Enzimologia

Enzimologia (lezione 1)

Introduzione

L'enzimologia vuol dire studiare il comportamento degli enzimi ed è la prima cosa che bisogna fare se noi vogliamo utilizzare gli enzimi a scopo biotecnologico. Tutte le tecnologie che esistono oggi sono basate sull’uso degli enzimi. Ovviamente, prima di poterli impiegare, bisogna conoscere esattamente il loro comportamento sia in vivo, nella cellula iniziale, sia al momento dell’impiego.

Come si conosce lo studio degli enzimi è quello che impareremo noi in questo corso. Quindi parleremo, inizieremo già oggi a fare un cenno tra la differenza tra termodinamica e cinetica, poi parleremo della cinetica enzimatica cominciando dall’inizio. Vi farò anche un minimo di storia dell’enzimologia, e vedremo che la Michaelis-Menten, che è il più semplice metodo per studiare la cinetica di un enzima, non è un’equazione semplice. Cioè si può arrivare a una forma che descrive la Michaelis-Menten partendo da tre ipotesi di ragionamento completamente diverse, che hanno poi significati completamente diversi su quello che sono i significati dei parametri. Questo ve lo faccio fare proprio per farvi capire la differenza tra il grafico che io ottengo e il significato di quel grafico, cioè vedere che un grafico è quello di un’iperbole non vuol dire che per forza dietro c’è una Michaelis-Menten.

Poi parleremo appunto del significato dei parametri e di come si calcolano questi parametri, e lì scopriremo che ci sono vari modi per calcolare i parametri della Michaelis-Menten che non sono affatto equivalenti. Quindi vedremo le differenze tra l’uno e l’altro e gli errori che si possono fare utilizzando un grafico piuttosto che un altro.

Poi parleremo di inibizione, perché negli utilizzi biotecnologici il fastidio più grande che può derivare è quello che il nostro campione può essere sporco di qualche inibitore e quindi noi dobbiamo essere in grado di individuare l’inibitore sia nel campione di partenza che nel prodotto finito. Parleremo dei vari tipi di inibizione.

Dopodiché arriviamo alla parte più complicata, cioè gli enzimi più complicati, cioè quelli che sono regolati; la regolazione può essere di vari tipi, reversibile o irreversibile. Di quella reversibile ci sono quelle che diciamo presentano un po’ tutti gli enzimi, anche quelli monomerici, e la regolazione più difficile che è quella dell’allosteria. Studieremo anche un pochino i modelli allosterici e così via.

Enzimi

In tutto questo corso noi parliamo di enzimi ovviamente, perché gli enzimi sono importantissimi perché regolano e permettono il metabolismo cellulare e sono ampiamente utilizzati in tantissimi campi della biotecnologia, sia come indicatori in metodologie mediche, sia come indicatori di patologie o di disfunzioni metaboliche, sia come farmaci.

Sono noti circa 25.000 enzimi diversi nelle cellule viventi, quindi non è una piccola quantità, di cui almeno 3.000 sono descritti in dettaglio. Descritti in dettaglio significa che conosco non soltanto la struttura primaria, ma anche come è fatto il sito catalitico, quali sono gli inibitori e gli attivatori, e qual è la struttura tridimensionale dell’enzima, quindi sono stati anche cristallizzati. Conoscere soltanto l’attività catalitica significa che io ho identificato l’enzima ma non lo conosco in dettaglio.

Alcune centinaia di enzimi sono disponibili commercialmente e quindi sono utilizzabili tranquillamente. E soprattutto gli enzimi sono delle molecole che non soltanto accelerano la velocità di una reazione perché sono dei catalizzatori, ma sono anche in grado di controllarla (prima grande differenza tra un catalizzatore organico rispetto a uno inorganico).

Un catalizzatore inorganico io lo metto a contatto con il substrato e non fa altro che trasformarmi tutto quel substrato fino alla fine senza nessun controllo; l’enzima no, l’enzima controlla la velocità, quindi mi trasforma il substrato di cui la cellula ha bisogno ma a un certo punto se la cellula non ne ha bisogno rallenta e si ferma, quindi sono dei catalizzatori molto più importanti dei catalizzatori inorganici. Le reazioni appunto catalizzate non da enzimi ma da catalizzatori inorganici procedono fino alla fine senza la possibilità di essere fermate.

