Enzimologia alimentare - Appunti e domande riflessione

Effetto del pH sulla catalisi

Abbiamo un massimo in funzione del pH di reazione, otteniamo sempre curve a campana perché dipende dal fatto che perché l'enzima sia attivo devono essere simultaneamente presenti gruppi carichi sulle catene laterali di amminoacidi, e che questi gruppi rispondono in modo diverso al cambiamento di pH.

Quasi tutti gli enzimi mostrano una dipendenza della loro capacità catalitica dal pH, con un massimo ad un valore di pH che viene definito come "pH optimum". Questo valore è - di solito - più alto in enzimi da batteri che non in enzimi di origine fungina.

ATTENZIONE: queste osservazioni si riferiscono solo alle modificazioni reversibili indotte dal pH, e non riguardano gli effetti del pH sulla stabilità della struttura proteica dell'enzima!

Questo perché il pH va ad influenzare gli stati di dissociazione degli enzimi proteine, è importante lo stato di carica perché questi

gruppi con carica opposta possono formare legami ionici dando una particolare struttura conformazionale. Quando il substrato è carico, riconosce AA con determinate (es. tripsina riconosce AA basici, nel sito attivo ha AA con carica negativa). Quello che cambia è l'efficienza catalitica o la sua capacità di legarsi con il substrato.

STABILITÀ E STABILIZZAZIONE: è una stabilità relativa perché sono legami deboli che stabilizzano maggiormente la struttura nativa delle proteine. In opportune condizioni l'enzima, come tutte le proteine, si può denaturare e perdere la sua struttura.

Denaturanti fisici:

• radiazioni ionizzanti
• shear forces
• trattamenti che influenzano la struttura dell'acqua (temperatura, altissime pressioni)

Radiazioni ionizzanti: usate per trattare alcuni prodotti alimentari, anche se sono denaturanti fisici hanno un effetto chimico, riescono a rompere l'acqua in modo omolitico formando radicali che sono specie chimiche.

molto reattive che possono instaurare reazioni con i gruppi funzionali degli enzimiandando a disattivarli.

Shear forces: molto presenti nelle tecnologie alimentari es glutine, quando impastiamo le protaccettano acqua e si aprono formando un impasto. Abbiamo anche dei processi dove ci sono sforzimeccanici intensi es quando i liquidi vengono pompati possono dare deformazione meccanicaportando ad una condizione denaturante (anche omogenizzazione). Molte volte ci sono dellecondizioni che rendono le proteine ancora più suscettibili a questi processi es. abbiamo un aumento dipressione e poi T, la T più è alta più la prot diventa flessibile è più è suscettibile a modificazioni, anchevariazioni di pH e agenti chelanti possono influire sull’azione delle shear forces, anche la presenza dipiù interfacce (liquide/solide/gas).

Trattamenti che influenzano la struttura dell’acqua- temperatura- congelamento- altissime pressioni

In tutti

questi casi l'acqua perde la sua capacità strutturante: perché quando la proteina si apre l'acqua a contatto con la parte idrofobica deve ordinarsi e quindi abbassa la sua entropia o perché troppo ordinata (altissime pressioni) o perché forma un reticolo stabile (congelamento) → termodinamicamente sfavorito. Viene così a mancare la "spinta entropica" alla formazione di legami idrofobici, in quanto l'acqua non può strutturarsi attorno alle regioni idrofobiche della proteina, consentendo la loro esposizione e – di conseguenza – alterando le interazioni idrofobiche tra elementi strutturali nella proteina. In opportune condizioni la denaturazione può anche essere reversibile. Temperatura: legami H si rompono per via cinetica, l'acqua è meno ordinata, riesce a legarsi meno con le parti idrofobiche, il congelamento invece blocca le molecole d'acqua, non riesce più a svolgere la

sua forza entropica

Come tutti gli equilibri chimici la reazione nativo/prot denaturata ha un suo DG che è dato dalla differenza del contenuto energetico della forma denaturata è quello della conformazione nativa, 13se DG<0 la forma denaturata e su un livello inferiore → avviene naturalmente la denaturazione.

