Enzimologia

Coenzimi

Sono molecole organiche non proteiche. Sono essenziali per la funzione enzimatica e sono spesso derivati da vitamine. Se si associano in modo transitorio, sono co-substrati (NAD+; NADP+). NAD+ e NADP+ funzionano rispetto all'enzima come substrati, escono informa ridotta o viceversa ossidati. Il FAD invece è già presente nel sito attivo e funziona quindi come gruppo prostetico, legato in modo covalente al sito attivo. Catalizzano tutte reazioni di ossidoriduzione.

La forma ossidata e quella ridotta del NAD hanno una importante differenza quando guardate lo spettrofotometro: strumento che manda luce a diversa lunghezza d'onda. Se io guardo il NAD+ dentro a uno spettrofotometro, vedo che il massimo spettro di assorbimento è a 260 nanometri. L'assorbimento in uno spettro fotonico è proporzionale alla quantità di molecole che bloccano la luce. Quando la molecola è ridotta (NADH) il picco di assorbimento è diverso.

260 e assorbe anche alla lunghezza di 340 nm. Se io in laboratorio voglio dosare l'attività di un enzima che usa NAD+ e che lo trasforma in NADH, volendo seguire la trasformazione, metto lo spettro a 340. A 260 non mi accorgo se NAD+ è rimasto tale o è diventato NADH perché entrambi assorbono a questo valore. Utilizzate queste differenze di assorbimento tra NAD+ e NADH o NADP+ e NADPH per dosaggi enzimatici: se so che un certo enzima è causa di una malattia, lo doso per capire quanto tale enzima è presente nel sangue del mio paziente.

CLASSIFICAZIONE ENZIMI:

Gli enzimi sono denominati e classificati in base alle reazioni che catalizzano. Ci sono 6 classi divise in sottoclassi. Ad ogni enzima sono associate quattro cifre.

Le sei classi:

• Ossidoriduttasi: catalizzano reazioni di ossidoriduzione (reversibili). La maggior parte sono deidrogenasi. Il substrato rid incontra il coenzima ox, si formano prodotto ox e coenzima rid. Esempio: lattato/lattico deidrogenasi,

Ultima tappa della glicolisi anaerobia. Lattato viene ossidato in piruvato, il NAD+ viene ridotto a NADH. (Se ossido un alcol II ottengo un chetone, da un alcol I un'aldeide, poi acido carbossilico e poi CO2). Esempio: il succinato viene ossidato a fumarato, il FAD viene ridotto a FADH2. Altre ossidoreduttasi sono deidrogenasi, ossidasi, ossigenasi, reduttasi e catalasi.

Transferasi: catalizzano reazioni di trasferimento di gruppo. Molte richiedono la presenza di coenzimi. Esempio: le chinasi trasferiscono un P dall'ATP a una molecola accettore, come la glicogeno fosforilasi chinasi, fosforila un enzima, modifica post-traduzionale. Sono reversibili o meno a seconda del delta G di idrolisi. Solitamente irreversibili, ci sono tante molecole che accettano P ma poche che sono in grado di donarlo ad ADP (solo 3 molecole che raggiungerebbero una forma più stabile donando P). Esempio: transaminasi, trasferiscono gruppi amminici.

Idrolasi: catalizzano reazioni di idrolisi di legami.

La rottura di un legame per l'introduzione di una molecola d'acqua è una reazione irreversibile. Un esempio di questa reazione è l'enzima fosfatasi, che scinde il legame di esteri fosforici tramite l'inserimento di una molecola d'acqua. Altri esempi di enzimi che svolgono questa reazione sono esterasi, tiolasi, glicosidasi, peptidasi e proteasi.

Le liasi, invece, catalizzano reazioni di rottura non idrolitica e non ossidativa, eliminando gruppi per generare doppi legami. Queste reazioni sono reversibili e non richiedono mai consumo di energia. Un esempio di liasi è l'aldolasi, che scinde il fruttosio 1,6 bifosfato in G3P e DHAP. Un altro esempio è la fumarasi, che trasforma il fumarato in L-malato tramite l'aggiunta di acqua (non è una idrolasi perché la reazione è reversibile).

