Farmacologia - I semestre

Farmacologia

Il farmaco deve andare dove si trova il suo sito di azione per il raggiungimento del bersaglio terapeutico. I farmaci agiscono perché interagiscono secondo le leggi fisico-chimiche con dei bersagli terapeutici (recettori, canali ionici, enzimi, trasportatori). Un farmaco non crea nessuna nuova funzione, ma interferisce con meccanismi pre-esistenti, modificandoli, inibendoli o attivandoli, modulando una determinata condizione (presumibilmente patologica). Allo stesso modo funzionano le sostanze tossiche. Più ligando si ha, maggiore è la risposta che si ottiene. La quantità del farmaco è in relazione con la risposta, la quale è direttamente proporzionale alla quantità di farmaco. Vi è uno stretto rapporto tra la concentrazione del ligando e il recettore, come stabilisce la legge di azione della massa. Aderenza terapeutica: i farmaci devono essere assunti.

Bersagli terapeutici

Disease modifying drugs

Quanti sono i bersagli terapeutici codificati dal genoma dell’ospite? (sono quindi esclusi i bersagli terapeutici di origine batterica, micotica, virale) Sono circa 500. Circa il 50% sono recettori integrali di membrana, spesso le patologie sono legate a problemi di comunicazione intercellulare. 2% sono recettori nucleari come corticosteroidi e pillole anti-concezionali. Circa il 30% sono enzimi come Aspirina, statine, ACE inibitori (bloccano l’enzima di conversione dell’angiotensina). 5% sono canali ionici, come anestetici locali come la lidocaina (blocco canali del sodio voltaggio-dipendenti, nervi non scaricano) e blocco dei canali del calcio nel caso dell’ipertensione. 2% sono DNA, come farmaci anti-tumorali che generano addotti sul DNA. Alcuni farmaci, come gli analoghi purinici e pirimidinici, sono chemioterapici convenzionali. 10% sono ormoni e fattori e il 7% sono sconosciuti; sono farmaci per i quali il bersaglio molecolare non è noto, solo alcuni bersagli sono noti in certi farmaci. Mancano nello schema i trasportatori implicati nei farmaci anti-depressivi come il Prozac, inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina. Il paziente ha un difetto nella trasmissione serotoninergica, attraverso il farmaco si cerca di ripristinare il meccanismo corretto: mediante l'azione del farmaco il neurotrasmettitore non viene continuamente ricaptato, aumentando la concentrazione della serotonina e la stimolazione dei recettori specifici.

Esistono farmaci che non hanno un bersaglio molecolare preciso:

• Anti-acidi: modificano l’ambiente chimico-fisico sul quale agiscono, sono dei sali che alcalinizzano lo stomaco.
• Diuretici osmotici.
• Disinfettanti di superficie.
• Certi lassativi.

I farmaci possono legare delle proteine plasmatiche come l’albumina; non è un recettore, non trasduce il segnale.

Recettori

Una volta che il recettore lega il farmaco, trasduce il segnale provocando cambiamenti biochimici a livello della cellula. Le molecole glicoproteiche in grado di trasdurre il segnale provocano cambiamenti a livello cellulare. Vengono distinti in recettori di membrana o intracellulari, i quali possono trovarsi nel citoplasma o nel nucleo.

Recettori di membrana

Esistono 3 classi. Sono proteine integrali di membrana, attraversano la membrana secondo una topologia caratteristica e legano dei ligandi idrofilici.

Recettori canale

Ligand-gated ion channels agiscono in millisecondi. Sono dei canali ionici attivati e aperti dall’interazione con il ligando/farmaco, non sono da confondere con i canali ionici voltaggio-dipendenti, il diverso trigger innesca il segnale. La risposta può essere iperpolarizzazione o depolarizzazione. Si trovano a livello della giunzione neuromuscolare: rilascio di acetilcolina dal motoneurone α che si va a legare ai recettori nicotinici (colinergici). Quando aumenta la concentrazione di calcio in una cellula, si ha la contrazione. A livello del SNC si trovano dei recettori per il glutammato, molto importanti per la comunicazione rapida. La modulazione avviene anche in senso inibitorio ed è mediata dal GABA, che fa entrare anione cloro provocando iperpolarizzazione. Hanno una struttura multimerica: ciascuna subunità attraversa la membrana quattro o cinque volte.

Accoppiati a proteine G

Esistono 1200 geni che codificano per queste proteine. I recettori gustativi e olfattivi sono di questo tipo, per questo ve ne sono di tanti tipi. Sono dei recettori che agiscono nell’ordine di secondi, non sono velocissimi. Il recettore comunica con un effettore mediante una proteina G eterotrimerica che lega i nucleotidi guaninici. Gli effettori possono essere enzimatici o canali ionici che mediano l’effetto. Attraversano sette volte la membrana plasmatica.