Se DG>0 la forma nativa ha un contenuto energetico più basso e rimane più presente.

Il DG che descrive la reazione varia con la temperatura, possiamo trovare due tipi di denaturazione.

Td (Hot) temperatura a caldo con la quale si denatura Td(cold) temperatura al di sotto della quale la struttura si denatura.

Più la proteina è denaturata più la cinetica rallenta. !! IMPO● Pressione : variando la P il DG tende ad essere positivo o negativo, altissime pressioni possono spingere l'equilibrio verso la forma denaturata.

Le alte pressioni sono utili perché non inducono modificazioni covalenti alle R degli AA →

Quando si parla di stabilità proteica non posso considerare le bassissime pressioni perché non ci posso arrivare, in generale si parla di temperature alte e basse ad alte pressioni. Le alte pressioni sono utilizzate anche per la conservazione dei prodotti alimentari in quanto hanno la capacità di inattivare i microrganismi. HPP-High Pressure Pasteurization è la tecnica di pastorizzazione a altissima pressione (600 MPa, 6000 bar). Denaturanti chimici - pH - caotropi - reattivi specifici (ad es., metalli pesanti, HCHO) - solventi e interfacce - agenti ossidanti Il pH va a modificare lo stato di carica dei gruppi funzionali e può rompere legami elettrostatici interni alla proteina. Estremi Valori di pH – o concentrazioni elevate di sali lipofili - vanno ad alterare in modo irreversibile le interazioni ioniche all'interno della proteina. Questo si traduce in una perdita irreversibile di struttura, a differenza

di quanto accade per le interazioni tra cariche delle catene laterali diamminoacidi sulla superficie della proteina. (Non è sempre denaturante, solo per valori estremi)

Ioni: hanno effetto destabilizzante o stabilizzante sulla proteina. Per capire quelle dei due sia si usa laserie di Hoffmaister.

• Liofili- aumentando stabilità proteina, si legano alle cariche esterne- cosmotropi- (alcuni) hanno grandi dimensioni con un numero elevato di cariche SO4-2 e NH4+- solfato di ammonio V stabilizzante!!! È anche precipitante, usato anche nell'industria per renderli più resistenti nel tempo. 14
• Lipofili- diminuiscono stabilità proteina,- denaturanti- caotropici- SCN- one solfocianuro è un anione spiccatamente denaturante. (Concentrazioni alte!!)

Sali sono generalmente neutri

Caotropi:

I comuni agenti caotropi (urea, ioni guanidinio che può fare sale con cl) funzionano – a concentrazioni elevate, di norma superiori a 2 M - disturbando

La struttura dell'acqua, e pertanto eliminandone la "capacità strutturante". Sono sali molto polari, possono essere neutri, la loro capacità denaturante sta nel fatto che legano molecole di H2O, se la proteina dovesse esporre regioni idrofobiche l'acqua con caotropici non va a legarsi ai legami idrofobici quindi la proteina si può denaturare. Detergenti: Tensioattivi, possiedono una parte idrofobica e una idrofilica per emulsionare le due parti. A volte sono denaturanti, altre volte hanno azione sinergica con temperatura infatti tendono a stabilizzare le strutture disavvolte della proteina generate da altri trattamenti (fisici o chimici) inglobando le regioni idrofobiche esposte dalla proteina denaturata all'interno della regione idrofobica della micella di detergente. Dal punto di vista termodinamico la forma denaturata della proteina in presenza di detergente sarà stabile. Solventi: I solventi miscibili con l'acqua (acetone, etanolo, propanolo, ecc.)acetonitrile, dimetilformammide, dimetilsulfossido, etc.) possono denaturare proteine se utilizzati a concentrazioni elevate in quanto: a) diminuiscono la "spinta entropica" dell'acqua → minore numero di molecole di H2O che si dispongono attorno alla proteina, riducendo la sua solubilità e favorendo la denaturazione. b) alterano le interazioni ioniche → modificano la costante dielettrica del solvente, che è una misura della capacità del solvente di mascherare due cariche che potrebbero attrarsi o respingersi. L'acqua, essendo polare, tende a schermare le cariche in soluzione. L'aggiunta di solventi organici può alterare questa capacità di schermatura, influenzando le interazioni ioniche all'interno della proteina. Inoltre, solventi immiscibili come lipidi, solventi organici o la presenza di sistemi micellari (come i detergenti) possono denaturare la proteina favorendo l'esposizione del suo core idrofobico. Questi solventi stabilizzano al loro interno le forme denaturate generate soprattutto da concomitanti sollecitazioni fisiche come temperatura e forze di taglio.

