Enzimologia alimentare - Appunti e domande riflessione

ENZIMOLOGIA

ASPETTI TERMODINAMICI

Enzima -> Proteina dotata di proprietà catalitiche dovute alla sua specifica attivazione, solo nel 1930 è

stato scoperto che enzimi sono proteine, non tutti, nei ribosomi sono presenti molecole di RNA che

contribuiscono alla catalisi (ribozimi).

Enzimi sono catalizzatori biologici (accelerano il raggiungimento dell’equilibrio di reazione) → non

sposta l’equilibrio di reazione! Abbrevia il tempo con cui viene raggiunto l’equilibrio. Non fa parte

dell’equazione (non bisogna scriverlo) che descrive la reazione. Quando si parla di reazione catalizzate

substrati prodotti

da enzimi i vengono trasformati in

A + B = C + D,

A e B sono i substrati dell’enzima e diventano C + B.

A+B=C+D

- la reazione è spontanea (procede da sinistra verso

destra) se DG<0 => ESOERGONICA

- La reazione è all’equilibrio DG=0

- la reazione non è spontanea (sono favoriti i reagenti)

se DG>0 => ENDOERGONICA

Dove G è l’energia libera di Gibbs parametro termodinamico che descrive lo stato energetico del

sistema.

DG è la variaz dell’energia libera di Gibbs = DH - TDS è dato dal livello energetico dello stato finale - il

livello energetico dello stato iniziale (Gf-Gi) , se i prodotti hanno il livello energetico inferiore di quello

dei reagenti la reazione avviene spontaneamente, si libererà energia, se siamo al contrario dobbiamo

fornire energia affinché possa avvenire la trasformazione.

SPONTANEITà DELLE REAZIONI CHIMICHE

sistema biologico

In un il DG’=DG°’ + RT ln ([C][D]/[A][B]) (DG primo = DG zero primo)

DG’ è la variazione dell’energia libera del sistema a pH 7, nel passaggio dalle concentrazioni iniziali

all'equilibrio del sistema.

DG’° variazione di energia libera in condizioni standard (tutti i prodotti e reagenti sono 1M, pH 7, 25°C

1 atm) all’equilibrio del sistema

All'equilibrio il DG’=0 quindi DG’° = -RT ln [Ceq][Deq]/[Aeq][Beq] = -RT ln Keq,

Il DG°’ è correlato alla situazione di equilibrio del sistema.

Il valore DG°’ è quello dato nei libri.

Una reazione che ha DG’ negativo è spontanea, ma non implica che proceda ad alta velocità! indica solo

la sua tendenza a procedere verso dx (favorire i prodotti)

es

Glucosio + 6O2 6CO2 + 6H2O

G0 ’ = -686 kcal/mole

Dal punto di vista termodinamico il glucosio all’aria è instabile, ma la reazione non procede a velocità

apprezzabili. Il glucosio è stabile in senso cinetico.

Questa reazione spontaneamente tenderebbe ad avvenire ma è una reazione talmente lenta che non è

percepibile!

La termodinamica esprime se un processo è spontaneo o meno, la cinetica si concentra su quanto

veloce un processo avviene. 1

ASPETTI CINETICI

Velocità di una reazione -> quantità prodotto formato per unità di tempo

La transizione energetica passa sempre per un punto

intermedio che ha energia interna sempre più alta

dell e dei prodotti e dei reagenti, si chiama “stato di

transizione" la differenza energetica tra lo stato

iniziale e lo stato di transizione è chiamata Energia di

attivazione (E reag-E transizione) ci permette di

capire se la reazione sarà veloce o lenta.

I reagenti devono avere un'energia sufficiente per

raggiungere lo stato di transizione e poi “cadere “ a

prodotti finali. L’E attivazione è una barriera

energetica, tanto più sarà alta energia di barriera più

è lenta la reazione perché sarà statisticamente

difficile che il reagente possa avere abbastanza energia per superarla.

Gli enzimi intervengono qui, quando una reazione è catalizzata da enzimi si abbassa l’energia di

attivazione.

SPECIFICA ATTIVAZIONE

Il substrato si attacca all'enzima e forma il complesso Enzima-substrato ⇔ il substrato si modifica e

diventa prodotto abbiamo complesso enzima-prodotto → poi l’enzima si stacca dal prodotto e

otteniamo enzima libero e prodotto (Enzima non si modifica).