Recettori con attività tirosin-chinasica intrinseca

Agiscono nell’ordine di minuti. Possono essere, ad esempio, recettori per fattori di crescita su cui agiscono diversi anticorpi monoclonali e sono molto importanti nei tumori e per la loro terapia. Regolano proliferazione, apoptosi, infiammazione. Attraversano solo una volta la membrana plasmatica e inducono modificazioni biochimiche o biofisiche che hanno un significato per la cellula.

Recettori intracellulari

Sono dei fattori di trascrizione attivati dal ligando, sono dei modulatori dell’espressione genica e agiscono in diverse ore. I ligandi fisiologici sono sostanze liposolubili in grado di attraversare la membrana plasmatica, sono delle molecole idrofobiche che nel torrente circolatorio si trovano legate a proteine trasportatrici. Farmaci corticosteroidi anti-infiammatori agiscono a livello del sistema NF-kB. Hanno un aspetto globulare.

L’acetilcolina ha diversi recettori che possono essere muscarinici (a 7 domini transmembrana) oppure nicotinici (canale). GABA ha recettori GABA-A ionotropici e recettori GABA-B metabotropici. La serotonina ha diversi sette recettori, tra i quali 5-HT recettore canale³. Il glutammato ha sia recettori ionotropici che metabotropici. Ci sono dei sistemi in cui ci sono più recettori e più ligandi, nel sistema oppioide e cannabioide ci sono 4 ligandi diversi.

Recettori canale

Si trovano a livello della placca neuromuscolare. Il recettore acetilcolinico nicotinico è un pentamero composto da due subunità α, una subunità β, una subunità γ e una δ, che delimitano un canale che di solito è chiuso. Il legame dell’acetilcolina innesca una modificazione conformazionale che porta all’apertura del canale e permette il passaggio di ioni che portano alla polarizzazione della cellula. Una proteina può avere delle diverse conformazioni allosteria; esistono dei farmaci allosterici che fanno cambiare la conformazione del recettore senza modificare il sito di legame, sono delle modificazioni altamente reversibili. I canali sono specifici solo per alcuni tipi di ioni, permettono il passaggio di alcuni ioni e di altri no. Il recettore dell’acetilcolina è stato il primo a essere isolato e clonato. La subunità γ è presente durante la vita fetale, viene poi sostituita dalla subunità ε durante la vita adulta. Questi recettori sono presenti in pesci cartilaginei, le torpedini hanno l’organo elettrico pieno di questi recettori che vengono utilizzati per difesa e protezione, non per il movimento. La liberazione di acetilcolina per difendersi provoca una scarica elettrica. La miastenia grave è provocata dallo sviluppo di anticorpi contro il recettore colinergico: fu scoperto in conigli utilizzati per produrre questo tipo di anticorpi durante esperimenti. La morte per morso di serpente causa paralisi flaccida e morte per blocco respiratorio; l’alfa-bungarotossina lega in modo irreversibile i recettori nicotinici per l’acetilcolina impedendo la trasmissione dell’impulso. Non ci sono recettori colinergici nel cuore, queste tossine non hanno quindi effetti sul cuore. Il curaro, utilizzato come veleno nel quale venivano intinte le frecce per cacciare, deriva da una pianta e ha una struttura simile all’acetilcolina; è una molecola antagonista per il legame al recettore nicotinico. Oggi viene utilizzato come miorilassante nel campo dell’anestesia, succinilcolina, causa blocco dei muscoli e paralisi flaccida. I canali hanno un’emivita, restano aperti e dopo un po’ si chiudono spontaneamente. I recettori possono essere permeabili agli anioni o ai cationi. Permeabili ai cationi: recettore nicotinico muscolare e neuronale (acetilcolina), recettori glutammatergici ionotropi (amminoacidi eccitatori), AMPAR fa passare elevate quantità di calcio, recettore serotoninergico 5-HT³ sul quale hanno azione gli anti-depressivi di ultima generazione usati anche come anti-nausea nei pazienti sotto chemioterapia, recettore purinergico (ATP), recettori aperti dai nucleotidi ciclici (cAMP e cGMP). Permeabili agli anioni: recettore GABA, iperpolarizzano la cellula, recettore glicinergico.

