Farmacologia - I semestre

SINTESI DELL’OSSIDO NITRICO

La biosintesi dell’NO nelle cellule endoteliali e in altri distretti dell’organismo avviene principalmente attraverso la trasformazione della

L-arginina in L-citrullina operata da enzimi chiamati NO-sintasi (NOS)

NOS catalizza la reazione L-arginina + O + NADPH NO + citrullina

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L’NO può essere generato anche per via non enzimatica per disproporzionazione dei nitriti o la loro riduzione a pH acido in

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condizioni ischemiche

Ci sono degli analoghi farmacologici dell’arginina (L-NMMA) che bloccano l’azione dell’enzima: si legano allo stesso modo ma non

liberano in NO la porzione amminica dell’arginina sono antagonisti

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E’ possibile anche misurare quanta arginina è convertita in citrullina per analizzare quanto funziona la reazione

L’NO ha un’azione anti-aggregante sulle piastrine e ha un’azione anche a livello delle cellule vicine: muscolari, leucociti, piastrine

L’arginina è ricca in residui amminici prodotta nel ciclo dell’urea

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Azione della NOS sintasi con i cofattori O + NADPH (donatore di elettroni) forma un intermedio di idrossilazione reazione con H O

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da catalisi intrinseca, dalla quale derivano l’ossido nitrico e la citrullina

Ogni citrullina prodotta, deriva anche una molecola di NO

NO Sintasi

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La NO sintasi è un complesso enzimatico con:

1. Monossigenasi tetraidropteridina-dipendente

2. Diidropterina reduttasi NADPH-dipendente

3. NADPH ossidasi

Utilizza vari co-fattori NADPH, FAD, FMN, tetraidrobiopteridina (H B) e Ca-calmodulina

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Ha sito catalitico che contiene:

- un dominio reduttasico

- un dominio ossigenasico (contenente eme)

Gli elettroni sono donati dall’NADPH al dominio reduttasico (riduzione) e attraverso il

passaggio intermedio sui co-fattori FAD e FMN giungono al dominio ossigenasico

Gli elettroni interagiscono con ferro-eme e H B, catalizzando l’ossidazione della

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L-arginina da parte dell’O generando quindi NO e L-citrullina

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Nel dominio ossigenasico l’arginina reagisce con l’ossigeno ossidazione, si stacca un residuo amminico dall’arginina che va a legarsi

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con l’arginina formando NO

La NO-sintasi è un omodimero, solo nella forma dimerica può l’enzima può essere attivo

Ha un sito legante il calcio calmodulina-dipendente che viene attivato dal legame del Ca 2+

Esistono tre isoforme di NO-sintasi

Sono classificabili in base alla loro attività basale e alla distribuzione a livello tissutale

1. NOS I NO-sintasi costitutiva calcio-dipendente neuronale

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2. NOS II ⇾ NO-sintasi inducibile calcio-indipendente

3. NOS III ⇾ NO-sintasi calcio-dipendente endoteliale (ubiquitaria)

La NOS III presenta un sito di miristilazione (Myr) e uno di palmitolazione

(Palm) che ne consentono l’ancoraggio alle membrane intracellulari

La NOS I in posizione N-terminale presenta delle sequenze consensus,

denominate PDZ, che facilitano l’interazione dell’enzima con altre proteine

di membrana importante per la compartimentalizzazione

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Tutte le isoforme hanno omologia con il citocromo P450 al sito reduttasico

al C-terminale che contiene il sito di legame per NADPH, FAD e FMN

1. NOS I

NO-sintasi costitutiva calcio-dipendente neuronale

E’ presente nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico, negli astrociti, nelle cellule neuro-secernenti, nel muscolo scheletrico,

nelle isole pancreatiche, nell’epitelio gastrico e polmonare e nelle cellule della macula densa

Viene attiva da aumenti di calcio intracellulari attivazione Ca-calmodulina dipendente

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Ha un peso molecolare maggiore perché nella porzione N-terminale presenta il dominio PDZ importante per la sua

compartimentalizzazione

A livello neuronale può interagire in modo stabile con la proteina PSD-95 presente a livello post-sinaptico sensore influsso di Ca

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A livello del muscolo interagisce invece con la distrofina consente di sentire la contrazione muscolare e di aumentare il flusso

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ematico

Essendo costitutiva, ha un’espressione basale che può essere modulata

Nel promotore ha siti per NF-kB, CREB, NF-1

Presenta siti che possono essere fosforilati da PKA, PKC (inibisce) e PKCa-calmodulina di tipo II

2. NOS II

Inducibile, calcio-indipendente

Tipicamente presente nelle cellule del lineage macrofagico

La sua espressione può essere indotta in tutte le cellule attivabili da citochine e prodotti di derivazione batterica (LPS), tra cui

l’endotelio, muscolo liscio e cardiaco, cheratinociti, epatociti e mastociti

Quando il macrofago interagisce con gli LPS attraverso il TLR, attiva l’induzione dell’I-NOS con produzione di elevate quantità di NO

La sua espressione viene indotta a livello trascrizionale da stimoli specifici costituti da citochine quali interferone γ, TNF-α, IL-1β e altre

citochine che agiscono in presenza di prodotti di degradazione batterica

IFNγ indotta dal riconoscimento degli LPS agisce per aumentare i trasportatori dell’arginina e per aumentare l’attività dell’arginato-

succinasi che forma arginina da citrullina

Il gene che codifica per la iNOS ha un promotore complesso con due regioni di regolazione a monte della TATA-box