E + S ⇔ ES ⇔ EP ⇔ E + P

L'energia di attivazione totale è elevata, l’energia di attivazione del complesso ES ed EP è molto più

bassa. Questa riduzione di energia di attivazione si traduce in un aumento di velocità, si parla di

proprietà di specifica attivazione. Il delta G della reazione non è stato modificato dall’enzima!!

SELETTIVITA’

Enzimi hanno una grande selettività di azione,

- specificità nei confronti del substrato (più o meno alta es esochinasi/glucochinasi, esochinasi

catalizza sia glucosio che su altri composti)

- specificità di reazione (catalizzano una reazione specifica)

- stereospecificità (enzimi possono o formare/legare solo uno specifico stereoisomero)

SITO ATTIVO

Il legame del substrato e la sua trasformazione in prodotto avvengono nel sito attivo.

Nel sito attivo determinate catene laterali di amminoacidi interagiscono con il substrato.

Sito di legame con il substrato: binding locus

Sito dove avviene la catalisi: transforming locus

es

Chimotripsina (proteasi pancreatica idrolizza il legame peptidico adiacente ad amminoacidi idrofobici)

c'è una piccola parte del sito attivo deputata a riconoscere gli AA idrofobici della proteina intera

(binding locus) poi ci sono altri AA che catalizzano la reazione di idrolisi (transforming locus).

I tre AA coinvolti si trovano in posizioni molto lontane tra di loro nella struttura primaria, ma si

trovano vicini in seguito ai ripiegamenti della struttura nativa.

La tripsina (idrolizza amminoacidi basici) ha una diversa specificità. hanno lo stesso transforming

locus ma varia il binding locus. 2

Esiste una complementarietà tra enzima e substrato che permette di legare perfettamente uno

specifico substrato con l’enzima.

ADATTAMENTO INDOTTO

Quando avviene il legame tra enzima e substrato c’è una modifica di conformazione di quest’ultimo.

Questo cambio conformazionale è funzionale al corretto orientamento dei gruppi coinvolti nella

catalisi.

GRUPPI PROSTETICI o COENZIMI

Molti enzimi per funzionare necessitano cofattori che possono essere:

- di natura organica

- di natura inorganica

I cofattori sono definiti:

- gruppi prostetici se sono strettamente legati all’enzima, a volte il gruppo prostetico è legato in

modo covalente all’enzima stesso (es FAD)

- Coenzimi quando il cofattore non è strettamente legato all’enzima stesso (NAD)

Enzimi che utilizzano cofattori sono definiti

- Oloenzimi: insieme della struttura funzionante con cofattore (enzima funzionante)

- Apoenzima la sola struttura polipeptidica con cofattore dissociato (enzima non funzionante)

Alcune proteasi sono degli enzimi che funzionano legate a metalli (metallo-proteasi) il legame col

metallo è necessario.

CLASSIFICAZIONE

Gli enzimi spesso si chiamano con il nome della reazione che catalizzano/substrato → era facile

confondersi, è stata definita una International Enzyme Commission ha introdotto una classificazione

basata su 4 numeri:

Esochinasi E.C. 2.7.1.1

Primo numero: classe di reazione catalizzata

Secondo numero: sottoclasse

Terzo numero: sotto sottoclasse

Quarto numero: seriale dell’enzima nella sua sotto sottoclasse

L’organizzazione di sottoclassi e sottosottoclassi cambia per ogni classe.

classe tipo di reazione catalizzata

1 ossidoreduttasi reazioni di ossido-riduzione

2 transferasi trasferimenti di gruppi

3 idrolasi idrolisi di legami

4 liasi rottura non idrolitica di legami

5 isomerasi interconversione di isomeri 6 ligasi formazione legami utilizzando ATP

Altri aspetti termodinamici

Qualunque enzima non altera l’equilibrio della reazione,

arrivo sempre allo stesso punto finale della reazione

indipendentemente dalle quantità di enzima che

aggiungo. Cambia la velocità.

