La struttura è intrinsecamente porosa, quando parlo di mesh si fa riferimento alla dimensione dei

o pori dell’idrogelo.

Questa porosità è molto importante per la diffusione di farmaci contenuti all’interno del gel ma

anche nel caso di gel su cui coltivare le cellule perché per far sopravvivere le cellule i gel devono

essere permeabili. Analizziamo tre casi:

Caso in cui le dimensioni della molecola di farmaco sono molto più piccole della mesh size

§ Caso in cui le dimensioni della mesh sono paragonabili a quelle del farmaco

§ Caso in cui la mesh ha dimensioni minori di quelle del farmaco. In questo caso per far

§ diffondere il farmaco si possono sfruttare diversi meccanismo:

Meccanismo degradativo

ü Meccanismo del rigonfiamento, in risposta ad uno stimolo il gel può rigonfiare di più

ü e quindi rilasciare il farmaco in maniera intelligente

Deformazione della mesh legata a una sollecitazione meccanica

ü

Per calcolare la mesh size si può utilizzare una molecola modello, solitamente viene usata una

molecola di destrano-fluoresceina in quanto sono commerciali e quindi facilmente reperibili e ne

esistono di diversi pesi molecolari. Inoltre essendo marcato possiamo misurarlo facilmente o in

assorbanza o in fluorescenza. La misura è molto semplice: si inserisce nella miscela il destrano-

fluoresceina. Una volta che il destrano è incapsulato nell’idrogelo vado a misurarne il rilascio. A

diversi istanti temporali prelevo la soluzione in cui il destrano viene rilasciato e vado a misurare

l’assorbanza. Preventivamente è stata preparata una curva di calibrazione: prendo delle soluzioni di

destrano fluoresceina con concentrazioni via via crescenti e ne misuro l’assorbanza, in questo modo

costruisco la retta di calibrazione che è la base per fare le quantificazioni. A questo punto all’istante

t prendo la mia soluzione, misuro l’assorbanza e ricavo la concentrazione. Utilizzando diversi tipi di

destrano fluoresceina posso avere diverse indicazioni sulla porosità del gel. Più il gel è concentrato

più è denso e quindi è più difficile diffondere per la molecola incapsulata. Per quanto riguarda la

permeabilità dei farmaci, soprattutto farmaci proteici, noi ne sappiamo il peso molecolare e

scegliamo il destrano fluoresceina più simile.

Possiamo distinguere vari tipi di gel in base a diverse caratteristiche, una distinzione possibile è:

Gel chimico: sicuramente è un idrogelo permanente di cui non possiamo più modificare la struttura.

§ I gel di tipo chimico possono essere ottenuti: 4

Con un processo di polimerizzazione da monomeri

o Dato un insieme di macromeri in cui sono presenti delle insaturazioni, per avere un grado di

o reticolazione più denso o per favorire il processo posso mettere un cross-linker che può avere

un doppio legame o più di uno. Questo è il caso di reazioni radicaliche. Il macromero idrofilico

con due doppi legami alle estremità attraverso un processo di fotoreticolazione possiamo

ottenere un gel degradabile enzimaticamente

Reticolazione chimica utilizzando degli altri reagenti che possono essere o dei monomeri

o bifunzionali o dei polimeri bifunzionali. Per ottenere il gel ci serve un reticolante che deve

avere almeno tre funzionalità. nel secondo caso un polimero polifunzionale con tutta una

serie di gruppi reattivi deve essere reticolato per ottenere un gel e si possono avere diverse

tipologie di reticolanti. Questo caso è molto comune, è presente nella reticolazione chimica

di polimeri naturali per creare un gel perché i polimeri naturali sono ricchi di gruppi funzionali

che possono essere sfruttati per legare insieme le catene creando un gel. Questo è un modo

per reticolare che introduce il reticolante all’interno della struttura. Il metodo enzimatico

utilizza appunto degli enzimi (transglutaminasi) per legare le catene, fanno avvenire una

reazione che spontaneamente non potrebbe avvenire, le due catene reagiscono fra loro

formando il network ma non è presente l’enzima all’interno della struttura.

Gli idrogeli chimici sono più stabili ma hanno molti inconvenienti in alcune applicazioni:

Se voglio far avvenire la reticolazione chimica direttamente in vivo si possono danneggiare

o le cellule a causa delle condizioni di formazione che hanno i gel chimici. Per questo

potrebbero soffrire le cellule incapsulate nel gel o le cellule dei tessuti circostanti quindi nel

caso di gel iniettabili sono preferibili i gel fisici

Gel fisico: è un gel non permanente che può diventare una soluzione in determinate condizioni. Tre

§ meccanismi principali:

Reticolazione ionica, essenzialmente sono fatti da polimeri che hanno delle cariche e per farli

o reticolare si utilizzano degli ioni multivalenti con carica opposta. L’alginato è un polimero

ricco di gruppi –COOH che sono protonati in condizioni fisiologiche. Aggiungendo cloruro di

-

calcio questi fanno reticolare le catene in quanto gli ioni calcio si legano ai gruppi –COO .

questo è uno dei metodi più semplici che ci sono per fare dei gel

Gel sensibili al pH, in condizioni particolari si mantengono gel e in altre condizioni sono

o soluzioni. Questi tipi di gel in genere hanno nella lo struttura dei blocchi più idrofobici che ne

garantiscono la stabilità in acqua. Negli idrogeli sensibili al pH abbiamo dei gruppi acidi deboli

(-COOH) oppure dei gruppi basici deboli (-NH ). Nel caso degli acidi deboli considerando una

2

scala di pH avremo che questi gruppi sono stabili a pH basso ma alzando il pH tendono a

-

formarsi dei gruppi –COO . Quando il pH supera un certo valore troviamo gruppi

prevalentemente in forma ionizzata. Con i gruppi basici deboli succede una cosa simile, al di

3+

sotto di un certo pH prevalgono gli NH e al di sotto prevalgono gli NH questo valore di pH

2

3+

corrisponde al pKa degli NH . a seconda del pH può cambiare molto il carattere del gel

perché nel caso di gruppi aminici sotto il pKa abbiamo principalmente gruppi ionizzati, la

struttura si apre e non avendo legami chimici il gel tende a scogliersi, succede l’opposto per

gruppi acidi deboli, con una prevalenza di gruppi ionizzati aumenta l’idrofilicità, c’è una

repulsione elettrostatica fra le molecole e dunque la struttura viene solubilizzata.

Questi gel sensibili al pH sono molto utili per il rilascio di farmaco, per esempio per rilasciare

farmaco in una particolare regione dell’apparato digerente. Noi vogliamo che il nostro gel

vada a rilasciare il farmaco in corrispondenza della parete dello stomaco possiamo utilizzare

un gel con basi deboli. A livello orale abbiamo il discorso opposto quindi usiamo un gel che

presenta dei gruppi acidi deboli. Un’altra applicazione è nell’ambito della terapia genica,

rilascio di DNA o RNA. È molto difficile entrare all’interno della cellula e inoltre si tratta di

molecole molto delicate, sono materiali che degradano molto facilmente e quindi è

importante incapsularli. Hanno una carica negativa quindi possiamo sfruttare sistemi che in

certe condizioni di pH hanno una carica positiva e una di queste molecole è il chitosano. Si

formano dei nanogel, mettiamo il nanogel a contatto con la cellula che va a internalizzare il

sistema, si verifica un’internalizzazione in vescicole