Enzimologia alimentare

Francesca Nasatti

Enzimologia Alimentare

GLI ENZIMI

Non è scontato che gli enzimi siano solo proteine: sono state identificate molecole di

RNA con proprietà catalitiche che si trovano nel ribosoma e partecipano alla catalisi

che avviene nella traduzione. Per differenziare queste molecole di RNA dagli enzimi

proteici vengono chiamati ribozimi.

Gli enzimi sono, invece, proteine con attività catalitica.

SPONTANEITA' DELLE REAZIONI CHIMICHE

All'equilibrio, la velocità con la quale i reagenti diventano prodotti è uguale a quella

con cui i prodotti tornano ad essere reagenti: la reazione procede nei due versi con

la stessa velocità.

La variazione di energia libera rappresenta la differenza di stato energetico (energia

libera) tra prodotti e reagenti.

Se deltaG è negativo, i prodotti hanno un livello energetico più basso dei reagenti. I

reagenti si trasformano in prodotti perché i sistemi tendono al minimo energetico.

Nei sistemi biologici si usa delta G' e deltaGzero' perché essi sono sistemi tamponati,

in cui il pH è costante. Nelle reazioni in questi sistemi sono spesso coinvolti gli ioni

H+ (è un reagente o un prodotto della reazione). Però, essendo un sistema

tamponato, la concentrazione di H+ viene ritenuta costante e uguale a 7.

Le concentrazioni di reagenti e prodotto sono relative alle condizioni iniziali.

L'altezza dell'energia di attivazione determina la velocità della reazione.

Specifica attivazione

Reazione spontanea.

L'enzima si lega al substrato formando il complesso ES.

Il substrato, mentre è legato all'enzima, diventa prodotto. (EP).

Il prodotto si dissocia dall'enzima.

Ciascuno di questi step ha una energia di attivazione da superare affinchè avvenga il

processo.

L'altezza complessiva delle energie di attivazione che si hanno in presenza

dell'enzima è molto più bassa di quella che si avrebbe in assenza dell'enzima.

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Il deltaG della reazione (la sua spontaneità, la termodinamica, la costante di

equilibrio) non cambia con o senza l'enzima. Esso rende la reazione più veloce

abbassando la sua energia di attivazione.

Specificità di posizione di reazione: se in una reazione enzimatica si forma una

molecola chirale, si forma solo uno dei due possibili isomeri.

Cofattori: gruppi prostetici o coenzimi

La costante di equilibrio varia con la temperatura.

Il saggio enzimatico è una misura finalizzata a quantificare l'attività di un enzima.

Aspetti cinetici

La concentrazione del reagente non è costante nel tempo perché il reagente si

trasforma in prodotto.

La velocità cambia in funzione della concentrazione del reagente. Di solito si

considera la concentrazione iniziale perché la conosciamo sicuramente (abbiamo

messo noi il reagente nella provetta), non si è ancora formato prodotto.

La velocità è data dalla pendenza della tangente alla curva stessa.

Si misura la velocità iniziale, prima che ci siano variazioni apprezzabili dalla linearità:

inizialmente, il grafico della quantità di prodotto in funzione del tempo sembra una

retta, perché all'inizio la velocità con la quale si forma il prodotto è praticamente

costante (anche se sta diminuendo la concentrazione di substrato: non è rilevante

perché siamo in eccesso di substrato). Si arriva poi ad un massimo in cui la

concentrazione di prodotto non aumenta ulteriormente.

La formazione di prodotto nel tempo o la diminuzione di substrato nel tempo sono

due grandezze correlate.

Fare un saggio enzimatico significa misurare la velocità iniziale di una reazione in

presenza di un enzima. Si misura l'attività enzimatica di un enzima.

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Saggi calorimetrici: le reazioni chimiche (in cui c'è una variazione di energia libera)

sono esotermiche o endotermiche, cioè associato alla trasformazione substrato-

prodotto c'è un flusso di calore dal sistema o verso il sistema. Mediante la

calorimetria si può studiare questo flusso, che è proporzionale alla velocità di

reazione.

Saggi mediante pH-stat: la variabile che si misura per monitorare la reazione è il pH,

che varia, nel mezzo di reazione, in seguito alla formazione di prodotto o alla

scomparsa di substrato.

Due modi per poter eseguire i saggi enzimatici: mediante misure continue o

discontinue.

Misure continue: la formazione del prodotto viene misurata in tempo reale. Con

queste misure è facile misurare la velocità enzimatica perché basta guardare la

tangente al punto iniziale della curva (come prima).

-I substrati naturali o sintetici usati in queste misure hanno una caratteristica:

devono formare un prodotto che ha caratteristiche spettroscopiche diverse dal

substrato di partenza. Ciò significa che il prodotto assorbe la luce ad una lunghezza

d'onda a cui il substrato non l'assorbe (il prodotto ha un colore differente dal

substrato).

Queste differenze di colore sono monitorabili attraverso uno spettrofotometro.