Il dominio M2 delimita il canale. I processi biologici sono autolimitanti, come si attivano devono anche spegnersi, altrimenti possono sorgere delle patologie. La rimozione del neurotrasmettitore dalla sinapsi avviene mediante dei trasportatori che lo ricaptano. L’acetilcolina viene degradata dalle acetilcolina-esterasi che si trovano al livello delle giunzioni dove avviene il rilascio. Se la quantità del neurotrasmettitore aumenta, il recettore compensa andando incontro a uno stato inattivato e de-sensitivizzato, il canale così resta chiuso anche se il ligando è legato. Alcuni veleni agiscono sulle acetilcolina-esterasi bloccandole, all’inizio si ha paralisi spastica, ma successivamente si sviluppa la paralisi flaccida. La de-sensitizzazione dei recettori è un problema delle terapie, può avvenire un aumento dei recettori se la quantità dei ligandi è bassa e a valle aumenta la risposta. I meccanismi farmacologici possono generare degli effetti di rebound.

Recettore per il GABA

Il recettore del GABA, se attivato, permette l’entrata di cloro e quindi iperpolarizzazione. Esistono dei farmaci che potenziano i recettori del GABA in grado di inibire il sistema nervoso centrale in patologie come l’insonnia (ipnogeni), epilessia (benzodiazepine), ansiolitici. Il GABA e le benzodiazepine si legano in punti diversi del recettore; le benzodiazepine si legano invece al loro sito allosterico modulatore allosterico. [Invece la nicotina si lega allo stesso sito dell’acetilcolina, sito ortosterico, ed è un antagonista.] I barbiturici invece si legano al canale e lo tengono aperto, provocando una continua iperpolarizzazione della cellula; non hanno bisogno del legame del GABA per aprire il canale.

Esperimento di patch-clamp

Studio elettrofisiologico: viene transfettato un recettore con delle cellule epiteliali e viene isolata la porzione di membrana, bloccando correnti o voltaggio e misurando la corrente che passa lì dentro. Stimolazione: se si dà GABA + benzodiazepine, la frequenza di apertura del canale diventa più rapida e a parità di GABA entra più cloro. La benzodiazepina da sola non funziona, è un modulatore allosterico e per questo serve il GABA che si lega al recettore. Il GABA è presente in quantità controllata, l’azione delle benzodiazepine a un certo punto raggiunge un plateau; la loro azione è legata al GABA. Barbiturici non raggiungono plateau.

Recettori associati alle proteine G

Sono più lenti, ma estremamente diffusi, codificati da circa 1200 geni. Le proteine G sono una famiglia di molecole proteiche così chiamate per la loro interazione con i nucleotidi guaninici GTP e GDP. I recettori hanno una struttura a 7 domini transmembrana; amminoacidi idrofobici attraversano la membrana 7 volte. La sequenza amminoacidica è diversa da recettore a recettore, ma la struttura è la stessa. Si trovano in forma monomerica, ma in realtà formano dei dimeri, i recettori accoppiati a proteine G si accoppiano anche a recettori di tipo diverso.

Sono dotati di:

• Porzione extracellulare specifica per il ligando.
• Porzione transcellulare a 7 domini transmembrana.
• Porzione intracellulare fondamentale per l’accoppiamento con la proteina G.

I diversi tipi di ligando che possono legarsi al recettore si legano in punti diversi del recettore:

• I neurotrasmettitori classici si legano a livello di una tasca idrofilica del recettore.
• I peptidi si legano sulle porzioni di passaggio tra un dominio transmembrana e un altro.
• Il glutammato si lega a una porzione extracellulare molto lunga.
• I fotoni si legano alla rodopsina.

Che cosa succede quando un recettore accoppiato a proteina G viene stimolato dal suo ligando? Le proteine G eterotrimeriche legano nucleotidi guaninici e sono formate da subunità α, β, γ. A livello della membrana, le proteine G non sono in contatto con il recettore; non vi è un legame tra la proteina G e il recettore. Quando il recettore lega il ligando, avviene un cambiamento conformazionale. Il recettore entra in contatto con la subunità α che lega il GDP. Quando viene contattata dal recettore, la subunità α subisce una modificazione conformazionale che le fa perdere l’affinità per il GDP che si stacca, e acquista affinità per il GTP. Legando il GTP, perde affinità per le subunità β e γ. La subunità α libera dei legami che agiscono fisicamente con gli effettori come enzimi (fosfolipasi A2, fosfolipasi C, adenilato ciclasi, fosfodiesterasi) e canali ionici.

