Enzimologia

ENZIMI

Un enzima è un catalizzatore di reazioni biologiche. Accelera il raggiungimento

dell’equilibrio (concentrazioni relative di reagenti e prodotti non cambiano più nel tempo) di

una reazione chimica (spontanea) senza spostarlo. Tutti gli enzimi sono proteine.

I reagenti sui quali agisce l’enzima sono i substrati. Prima di trasformarsi in prodotto, le

molecole di substrato passano per uno stato di transizione a maggiore contenuto

energetico rispetto a quello iniziale. La differenza tra il livello energetico dello stato di

transizione e quello iniziale del substrato è detta energia di attivazione. L’enzima si lega

al substrato (in stato di transizione) e il complesso enzima-substrato abbassa l’energia di

attivazione. Il complesso è tenuto insieme da legami deboli, che liberano energia

abbassando il contenuto energetico del complesso. L’enzima non fa avvenire una

reazione non spontanea, ma accelera il raggiungimento dell’equilibrio. Un substrato si

trasforma in prodotto perché generalmente questo ha livello energetico più basso.

L’enzima diminuisce l’energia che devo dare alla molecola perché venga trasformata.

Il substrato si lega a livello del sito attivo, una tasca specifica per quel substrato,

meccanismo chiave-serratura. L’enzima ha tre caratteristiche principali:

 Specificità: riconoscimento selettivo del proprio substrato, stereochimico (posizioni

spaziali di atomi), di gruppo e di legame. La specificità dei legami dipende da quali

aa sono presenti nel sito attivo e quali gruppi R possono formare legami deboli con

il substrato.

 Saturabilità: massima quando tutti i siti attivi di tutti gli enzimi presenti sono

saturate, legate al substrato, la velocità di catalisi è massima e non può aumentare

ulteriormente.

 Inibibilità: una reazione può essere rallentata o bloccata se l’enzima viene inibito o

con una molecola molto simile al substrato o un eccesso di substrato.

Sito attivo e sito catalitico: non sono sempre distinguibili. Nella formazione del sito attivo

rientrano le R degli aa che si affacciano sulla tasca, queste riconoscono il substrato. Il sito

catalitico può usare R di aa ma anche gruppi chimici diversi forniti da coenzimi e cofattori.

(Per capire quali aa sono importanti nelle reazioni, creo una versione della proteina mutata

dove sostituisco l’aa).

Alcuni enzimi svolgono la loro funzione se associati a cofattori o coenzimi.

COFATTORI:

Molecole (no aa) che si inseriscono nella proteina con legami forti. Ioni per mantenere la

struttura della proteina/enzima o per il meccanismo di reazione se presenti nel sito attivo

(Cu, Fe, Zn, Mg ecc). Gruppi prostetici sono invece cofattori che si associano in modo

permanente alla proteina.

COENZIMI:

Sono molecole organiche non proteiche. Sono essenziali per la funzione enzimatica e

sono spesso derivati da vitamine. Se si associano in modo transitorio, sono co-substrati

(NAD+;NADP+). NAD+ e NADP+ funzionano rispetto all’enzima come substrati, escono in

forma ridotta o viceversa ossidati. Il FAD invece è già presente nel sito attivo e funziona

quindi come gruppo prostetico, legato in modo covalente al sito attivo. Catalizzano tutti

reazioni di ossidoriduzione.

La forma ossidata e quella ridotta del NAD hanno una importante differenza quando

guardate lo spettrofotometro: strumento che manda luce a diversa lunghezza d’onda.

Se io guardo il NAD+ dentro a uno spettrofotometro, vedo che il massimo spettro di

assorbimento è a 260 nanometri. L’assorbimento in uno spettro fotonico è proporzionale

alla quantità di molecole che bloccano la luce. Quando la molecola è ridotta (NADH) lo

spettro è diverso. Picco di assorbimento a 260 e assorbe anche alla lunghezza di 340 nm.

Se io in laboratorio voglio dosare l’attività di un enzima che usa NAD+ e che lo trasforma

in NADH, volendo seguire la trasformazione, metto lo spettro a 340. A 260 non mi accorgo

se NAD+ è rimasto tale o è diventato NADH perché entrambi assorbono a questo valore.

Utilizzate queste differenze di assorbimento tra NAD+ e NADH o NADP+ e NADPH per

dosaggi enzimatici: se so che un certo enzima è causa di una malattia, lo doso per

capire quanto tale enzima è presente nel sangue del mio paziente.

CLASSIFICAZIONE ENZIMI:

Gli enzimi sono denominati e classificati in base alle reazioni che catalizzano. Ci sono 6

classi divise in sottoclassi. Ad ogni enzima sono associate quattro cifre.

Le sei classi:

 Ossidoriduttasi: catalizzano reazioni di ossidoriduzione (reversibili). La maggior parte

sono deidrogenasi. Il substrato rid incontra il coenzima ox, si formano prodotto ox e

coenzima rid. Esempio: lattato/lattico deidrogenasi, ultima tappa della glicolisi

anaerobia. Lattato viene ossidato in piruvato, il NAD+ viene ridotto a NADH. (Se ossido un

alcol II ottengo un chetone, da un alcol I un’aldeide, poi acido carbossilico e poi CO2).