Esempio: substrato sintetico utilizzato per fare i saggi di attività su una proteasi, la

tripsina (idrolizza il legame peptidico vicino agli aa basici).

Si potrebbe quindi fare avvenire la reazione sul substrato naturale; però, sul

substrato naturale non si può monitorare la reazione in continuo, perché

quest'ultimo è una proteina che, dopo idrolisi, diventa un peptide, quindi ha le

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stesse caratteristiche spettroscopiche del substrato iniziale (con lo spettrofotometro

non si noterebbe nessuna differenza).

Per sviare questo problema sono stati creati substrati sintetici specifici per queste

proteasi. Essi sono creati in laboratorio.

Uno di questi è il BAPA, che contiene l'arginina (aa basico). Legato all'arginina

tramite un legame ammidico c'è la para-nitroanilide: la tripsina idrolizza questo

legame.

La p-nitroanilina, staccata dal substrato, è colorata di giallo perché assorbe la luce a

405 nm.

--> utile perché permette di monitorare in modo continuo in uno spettrofotometro

l'aumento di assorbanza dovuto alla formazione del prodotto.

Di questo prodotto si conosce il coefficiente di estinzione molare (tabulato), quindi

dalla assorbanza si può risalire alla concentrazione del prodotto e poi all'unità di

attività.

Si divide l'aumento di assorbanza per il coefficiente di estinzione molare del

prodotto (legge di Lambert-Beer) per conoscere la molarità del prodotto in cuvetta

dopo un minuto.

Per passare dalla molarità alle moli moltiplico per il volume. Così ho calcolato

quante moli si formano in un minuto.

Per passare a micromoli moltiplico per un milione.

-Per una serie di enzimi, l'attività enzimatica può venire misurata sfruttando la

variazione di pH.

Titolatore automatico: nel bicchierino si mette la soluzione in analisi. Un elettrodo

misura il pH. La velocità con la quale viene aggiunta la base nel bicchierino per

mantenere costante il pH equivale alla velocità con la quale si ha la formazione di

prodotto nel tempo.

Elettrodo di Clark: sfrutta il fatto che l'ossigeno, a contatto con un catodo di platino,

si riduce, assorbendo elettroni. Questa riduzione di elettroni nell'ambiente provoca

un flusso di corrente sull'elettrodo. Questo metodo serve a misurare la

concentrazione di ossigeno in soluzione (quando è più concentrato si genera un

flusso di elettroni maggiore).

 Reazione accoppiata: si fa in modo che lo step più lento sia quello dell'enzima

che si vuole quantificare. Si mettono, quindi, gli altri enzimi in quantità

sufficienti. Inoltre, tutti gli enzimi presenti devono avere lo stesso ottimo di pH e di

temperatura perché i passaggi accoppiati avvengono in contemporanea.

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Misure discontinue: non si può misurare in continuo quanto prodotto si forma. La

reazione viene fatta procedere per un certo tempi e dopo questo tempo si misura

quanto prodotto si è formato.

Se so quanto prodotto si è formato nella variazione di tempo, si può calcolare la

velocità alla quale ha proceduto la reazione.

Si utilizza spesso per gli enzimi proteolitici perché:

-il BAPA è specifico per la tripsina

-Quando si vogliono quantificare le proteasi presenti in un alimento, non si sa che

tipo di proteasi è presente, quindi non c'è modo di scegliere il substrato sintetico più

appropriato per quella proteasi.

Per fare una misura complessiva, generica di tutte le proteasi presenti in un certo

prodotto si ricorre a dei saggi enzimatici in cui il substrato sia una vera proteina:

quasi sicuramente, qualsiasi proteasi presente nel prodotto riuscirà ad idrolizzarla.

Acido tricloroacetico: TCA

Le proteine assorbono a 280 nm

Enzimi cooperativi (o allosterici) e non cooperativi

Questa differenza si capisce osservando il grafico che descrive la velocità della

reazione in funzione della concentrazione di substrato.

Gli enzimi non cooperativi sono descritti da una curva iperbolica: la velocità

aumenta al crescere di [S] tendendo asintoticamente a un valore massimo (vmax).

Per gli enzimi cooperativi (o allosterici), la curva ha andamento asigmoidale:

all'inizio, aumentando [S], v aumenta poco; successivamente, la v tende ad

aumentare di più all'aumentare di [S], tendendo ad un valore massimo (vmax).

EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

L'equazione di Michaelis-Menten descrive gli enzimi non cooperativi.

ES è l'unico complesso cataliticamente competente: il substrato si trasforma in

prodotto solo quando è legato all'enzima nel complesso ES.

La dissociazione del prodotto ha costante di equilibrio molto grande: la [EP] tende a

zero, ossia appena il substrato si converte in prodotto, viene dissociato a dare

l'enzima più il prodotto libero. 5

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La reazione che da E+P è irreversibile: in realtà sappiamo che l'enzima non decide il

verso della reazione. Si può fare questa assunzione perché si considera la velocità

iniziale della reazione: non è ancora presente il P e siamo lontani dall'equilibrio

chimico.