- sito stimolato dall’LPS

- modula x10 l’attività della regione 1, regione stimolata dall’IFN-γ

LPS stimolano direttamente, mentre IFN-γ regola l’induzione da LPS ⇾ controllo della liberazione di NO a livello del sito di

infiammazione

NOS II genera NO in modo continuo nel tempo e a concentrazioni che spesso raggiungono il micromolare

3. NOS III

Localizzata soprattutto nell’endotelio, ma anche in linfociti, epatociti e cuore

Attivazione regolata dal Ca , attivazione Ca-calmodulina dipendente (può dipendente da IP3K)

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Presenza di sequenze consenso per la miristilazione e la palmitolazione che favoriscono l’associazione dell’enzima con le membrane

cellulari e in modo dinamico e reversibile permettendo una localizzazione dell’enzima non solo alla membrana plasmatica, ma anche al

complesso di Golgi e ai mitocondri modificazioni post-traduzionali

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A livello dell’endotelio e del cuore, la NOSIII è compartimentalizzata in strutture specifiche della membrana grazie all’interazione con la

caveolina la concentra in domini di membrana e allo stesso tempo la inattiva

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La caveolina lega sia la membrana che la proteina

In questa localizzazione la NOS è inattiva, viene attivata dalle alte concentrazioni di calcio che inducono la dissociazione della NOS dalla

caveolina e quindi la sua attivazione

Regolazione

L’eNOS può essere attivata anche dalla fosforilazione mediata dall’AKT e dall’IP3K

≫ via stimolata da fattori di crescita, citochine e stimoli chemiotattici (EGF, PDGF, insulina, corticosteroidi)

Shear stress agiscono sui vasi, controllo pressori

≫ Aumenta nell’endotelio, muscolo e grasso bruno per carenza metabolica, ipossia, ischemia, esercizio fisico e ipotermia

≫ NO è un signaling per fare mitocondriogenesi tramite produzione di PGC-1α

Aumento della funzione dell’eNOS legato anche a una stimolazione indotta dalla proteina Hsp90 (heat-shock)

≫ NOSIP e NOSTRIN facilitano la traslocazione dell’eNOS dalla membrana plasmatica al Golgi e inibisce l’attività in quanto viene

≫ riciclata o degradata

Il recettore per la bradichinina (stimolo della vasodilatazione) è un regolatore allosterico positivo

≫

Flow-mediated dilatation fenomeno fisiologico per cui all’aumento di flusso di sanguigno si ha una dilatazione a valle stimolata da

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shear stress e altri componenti che inducono la produzione di NO endotelio-dipendente

Modificazioni post-traduzionali di eNOS

- fosforilazione delle tirosine permettono a eNOS di indurre fosforilazione dei residui di serina, che aumentano la funzionalità di eNOS

- acetilazioni, palmitolazioni, miristilazioni (importanti per l’ancoraggio)

Può essere fatto lineage gene tracing utilizzando dei topi reporter

Nel promotore del gene di interesse (eNOS) viene inserita l’espressione della CRE recombinasi, che quindi viene espressa solo in cellule

che esprimono eNOS

Viene incrociato con un altro animale che contiene il gene per la β-galattosidasi

EFFETTI DELL’OSSIDO NITRICO A LIVELLO SISTEMICO E DI ORGANO

Apparato cardiovascolare

• NO induce il rilassamento della muscolatura vasale e contribuisce alla regolazione della pressione arteriosa

Inibitori di NOS inibiscono la vasodilatazione da bradichinina e aumentano la vasocostrizione

Sistema vascolare sotto il controllo di tono vasodilatatorio costante dell’NO squilibrio provoca ipertensione

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• Importante nella regolazione del circolo coronarico

La sintesi di NO avviene secondo il ritmo circadiano, l’inibizione dà angina instabile con vasocostrizione e aggregazione piastrinica

• Importante nella riperfusione post-ischemica

Radicali liberi dell’O formano -OONO provocando lesioni cellulari e riduzione della disponibilità di NO

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• Regolazione della pressione arteriosa sia modulando tono del circolo che le funzioni renali

Regola positivamente la funzione glomerulare, aumenta la GFR per vasodilatazione dell’arteriola afferente

Espressione di NOS a livello della macula densa viene inibita dall’angiotensina II (regolatore positivo pressione di filtrazione)

Effetti sulla macula densa vengono mediati anche dalla modulazione dell’attività delle COX

• Protezione trombotica per inibizione dell’aggregazione piastrinica

Inibisce anche l’adesione dei leucociti all’endotelio

Utilizzati supplementi di L-arginina per ridurre aterosclerosi

Durante lo shock settico avviene una grossa produzione di NO con inibizione della produzione di trombossano vasodilatazione

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completa dell’organismo

La somministrazione di nitrati è un trattamento per le patologie cardiache come l’angina

I farmaci che donano NO vengono chiamati nitroderivati

Sono rapidi e liberano NO indipendentemente dall’attività enzimatica, ma hanno un’azione breve (bisogna fare diverse infusioni affinchè

si sblocchi un vaso)

Sono molto instabili e liberano NO al pH fisiologico

Vengono somministrati per via sub-linguale o intravenosa (non passano dal fegato) in questo modo possono esplicare effetti che sono

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rilevanti soprattutto a livello vascolare, dove le cellule endoteliali sono ricche di enzimi che degradano/attivano i nitroderivati

Gli effetti sono dose-dipendente e sono attribuibili al rilassamento delle vene di capacitanza in primis e rilassamento successivo delle

arteriole capillari

Potenziali effetti benefici:

- riduzione volume ventricolare, pressione arteriosa