velocità); - temperatura (aumentando la temperatura, aumenta la velocità fino a un certo punto, dopodiché diminuisce); - pH (ogni enzima ha un pH ottimale in cui la sua attività è massima); - presenza di cofattori o coenzimi (alcuni enzimi richiedono la presenza di molecole aggiuntive per svolgere la loro funzione). La cinetica enzimatica può essere studiata attraverso l'analisi della velocità di reazione in funzione della concentrazione del substrato. Questo può essere rappresentato tramite una curva di Michaelis-Menten, che mostra come la velocità di reazione aumenta all'aumentare della concentrazione del substrato fino a raggiungere un plateau, indicando che l'enzima è satura di substrato. Inoltre, la cinetica enzimatica può essere descritta attraverso l'equazione di Michaelis-Menten, che permette di calcolare la velocità iniziale della reazione (V0) in funzione della concentrazione del substrato ([S]) e dei parametri cinetici come la costante di Michaelis (Km) e la velocità massima (Vmax). La conoscenza della cinetica enzimatica è fondamentale per comprendere il funzionamento degli enzimi e per studiare le loro interazioni con i substrati e i modulatori.velocità);-temperatura (il massimo della velocità si ha a 37-40°C);-pH (ottimale quello fisiologico 7,38, eccezione pepsina che lavora a pH molto basso. Con valori estremi però gli enzimi si denaturano);-meccanismi di regolazione;-tempo (all'inizio retta, tempo e prodotti proporzionali, V0, quasi impossibile misurarla, lo strumento deve detectare abbastanza prodotto. La curva poi si piega, diminuisce il substrato. curva dovuta all'ingombro di prodotto creato, che può rallentare l'enzima, occupando la tasca).La cinetica enzimatica consente di ottenere informazioni sul meccanismo di azione degli enzimi e sull'efficienza catalitica di un enzima.DOSAGGIO ENZIMATICO:Il dosaggio di attività enzimatiche è usato a scopo diagnostico, per discriminare forme enzimatiche fisiologiche o patologiche e nella messa a punto dei dosaggi di substrati per via enzimatica.L'unità enzimatica U è la quantità di unenzima che trasforma 1μmol di substrato in 1 min. Dosare la velocità degli enzimi può servire a scopo di ricerca per vedere se un enzima funziona meglio di un altro o per capire se un enzima mutato presente in una determinata malattia genetica funziona più o meno bene di quello nei pazienti sani; utilizzato anche per capire in quali situazioni certi enzimi lavorano di più o di meno per vedere se bisogna inibirli o attivarli per correggere la patologia. Un dosaggio enzimatico serve per dosare l'enzima o il substrato, per vedere quanto enzima c'è o quanto è bravo. Se l'incognita è l'efficienza o la quantità dell'enzima si misura quanto prodotto viene generato. Se l'incognita è la quantità di substrato si guarda quanto prodotto si genera. In ambito clinico standardizzato, ci si mette a 37°C e pH 7,4 con substrato in eccesso. EQUAZIONE DI MICHAELIS MENTEN: Equazione dellavelocità di una reazione a singolo substrato catalizzata da un enzima. Hanno definito l'andamento della velocità enzimatica e hanno individuato una costante Km. In ascissa abbiamo la concentrazione del substrato e in ordinata la velocità. All'aumentare di x la curva è un'iperbole. Questo è vero per gli enzimi monomerici e globulari. Questo grafico mostra la saturabilità di un enzima, a basse concentrazioni di substrato il prodotto aumenta linearmente e aumenta anche la velocità; poi c'è un massimo, quando tutti gli enzimi presenti hanno i siti attivi occupati. Si raggiunge la saturazione massima e l'iperbole tende ad un asintoto orizzontale, definito come velocità max. Si può definire una velocità massima in ogni sistema. Km è individuata sull'asse delle ascisse, è la concentrazione di substrato alla quale il sistema procede con una V pari a metà della Vmax. Valeper tutti gli enzimi con andamento iperbolico nella relazione V e [M], tranne per gli allosterici.
Km è una concentrazione di substrato che dà un'idea dell'affinità che l'enzima ha per il suo substrato, varia tra i diversi enzimi e per i diversi substrati dello stesso enzima.
A cosa serve determinare Km? E1 e E2 sono due enzimi che catalizzano la stessa reazione.
Km2 > Km1, quindi vuol dire che E1 riconosce il substrato anche a concentrazioni basse, ha maggiore affinità per il substrato rispetto a E2. Km è indice dell'affinità che un enzima ha per il suo substrato.
Esochinasi Hk e glucochinasi Gk intervengono nella prima tappa della glicolisi. Sono enzimi in grado di trasferire un fosfato dall'ATP al glucosio. La fosforilazione del glucosio permette di abbattere la sua concentrazione intracellulare, così che il glucosio continui ad entrare dentro le cellule seguendo il gradiente di concentrazione. La glucochinasi si

trova solo nelle cellule del fegato, mentre l'esochinasi si trova in tutte le nostre cellule. Hk riconosce a basse concentrazioni il substrato, quindi il fegato è un organo "generoso", perché lascia che si servano prima gli altri tessuti. La Km ci può aiutare a confrontare diverse isoforme (diversi enzimi che catalizzano la stessa reazione). Utile anche per capire che via prenderà il substrato, in base alla sua concentrazione è più facile che prenda una via piuttosto che un'altra. Un altro parametro è Kcat numero di turnover, è il numero di molecole convertite in prodotto nell'unità di tempo da una molecola di enzima saturo. Uno dei più efficienti è la catalasi.

EQUAZIONE DI LINEWEAVER- BURK: L'iperbole di MIchaelis Menten ha un errore del 10%. Lineweaver e Burk hanno modificato quindi il modo di presentare i dati. Prendiamo dei tubicini nei quali si mette una quantità uguale

1. di enzima esi aggiunge substrato a diverse concentrazioni. Ad un certo tempo si prendono aliquote dei varitubicini e si misura la quantità di prodotto per ottenere la velocità. I risultati ottenuti vengonoelaborati in un grafico da un software, che dà più o meno un’iperbole.
2. Lineweaver e Burk hanno costruito il grafico dei doppi reciproci, per ottenere Vmax e Km piùprecisi. Il punto in cui la retta interseca l’asse delle x è il reciproco di Km, mentre il punto in cuiinterseca le y è il reciproco di Vmax. I valori non vengono comunque molto diversi da quellidell’iperbole.
3. Il grafico dei doppi reciproci è usato in laboratorio per tre motivi:
   • Determinare con più precisione Vmax e Km;
   • Analizzare il meccanismo di una reazione;
   • Determinare il meccanismo di inibizione.
4. Il grafico dei doppi reciproci può determinare, in una reazione a due substrati, se avvienela formazione di un complesso ternario o

un meccanismo ping pong. Dobbiamo creare un grafico dei doppi recip