Per una generica reazione S ⇔ P,

con costante di equilibrio Keq= [Peq]/[Seq]

possiamo definire una massima quantità di prodotto

ottenibile [Peq]=[S]*Keq. 3

es se parto con 100 di substrato e so che se Keq=1, l’equazione si ferma quando [Peq]/[Seq]=1 dire

che avrò [Peq]=50 e [Seq]=50

Possiamo definire la resa di conversione come [P]/[S] quanto prodotto si è formato rispetto al

substrato

[] = in*RESA DI CONVERSIONE LA RESA MASSIMA è QUELLA CHE POSSIAMO AVERE

ALL’EQUILIBRIO

La resa si può calcolare conoscendo la costante di equilibrio / (+)

es

Glucosio -> Fruttosio

Aldoso -> Chetoso

Glucosio è più stabile in quanto può avere più conformazioni (sedia, barca) e perché l’angolo dei

legami carbonio non stressa la strutture, come invece fa il fruttosio

Inoltre il glucosio è tra quelli della sua forma più stabile perché ha gruppi OH equatoriali

In campo alimentare il glucosio viene trasformato in

fruttosio perché quest’ultimo è circa due volte e

mezzo più dolce

Keq glucosio <-> fruttosio

[F]/[G]= 0.64

Resa di conversione = 1−

La velocità di reazione varia al variare della

concentrazione di substrato: man mano che il

substrato diminuisce, la velocità di reazione

diminuisce, perché al diminuire della velocità di

reazione A → B, aumenta la velocità B → A.

Maggiore è la concentrazione iniziale, maggiore la velocità

A parità di concentrazione e condizione, la velocità è influenzata dalla costante di velocità.

L’aumento di concentrazione di enzima influenza quindi la velocità.

Per paragonare diverse reazioni si misura la velocità iniziale (misura della tangente alle curve

cinetiche).

L’equilibrio della reazione è un parametro termodinamico, per modificarlo possiamo interveniamo su

altri parametri, che influenzano la stabilità termodinamica di reagenti e prodotti o la loro

concentrazione. (T e pressione)

Nonostante il nome, la costante di equilibrio …non è costante, e può variare in funzione dei parametri

ambientali

L’unico modo per modificare la resa «termodinamica» di una qualunque reazione è spostare

l’equilibrio, per esempio sottraendo il prodotto alla miscela di reagenti.

Questo equilibrio rimane tale anche con l’enzima, ma con esso varia la velocità di reazione

Come posso migliorare la resa?

1) Vario le condizioni in modo da rendere più favorevole la conversione, per esempio la T

Questo permette l’aumento della resa <10%

L’ulteriore raffreddamento della miscela porta al cambiamento dell’equilibrio

Per evitare questo, dobbiamo togliere l’enzima dalla soluzione prima di raffreddare

2) Come posso avere resa totale di fruttosio?

Uso una resina che cattura fruttosio, così possiamo toglierne e spostare nuovamente

l’equilibrio 4

CATALISI ENZIMATICA

I saggi enzimatici servono per determinare la concentrazione di enzima presente nel sistema.

Per quantificarlo bisogna trovare quanto velocemente procede la reazione, la velocità è direttamente

proporzionale a quanto enzima è presente.

Aspetti cinetici

1) la velocità con la quale reaz A→ B procede è data dalla concentrazione di prodotto nell'unità di

[]

tempo V = ,

2) In una reazione in cui non ci sono enzimi la velocità è condizionata da:

a) Costante di velocità

b) Concentrazione dei reagenti

Per una reazione che segue una cinetica di primo ordine la

velocità è data da v=k[A], la velocità dipende da quanto substrato

è presente, man mano che la reazione procede il substrato

diventa prodotto, se col tempo il reagente diminuisce, la velocità

diminuirà fino ad azzerarsi.

La velocità in questo grafico è dato dalla tangente della curva in

un preciso punto. Stiamo guardando quanto velocemente si

consuma il substrato!! non quanto velocemente il prodotto si

forma!

E’ uguale definire quanto velocemente si forma il prodotto o

quanto velocemente si consuma il substrato

[] []

V = =- .

A parità di concentrazione iniziale di reagenti, la velocità è solo funzione della costante cinetica.

La presenza di un enzima porta ad un aumento della costante di velocità. (perché diminuisce l’energia

di attivazione).

Quando possibile, si misura la “velocità iniziale”, prima che ci

siano variazioni apprezzabili dalla linearità. (perché poi non è

lineare l’andamento) e perchè la concentrazione di substrato è

quella di riferimento (poi il substrato varia).

In altre parole, si cerca di ottenere la tangente alle curve cinetiche

di cui ai tracciati precedenti.