Quindi gli enzimi sono dei catalizzatori sì, ma altamente specifici, quindi sono dei catalizzatori, ma non basta dire che siano dei catalizzatori. La catalisi enzimatica a cosa è dovuta? Soprattutto alla conformazione del sito attivo, nel sito attivo ci sono degli amminoacidi del sito attivo che legano il substrato in una conformazione che poi predispone alla catalisi, e per questo vi dirò delle cose che voi sicuramente non avete pensato perché nel corso di biochimica non c’è stato il tempo di soffermarsi, ma ci sono delle cose che adesso vedremo in dettaglio.

Dipendono molto spesso da fattori non enzimatici, tipo cofattori, ioni metallici e così via, e la natura proteica degli enzimi ci permette di adattare la loro specificità di catalisi a qualsiasi substrato per mezzo di varie tecniche di ingegneria proteica.

Che cosa voglio dire? Voglio dire che quando dobbiamo utilizzare un enzima per scopo biotecnologico, la prima cosa che si fa è si cerca tra gli enzimi naturali prodotti dalle varie cellule, si cerca quello più adatto, però molto spesso capita che il substrato che noi dobbiamo far metabolizzare a quell’enzima non è un substrato naturale, e quindi non è molto affine al sito attivo, magari è un pesticida, non è una molecola naturale prodotta dalle cellule, quindi le cellule non hanno un enzima esattamente dedicato a quel tipo di catalisi, io posso modificare l’attività degli enzimi naturali, mediante tecnica di mutagenesi sito-specifica, modeling molecolare, e così via, per costruirmi un enzima che sia più adatto al tipo di catalisi, ovviamente per fare questo io devo conoscere molto bene appunto il comportamento dell’enzima per capire dove modificarlo, quindi le tecniche di enzimologia sono indispensabili in questo caso.

Questo è un esempio, l’acido isocaproico viene trasformato in un complesso chirale da un enzima che è l’α-idrossicaproato-deidrogenasi, questo composto chirale è prodotto con bassa efficienza da un enzima naturale, bassa efficienza lo vedremo dopo è dato dal rapporto K_cat/K_M che è la costante di specificità, tra qualche lezione sapremo cosa è. Se io invece lo vado a mutare e trasformare l’enzima in un enzima geneticamente modificato, l’efficienza mi aumenta di 10.000 volte, quindi ottengo un enzima che è molto più adatto per essere utilizzato. Quindi questo lo si fa quando io trovo l’enzima che mi va bene per un certo tipo di reazione, ma che è troppo poco efficiente per essere utilizzato a livello biotecnologico.

Differenza tra termodinamica e cinetica

Parliamo di differenza tra termodinamica e cinetica. La termodinamica si basa su tre leggi. Allora il nostro fine è studiare il comportamento di un enzima, cioè studiare una reazione enzimatica, una reazione chimica in effetti, e dobbiamo capire quale di queste leggi della termodinamica è quella che mi è più utile per studiare una reazione enzimatica e capire se questa reazione può avvenire o non può avvenire, perché la prima cosa che vi dico è che gli enzimi sono delle molecole eccezionali, però non contravvengono mai le regole della termodinamica, cioè se la termodinamica dice che una reazione non può avvenire, non c’è enzima che tenga.

Quindi prima devo sapere che una reazione può avvenire, poi posso aggiungere un enzima per aumentare la velocità di quella reazione, ma prima devo sapere se la reazione può avvenire, altrimenti non ci perdo neanche il tempo a cercarci l’enzima. Poi tra poco vi dirò che quello che ho detto non è vero, perché posso fare in qualunque modo, posso far avvenire una reazione in qualunque modo, però questo ve lo dirò fra poco.