Sistema di controllo: attività GTPasica endogena. Quando la subunità α ha il GDP attaccato, si riassocia alle subunità β e γ e avviene lo spegnimento del segnale. In alcuni tipi di tumori (endocrini) vi sono delle mutazioni della subunità α che perde l’attività GTPasica. La tossina colerica provoca l’ADP ribosilazione della subunità α S, iper-attivazione dell’adenilato ciclasi che provoca un aumento della perdita dei liquidi.

Sistemi che sfruttano recettori accoppiati a proteine G:

• Catecolammine hanno solo recettori accoppiati a proteine G.
• Tutti gli eicosanoidi.
• Ormoni peptidici come ACTH, FSH, TSH, GHRH, somatostatina, vasopressina, calcitonina.
• Trombina.
• Rodopsina.

Esistono diversi tipi di subunità α:

• α_S stimolatoria dell’adenilato ciclasi.
• α_I inibitoria dell’adenilato ciclasi.
• α_Q attiva fosfolipasi C.
• α_O accoppiata ai recettori oppioidi, inibisce i canali del calcio e attiva quelli del potassio.

Hanno sequenze specifiche per l’interazione con gli effettori. Canali del calcio pre-sinaptici di tipo N voltaggio-dipendenti hanno un ruolo nel rilascio di neurotrasmettitore a livello della sinapsi neurologica. Il recettore oppioide μ è capace attraverso una proteina G di chiudere i canali del calcio, non avviene la comunicazione tra i due neuroni; meccanismo analgesico a livello delle corna posteriori del midollo spinale. Non avviene il rilascio di glutammato, non avviene la percezione del dolore (morfina è un oppioide che blocca la trasmissione a livello della via spino-talamica).

Esistono diverse isoforme dell’adenilato ciclasi: quando arriva l’ormone/farmaco/neurotrasmettitore avviene una modificazione conformazionale che provoca la liberazione di α; modificazione allosterica dell’adenilato ciclasi. Una volta attivato, va a trasformare l’ATP in AMP ciclico; attivazione della chinasi PKA. La PKA è un tetramero formato da due subunità catalitiche e due regolatorie; l’AMP ciclico si lega alle subunità regolatorie provocando una modificazione conformazionale, avviene il distacco delle subunità catalitiche che vanno a fosforilare i substrati. La concentrazione dell’AMP ciclico dipende dall’attivazione e dall’inibizione dell’adenilato ciclasi. α_I provoca una modificazione conformazionale che rende l’adenilato ciclasi incapace di trasformare l’ATP in AMP ciclico. Le fosfodiesterasi tagliano il legame ciclico dell’AMP ciclico che diventa quindi AMP, possono essere inibite farmacologicamente.

Via dell’inositolo difosfato

La subunità α_Q attiva la fosfolipasi C, è in grado di idrolizzare il fosfatidilinositolo bisfosfato PIP₂ in inositolo trisfosfato IP₃ e diacilglicerolo DAG. Il DAG è altamente lipofilico e rimane nella membrana plasmatica; a livello della membrana concorre alla fosforilazione di recettori e canali ionici (protein chinasi C) e partecipa a fenomeni di de-sensitivizzazione. L'IP₃ viaggia nel citoplasma e incontra il suo recettore che si trova in una posizione strategica nella membrana del reticolo endoplasmatico. Il reticolo endoplasmatico è ricco di calcio e di calcio ATPasi, calreticulina e calsequestrina; il calcio precipiterebbe se non vi fossero delle proteine chelanti del calcio a bassa affinità. L'IP₃ provoca l’apertura dei canali del reticolo endoplasmatico e il calcio esce.

• Se avviene a livello di una cellula muscolare, si ha contrazione.
• Se avviene a livello di una cellula nervosa, si ha rilascio del neurotrasmettitore.

Le subunità β e γ hanno un ruolo a livello del nodo senoatriale del cuore, interagiscono con i recettori muscarinici: il nervo vago libera acetilcolina, i recettori muscarinici aprono i canali del potassio, la cellula diventa meno eccitabile, causando iperpolarizzazione delle cellule del nodo senoatriale.

Recettori per i fattori di crescita

Questa è una sottoclasse di recettori con delle funzioni particolari. Sono essenziali per lo sviluppo, la crescita, la riparazione e il mantenimento dei tessuti durante l’età adulta e hanno anche un ruolo nella risposta immunitaria. In vitro regolano la proliferazione, il differenziamento, la migrazione e la sopravvivenza cellulare. Sono stati identificati negli anni ’80, con il Nobel nel 1986 di Cohen e Levi-Montalcini. Rita Levi-Montalcini, negli anni ’50, ha scoperto una sostanza solubile a livello tumorale che induce lo sviluppo del sistema nervoso. Dimostra che dei tumori di topo, quando vengono trap...