COME MISURARE LA VELOCITA’ DI UNA REAZIONE ENZIMATICA

Parametri da cui dipende la velocità:

❖ concentrazione totale di enzima

❖ concentrazione del substrato

❖ temperatura, pH (in vitro), tutti gli enzimi hanno un ottimo di temperatura e di pH a parità di

concentrazioni di substrato ed enzima, se vario pH o temperatura vario velocità di reazione

L’attività enzimatica misurata mediante un saggio enzimatico ha un significato relativo, essa dipende

ed è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima presente, ma dipende dalla

concentrazione di substrato, dal pH e dalla temperatura… che vanno mantenuti costanti!

L’attività di un enzima non ha nessun significato se non viene indicato in che condizioni è stata

misurata. 5

L’attività enzimatica viene quantificata in Unità (UI):

quantità di E che produce 1 micromole P/minuto

Per definizione 1 UI è la (in

(es

condizioni sperimentali definite e controllate) si sono formati 1 millimole/minuto,

quante UI? 10^3 perché milli 10^-3 e micro 10^-6, si formano 10^3 micromoli/min

(UI)), spesso il segnale misurabile non è espresso in quantità, ma in altri segnali (assorbanza) si usano

diversi metodi per osservare velocità.

L’attività specifica di una preparazione enzimatica

UI presenti per ogni unità di massa

corrisponde al numero di (o di volume) della

preparazione stessa UI/mg = micromoli P/ (min × mg),

In base alla tecnica adottata per quantificare il prodotto formato, possiamo distinguere i saggi

enzimatici in:

➢ Spettrofotometrici/colorimetriciil prodotto si quantofica con l’’assorbanza,

➢ Fluorimetrici

➢ Calorimetrici, misurano il calore scambiato con l'ambiente durante una reazione, ed è

proporzionale a quanti legami si rompono o si formano (velocità della reazione)

➢ Mediante pH-stat, si possono formare sostanze con nature acide/basiche con la formazione

della reazione cambia il pH

➢ Cromatografici

➢ Elettroforetici

➢ Etc…

E’ possibile fare delle misure delle velocità con due modalità:

1. Misure continue: misure con cui posso valutare il tempo reale come varia la velocità in funzione

del tempo

a) con substrati naturali o sintetici

creati in lab, che vanno a mimare il

substrato naturale (hanno

proprietà simili al substrato

naturale) tanto che l’enzima può

compiere la sua reazione anche sul

substrato sintetico.

In giallo c'è l'arginina, legato con

un legame isopeptidico c’è la

nitroanilina simile a quello delle

proteine. La tripsina quindi è in

grado di rompere questo legame e

produrre la para-nitroalanina che

presenta un colore giallo da sola, quindi studiando la presenza del giallo è possibile

capire quanta bapa è presente (la struttura intera)

b) reazioni che alterano il pH

molte reazioni enzimatiche portano al rilascio di acidi o di basi (es trigliceridi →acidi

grassi e glicerolo), si può misurare la variazione di pH conseguente all’aggiunta

dell’enzima.

Il vantaggio di questa metodologia è che può essere utilizzata anche su sospensioni

ricche in solidi o su emulsioni, dove non si possono utilizzare metodi spettrofotometrici

(questi campioni sono opachi (latte) o torbidi, assorbanza non misurabile). 6

Assumendo di seguire una reazione che produce acidi, come nell’esempio qui a fianco,

la velocità di reazione è proporzionale al decremento di pH nel tempo. Le moli del

prodotto formato sono deducibili dall’aumento di pH (quantità nota di base forte NaOH.

Uso titolatori automatici che permettono di mantenere costante il pH della reazione

mediante l’aggiunta «misurata» di una base. La velocità con la quale viene aggiunta la

base (micromoli/min, calcolabili conoscendo la concentrazione e il volume aggiunto

nell’unità di tempo) costituiscono una misura dell’attività enzimatica. Aggiunta di base

forte è fatta costantemente durante la reazione per mantenere costante il pH.

c) accoppiando più reazioni enzimatiche Molte reazioni enzimatiche non portano alla

formazione o alla scomparsa di composti facilmente rilevabili con comuni metodi

analitici. In questo caso, si può ricorrere ad altri enzimi (e, se necessario, ai loro

substrati), che trasformano i prodotti della reazione in composti misurabili, realizzando

appunto l’idea di accoppiare una o più reazioni enzimatiche.

es: Misura continua di attività di beta-galattosidasi

L’enzima beta-galattosidasi converte il lattosio in una miscela 1/1 di galattosio e glucosio, ed è

utilizzato per la preparazione del latte de-lattosato. La reazione di idrolisi non produce materiale

facilmente individuabile (non c’è assorbime