La prima legge della termodinamica dice che “l’energia dell’universo è costante”, scritta in formule chimiche è:

variazione di energia del sistema + variazione di energia dell’ambiente = costante

Questa la potete dire in tanti modi, potrebbe anche essere compresa nel principio di Lavoisier che dice che “in natura nulla si crea, nulla si distrugge, tutto si trasforma”, anche l’energia si trasforma e quindi l’energia dell’universo è costante. Questo è verissimo ed è rispettato sempre. Il problema è, io devo studiare una reazione chimica, la reazione chimica è un sistema, per sapere se questa reazione avviene, utilizzando la prima legge della termodinamica, io ho bisogno di conoscere anche l’energia dell’ambiente, l’ambiente è tutto l’universo, come me la calcolo? Quindi questa è vera, ma non ci serve molto.

Intanto, pensiamo un attimo, la variazione di energia dipende soltanto dallo stadio iniziale e finale e non dalla via seguita dalla trasformazione, quindi questa legge vale sia per un sistema catalizzato che per un sistema non catalizzato, perché la via percorsa dalla trasformazione non è contemplata.

La posso scrivere come:

variazione del sistema = variazione di calore – variazione di lavoro

Ma questo ci interessa poco, e quello che io so è che l’energia del sistema in un processo spontaneo può essere qualunque, può aumentare, può diminuire e può essere costante, quindi non ho saputo niente.

ΔE può essere > 0, < 0 o = 0. Tutto questo per dirvi che la prima legge della termodinamica non ci serve.

La seconda legge della termodinamica dice che “l’entropia dell’universo in un processo spontaneo aumenta”, siamo si solito alle solite, dell’universo, quindi la reazione di entropia dell’universo è data da:

entropia dell’universo = entropia del sistema + l’entropia dell’ambiente

E alla fine di un processo spontaneo io ho un aumento di entropia, cioè un aumento del disordine dell’universo. In un processo spontaneo l’entropia dell’universo è positiva (> 0), però come faccio a misurare l’entropia dell’ambiente? Riflettiamoci un secondo su questa seconda legge perché ci dirà delle cose carine.

L’entropia del sistema può essere > 0, < 0 o = 0, facciamo finta di esserci dimenticati che c’è anche l’energia dell’ambiente e vediamo quanto è vero che l’entropia del sistema aumenta. Prendiamo una reazione qualunque:

glucosio + 6 ossigeno → 6 anidride carbonica + 6 acqua

Questo processo è spontaneo? Mi dite di sì perché è quello che le nostre cellule fanno continuamente, prendiamo lo zucchero e lo trasformiamo in energia. Allora ragioniamoci secondo la seconda legge della termodinamica, noi partiamo da una molecola di glucosio e 6 molecole di ossigeno, quindi partiamo da 7 molecole, alla fine otteniamo 6 molecole di anidride carbonica e 6 molecole di acqua, cioè 12 molecole, quindi l’entropia è aumentata. In questo caso anche l’entropia del sistema aumenta, quindi il processo è spontaneo. Pensate che sia sempre così?

Io posso farvi anche un altro esempio, prendo due bocce, una vuota e l’altra piena di una soluzione di NaCl 1 M, quindi in una c’è un bell’impacchettamento di molecole e nell’altra non c’è niente, apro il rubinetto e quello che succede è che all’equilibrio io mi trovo che l’NaCl è diviso tra le due bocce, quindi le stesse molecole hanno uno spazio a disposizione il doppio più grande, quindi il disordine di queste molecole è aumentato, anche questo è un processo in cui chiaramente si vede che l’entropia del nostro sistema è aumentata. Quindi sembrerebbe di dire che l’entropia di un sistema, in ogni caso, in un processo spontaneo aumenta.

Non è sempre così! Perché ci sono molti processi spontanei in cui l’entropia del sistema diminuisce. Ad esempio, prendiamo una bella boccia con tante lettere messe a caso, disordinate, arriva un signore che si chiamava Dante Alighieri e le mette in fila e ci scrive un poema, che ha fatto? Ha fatto un processo anti-entropico, cioè ha ordinato un qualcosa di disordinato prima.