parte verde è apolare, la proteina si denatura e espone le regioni idrofobiche all'esterno, abbiamo una denaturazione all'interfaccia! questa è molto forte se sono presenti anche sollecitazioni fisiche

Reattivi specifici:

I cosiddetti "metalli pesanti" (Cd, Hg, Ag, Pb) sono caratterizzati da un'elevata tiofilicità, per cui si legano irreversibilmente alle funzioni -SH sulle cisteine della proteina.

Agenti come la formaldeide reagiscono invece prontamente con le funzioni amminiche (lisina) della proteina, formando irreversibilmente basi di Schiff.

Le cisteine sono anche il bersaglio di comuni agenti ossidanti (come il perborato dei detersivi o l'acqua ossigenata prodotta per via chimica od enzimatica), che possono ossidarle formando legami disolfuro, ma anche trasformando la funzione tiotere -S-CH3 nella metionina in funzioni sulfossido o sulfone.

Esistono diversi metodi per stabilizzare gli enzimi:

1. Interventi sull'intorno

ta di zuccheri o polialcoli può aiutare a stabilizzare le proteine, proteggendole dalla denaturazione causata dall'acqua. 2) INTERVENTI SULLA PROTEINA Modifica del pH Il pH influisce sulla carica e sulla struttura delle proteine. Modificando il pH, è possibile alterare la stabilità delle proteine. Ad esempio, alcune proteine sono più stabili a pH acido, mentre altre sono più stabili a pH basico. Modifica della temperatura La temperatura può influenzare la stabilità delle proteine. Alcune proteine sono più stabili a temperature elevate, mentre altre sono più stabili a temperature più basse. La modifica della temperatura può essere utilizzata per denaturare o stabilizzare le proteine. Modifica della concentrazione di proteine La concentrazione di proteine può influenzare la loro stabilità. A volte, aumentare la concentrazione di proteine può aiutare a stabilizzarle, mentre in altri casi una diminuzione della concentrazione può essere necessaria per evitare la formazione di aggregati. 3) INTERVENTI SU ELEMENTI DI DEGRADAZIONE BIOLOGICA Inibitori di proteasi Le proteasi sono enzimi che degradano le proteine. L'aggiunta di inibitori di proteasi può aiutare a prevenire la degradazione delle proteine durante la conservazione o l'analisi. Antiossidanti Gli antiossidanti possono aiutare a prevenire la degradazione delle proteine causata dall'ossidazione. L'aggiunta di antiossidanti può proteggere le proteine dall'azione dei radicali liberi e da altri agenti ossidanti. Chelanti di metalli Alcuni metalli possono catalizzare la degradazione delle proteine. L'aggiunta di chelanti di metalli può aiutare a prevenire questa degradazione legando i metalli e impedendo loro di reagire con le proteine. Questi sono solo alcuni esempi di interventi che possono essere utilizzati per stabilizzare le proteine o prevenire la loro degradazione. La scelta degli interventi dipende dal tipo di proteina e dalle condizioni specifiche di conservazione o analisi.