Esame di Biochimica (parte 3)

Meccanismi

Equazione di H-M e M integrata

v_o = ^{V_max [S]}/_{Km + [S]} quando uno dei due substrati è mantenuto costante.

Bi Bi Random

• Esempio di chinasi ed alcune deidrogenasi
• Non è previsto un ordine di priorità

E + A ⇄ EA + B ⇄ EAB k_cat E + P + Q

Tappa lenta

Gli equilibri vengono considerati rapidi → li considero all'equilibrio. v₂ = k_cat [EAB]

Si pone al solto [A_t] = [A]_t e [B_t] = [B]_t e il bilancio di massa per l'enzima sarà: [E_t] = [E] + [EA] + [EB] + [EAB]

Dato che abbiamo impostato gli eq. si possono usare le K_eq.

Meccanismi

Si considera l'equazione di H-M&H integrata:

v₀ = ^{V_max [S]}/_{Km + [S]} quando uno dei due substrati è mantenuto costante.

B₁B₂ Random

• Esibito da chinasi ed alcune deidrogenasi
• Non è previsto un ordine di priorità

E + A ⇌ EA ↓ + B ⇌ EB + A ⇌ EAB ⇌ K_cat E + P + Q

Tappa lenta

Gli equilibri vengono considerati rapidi → li considero all’equilibrio. v₂ = K_cat [EAB]

Si pone al sotto [A]_t[A] = e [B]_t[B] e il bilancio di massa per l’enzima sarà: [E]_t = [E] + [EA] + [EB] + [EAB]

Dato che abbiamo imposto gli eq. si possono usare le K_eq.

K_s^A = [E][A] / [EA]

K_s^B = [E][B] / [EB]

K^BA = [EB][A] / [EAB]

K^AB = [EA][B] / [EAB]

K^AB = [E][AB] / [EAB]

v₀ = [A][B]₁ / K_cat[E]_T = Ks K^AB[A] + K^BA[A]₁[B]₁ / ([A][B] + [A][B]₁)

Poi si procede al saggio, tenendo uno dei 2 costanti e facendo variare l'altro.

=> A = cost. v0 / Vmax = [B]1 / KmB appU + [B]1

V_max^{A app} = V_max[A]₁ / K_BA^U + [A]₁

K_m^{B app} = K^AB(K_s^A[A]₁) / K_BA^U[A]₁ / [B]₁

B₁, B₁ ordinato

• Esibito dalle deidrogenasi NAD o NADP dipendenti
• Uno dei 2 S deve entrare per primo

E + A ⇌ EA + B ⇌ EAB ⇌ K_cat E' + P + Q

Si considerano di nuovo le tappe all'equilibrio

v₀ = k_cat[EAB]

[E]_T = [E] + [EA] + [EAB]

K_s^A = |E|[A] / [EA]

K_s^AB = |EA|[B] / [EAB]

Da questa ricavo [E]

Da questa ricavo [EA]

^ν_ο / _Vmax = |A|[B] / K_s^AK_s^AB[A] + [A][B]

ν_ο / ν_max^φ = |A| / K_φ^φ + [A]

ν_max^φ = V_max |B| / K_AB^φ + [B]

K_φ^φ = _{Ks^A / KAB}[B]

In queste formule [B] è costante

^ν_ο / _Vmax = |B| / K_φ^φ[B]

Se si pone ^V_maxφ = V_max^K_Hφ = -K_φ^φK_s^A + K_AB

In questo caso [A] = cost.

Nota: la V_max è proprio la V_max poiché non dipende da [A] dato che essa è il primo a legarsi e basta che essa sia ≫ E_T.

Ping-Pong nelle Transaminasi e Serin proteasi

Si lega il 1^o, si stacca e lascia E modificato, si lega il 2^o.

E + A ⇌ EA ⇾ E' + B ⇌ E'B ⇾ E

ν₀ = K₄ [E'B]

E_T = [E] + [EA] + [E'] + [E'B]

Si considerano le reazioni che formano EA e E'B all'equilibrio.

La forma E' la si considera allo stato stazionario.

Costanti

K_H^A = k_-1 + k₂ + K₅ = [E][A] / [EA]

K_H^B = k_-3 + k₄ K₅ = [E'B][B] / [E'B]

K₂[EA] = K₄ [E'B]

ν₀ = [A1][B] / K₄[E_T] = K₄ K_H^A[B] + [A1][B] / ( K_{4+ 1}) + K_H^B[A1]

Se ammettiamo che k₂ >> k₄

ν_o = [A1][B] dove V_max = k₄ [E_T] x = k₄ / K₂ V_max k_H^A[B] + [A1][B] + K_H^B[A1]

Nota Bene: i rispetto alle limitazioni poste deve valere anche che k_-1 >> k_-2 >> k_-4.

Se teniamo |B| = cost.

_Vo ^A / V_max = |A| / K_M^A + |A| dove V_max = V_max |B| / K_A^B + |B| K_M ^φ = α K_M ^H |B| / K_B^B + |B|

Inibizione

• Competitiva (reversibile)
• Non competitiva
• Puramente non competitiva
• Di tipo misto
• Incompetitiva o acompetitiva

Inibitori: sono molecole che interferiscono con la catalisi, rallentando o bloccando le reazioni enzimatiche.

a. Inibitore e substrato

Competono per lo stesso sito attivo, escludendosi a vicenda (classica). L'esclusione può avvenire anche se I si lega in un sito diverso che fa cambiare il sito attivo e di conseguenza non fa legare il S. Si parla in questo caso di inibizione competitiva non classica.

E + S ⇌_k2 ES ⇌ E + P I /↘ \\ E i

v₀ = ^Vmax/_{1 + KM/([S] (1 + [I]/Ki))} dove ^{(1 + [I]/Ki)}

Nota: Vmax resta la stessa. KM è aumentata di α che aumenta all'aumentare di [I] e a valori di K_i bassi (alta affinità).

Un esempio: succinto diidrogenasi o complesso II o succinico CoQ reduttasi è FAD dipendente. Si trova nella m. mitocondriale interna e catalizza la reazione di ossidazione da α succinico a α fumarico e partecipa alla catena di trasporto. I suoi inibitori sono α bicarbossilici analoghi al substrato.

b. Inibitore e substrato si legano a due siti diversi

Non competitiva: i due siti sono assolutamente indipendenti.

E+S ⇌ ES_K1 ↓