Esempio: il succinato viene ossidato a fumarato, il FAD viene ridotto a FADH2. Altre

ossidoreduttasi sono deidrogenasi, ossidasi, ossigenasi, reduttasi e catalasi.

 Transferasi: catalizzano reazioni di trasferimento di gruppo. Molte richiedono la presenza

di coenzimi. Esempio: le chinasi trasferiscono un P dall’ATP a una molecola accetrice,

come la glicogeno fosforilasi chinasi, fosforila un enzima, modifica post-traduzionale.

Sono reversibili o meno a seconda del delta G di idrolisi. Solitamente irreversibili, ci sono

tante molecole che accettano P ma poche che sono in grado di donarlo ad ADP (solo 3

molecole che raggiungerebbero una forma più stabile donando P). Esempio: transaminasi,

trasferiscono gruppi amminici.

 Idrolasi: catalizzano reazioni di idrolisi di legami, rottura di un legame per introduzione di

una molecola d’acqua. Sono sempre reazioni irreversibili. Esempi: enzimi che scindono il

legame peptidico. Esempio: fosfatasi, tramite inserimento di una molecola d’acqua

scissione di esteri fosforici. Altri esempi: esterasi, fosfatasi, tiolasi, glicosidasi, peptidasi e

proteasi.

(Tre famiglie di enzimi che riguardano il fosfato: le chinasi trasferiscono P da un ATP a una

molecola ricevente; le fosfatasi idrolizzano P scindendolo con aggiunta di acqua; le

fosforilasi inseriscono P su una molecola e scindono la molecola stessa).

 Liasi: eliminazione di gruppi per generare doppi legami. Catalizzano reazioni di rottura

non idrolitica e non ossidativa. Sono reazioni reversibili, non richiedono mai consumo di

energia. Esempi: Aldolasi, scissione del fruttosio 1,6 bifosfato in G3P e DHAP. Esempio:

fumarasi, trasforma il fumarato, tramite aggiunta di acqua, in L-malato (non è una idrolasi

perché la reazione è reversibile). Altri esempi sono decarbossilasi, aldolasi e sintasi.

 Isomerasi: catalizzano reazioni di isomerizzazione, sono reversibili. La reazione avvien da

una parte o dall’altra in base all’equilibrio (da quale dei due isomeri sottraggo). Esempio:

fosfoglucosio-isomerasi trasforma glucosio 6P in fruttosio 6P. Esempio: triosofosfato

isomerasi catalizza DHAP in G3P.

 Ligasi: catalizzano la formazione di un legame tra due substrati. Richiedono energia e

sono spesso irreversibili. Esempio: AcetilSCoA sintetasi, trasforma acetato in acetil-CoA.

Legame tioestere tra SH e gruppo carbossilico.

CINETICA ENZIMATICA:

La velocità di una reazione come la formazione del prodotto nell’unità di tempo o come

consumo di substrato nell’unità di tempo (con prodotto meno errore di misura). La velocità

dipende da:

-concentrazione del substrato (più c’è substrato, più velocità);

-quantità di enzima (più enzimi, più velocità);

-temperatura (il massimo della velocità si ha a 37-40°C);

-pH (ottimale quello fisiologico 7,38, eccezione pepsina che lavora a pH molto basso. Con

valori estremi però gli enzimi si denaturano);

-meccanismi di regolazione;

-tempo (all’inizio retta, tempo e prodotti proporzionali, V0, quasi impossibile misurarla, lo

strumento deve detectare abbastanza prodotto. La curva poi si piega, diminuisce il

substrato. curva dovuta all’ingombro di prodotto creato, che può rallentare l’enzima,

occupando la tasca).

La cinetica enzimatica consente di ottenere informazioni sul meccanismo di azione degli

enzimi e sull’efficienza catalitica di un enzima.

DOSAGGIO ENZIMATICO:

Il dosaggio di attività enzimatiche è usato a scopo diagnostico, per discriminare forme

enzimatiche fisiologiche o patologiche e nella messa a punto dei dosaggi di substrati per

via enzimatica.

L’unità enzimatica U è la quantità di un enzima che trasforma 1mol di substrato in 1 min.

dosare la velocità degli enzimi può servire a scopo di ricerca per vedere se un enzima

funziona meglio di un altro o per capire se un l’enzima mutato presente in una determinata

malattia genetica funziona più o meno bene di quello nei pazienti sani; utilizzato anche per

capire in quali situazioni certi enzimi lavorano di più o di meno per vedere se bisogna

inibirli o attivarli per correggere la patologia. Un dosaggio enzimatico serve per dosare

l’enzima o il substrato, per vedere quanto enzima c’è o quanto è bravo. Se l’incognita è

l’efficienza o