Lasciamo perdere la letteratura, pensiamo alle cellule. Quanti processi sapete in cui l’entropia del sistema diminuisce? Processi che noi facciamo continuamente, la sintesi di una proteina da cosa parte? Dai 20 amminoacidi che sono liberi nella cellula, che vengono messi in fila ordinati con una logica perfettamente definita prima e si definisce una molecola proteica, anche lì siamo andati in un processo anti-entropico, abbiamo messo in fila un disordine di amminoacidi per costruire una proteina. Ed è un processo spontaneo, per fortuna, altrimenti noi non saremmo qui.

Quindi anche in questo caso tutto quello che è la sintesi di macromolecole biologiche, quindi proteine, acidi nucleici, membrane, è un processo che avviene spontaneamente però l’entropia del sistema in questo caso diminuisce. E per esempio, se io prendo due frammenti di DNA, come due eliche separate e le vado a mescolare insieme, quello che ottengo sono dei filamenti a doppia elica, quindi anche in questo caso ho diminuito l’entropia ed è un processo spontaneo. Il DNA facilmente si associa per formare 10 filamenti a doppia elica. Quindi l’entropia del sistema diminuisce.

Quindi la seconda legge della termodinamica ci dice che l’entropia dell’universo aumenta, ma non sempre, quella del nostro sistema aumenta, anzi molto spesso l’entropia del nostro sistema può diminuire. Si dice anche che l’informazione, cioè quella che è contenuta nel ribosoma per sintetizzare una proteina ad esempio, è una forma di energia, definita come entropia negativa, perché causa una diminuzione di entropia.

Questi processi però non contravvengono la seconda legge della termodinamica, perché se l’entropia del sistema diminuisce vuol dire che quella dell’ambiente è aumentata di conseguenza in maniera maggiore, in totale quella del sistema + quella dell’ambiente è sempre aumentata. Se voi vi ricordate qualcosa di biochimica, sapete che nella sintesi di una proteina, quello che si libera è ATP, l’ATP viene liberato, viene liberato pirofosfato e questo libera energia, questa energia viene rilasciata nell’ambiente e questo calore è la forma di entropia che aumenta.

Quindi le leggi della termodinamica sono valide sempre, anche quando ci sembra che vadano leggermente contro le leggi della termodinamica, quindi se è vero che l’entropia del sistema diminuisce, vuol dire che quella dell’ambiente è aumentata in misura ancora maggiore in modo che il totale sia sempre positivo. Ecco perché molte reazioni avvengono proprio per effetto dell’ATP che rilascia calore nell’ambiente, molto spesso l’ATP non serve come donatore di gruppo, serve soltanto per dare energia, il dare energia serve a questo.

Quindi la seconda legge della termodinamica è rispettata sempre, però non ci è molto utile perché io non riesco a focalizzarmi soltanto sul mio sistema.

La terza legge della termodinamica è utile perché non devo più tener conto delle proprietà dell’ambiente, ed è quella che definisce l’energia libera di Gibbs, che è definita come:

energia libera = entalpia – il prodotto tra temperatura ed entropia

E in un processo spontaneo stavolta finalmente io so che l’energia libera deve diminuire, ma l’energia libera del mio sistema finalmente, quindi posso calcolarmi soltanto quello che avviene nella reazione chimica che sto studiando, non devo preoccuparmi di tutto l’ambiente.

ΔG, Quindi se G = H – TS in un processo io devo vedermi la variazione di energia libera, quindi il che è dato da:

Perché devo fare il differenziale di tutti e due i prodotti, quindi il primo costante, il secondo che varia e viceversa. Questo è vero per una qualunque reazione, ma pensiamo agli enzimi, gli enzimi come lavorano? Nelle cellule. Che variazione di temperatura c’è in una reazione chimica all’interno di una cellula? ΔT Praticamente nessuna, avvengono a temperatura costante, quindi il ΔT è = 0, quindi quel termine lo posso togliere:

Quindi a temperatura e pressione costante come in tutte le reazioni all’interno di una cellula catalizzata da enzimi avremo:

Quindi siamo arrivati a questo, ma sappiamo che H è dato da:

entalpia = energia fornita al sistema – il prodotto di pressione per volume

Quindi:

Ancora una volta siamo a temperatura e pressione costanti, quindi i due termini si tolgono quindi io posso dire che:

Ragionateci, non ve lo chiederò mai, ma l’importante è che ci ragioniate.