Il turnover number dà un'idea dell'efficienza catalitica massima di un enzima

Lo stato pre-stazionario dura pochissimo tempo, non ci si accorge neanche della sua

presenza.

Lo stato stazionario può durare secondi, minuti o ore, dipende dalla concentrazione

delle specie. È quello che si studia.

V=k[ES]

Le due reazioni che fanno consumare il complesso ES sono quella che lo riporta a

dare E+S e quella che lo porta a dare E+P.

C'è una proporzionalità diretta tra la velocità di reazione e la concentrazione totale

di enzima.

Maggiore è la quantità di enzima presente, maggiore è la vmax a cui si tende. La km

non varia perché l'enzima è lo stesso.

La dipendenza della velocità da km è importante in condizioni fisiologiche: la

reazione catalizzata da alcuni enzimi accelera o diminuisce in funzione della

concentrazione di substrato presente. Questo può avvenire solo quando la

concentrazione di substrato ha valori inferiori o uguali alla km.

È meno importante quando gli enzimi sono usati in processi produttivi: si utilizza il

substrato a concentrazioni molto elevate, più grandi di km, si lavora praticamente

sul ramo orizzontale della curva di M-M. a queste concentrazioni non ci interessa la

km dell'enzima perché si lavora a velocità prossime alla vmax.

A basse concentrazioni di substrato l'enzima blu è più efficiente di quello giallo

(velocità maggiore), mentre ad alte concentrazioni di substrato l'enzima giallo è più

efficiente di quello blu.

LINEARIZZAZIONE DELLE MISURE DI ATTIVITA'-METODO DEI DOPPI RECIPROCI

In questo metodo l'equazione di M-M è riscritta come nella slide.

È chiamato dei doppi reciproci perché i due parametri importanti (v e [S]) sono

presenti come reciproci di loro stessi. 6

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La cosa importante è che si stratta dell'equazione di una retta.

Il modello di M-M permette di calcolare l'effetto degli inibitori.

Inibitore competitivo: è simile al substrato e si lega nel sito attivo al posto di esso

Inibitore non competitivo: si lega all'enzima in un punto diverso dal substrato

Inibitori acompetitivi (uncompetitive)

Il grafico dei doppi reciproci permette di individuare con che inibitore si ha a che

fare.

EFFETTO DEL PH SULLA CATALISI ENZIMATICA

Le curve sono spostate a dx o sx in funzione del pK del singolo gruppo funzionale

(carbossilico o amminico).

L'ottimo di pH è il pH al quale ogni enzima ha i gruppi funzionali della catena

proteica che hanno il giusto grado di protonazione o dissociazione.

Quando ci si allontana dall'ottimo di pH, ad esempio alzando il pH, si ottiene che

qualche gruppo funzionale si potrà dissociare, potrebbe quindi cambiare la sua

carica.

--> questo può avere sia un effetto sulla struttura proteica (il cambio di carica

potrebbe fare variare i legami elettrostatici, quindi influenzare l'attività dell'enzima);

ma se il gruppo che cambia carica appartiene al sito attivo, potrebbe cambiare la sua

capacità di legare il substrato o di catalizzare la reazione.

La curva a campana riflette questo concetto.

EFFETTO DELLA TEMPERATURA SULLA CATALISI ENZIMATICA

Tutte le reazioni aumentano la loro velocità all'aumentare della T.

Oltre l'ottimo di temperatura l'enzima si denatura: si perde quindi l'attività catalitica

(perché perde la sua struttura nativa) e la reazione rallenta.

STABILITA' DEGLI ENZIMI

Denaturanti fisici

 Radiazioni ionizzanti: molto utilizzate per trattare i prodotti alimentari.

Si utilizzano i raggi gamma perché hanno ottime capacità penetranti negli

alimenti, quindi agiscono anche in profondità.

I radicali che si formano possono reagire chimicamente con gli enzimi, quindi

provocare modificazioni sui gruppi funzionali della proteina, che ne modificano

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la funzionalità --> possono denaturare le proteine. (processo che serve anche

per sterilizzare alimenti)

Usati per inattivare microrganismi.

 Shear forces

 Temperatura: c'è un abbassamento di deltaG anche quando la T si abbassa.

La Td (cold), ovvero la T di denaturazione fredda, è la T al di sotto della quale il

deltaG è negativo, ossia al di sotto della quale la proteina è più stabile in forma

denaturata. Tuttavia, la denaturazione a basse T è molto lenta.

 Pressione: pressioni molto alte o molto basse possono avere effetto

denaturante

Denaturanti chimici o chimico-fisici

 pH/caotropi : modificando le interazioni ioniche tra amminoacidi di segno

opposto che si trovano anche all'interno della proteina, viene destabilizzata la

struttura proteica --> la proteina si denatura.

Quando il pH induce una denaturazione, l'effetto è irreversibile.

Quando, invece, l'effetto è solo sulla protonazione di gruppi funzionali ma la

proteina non è denaturata, basta ripristinare il giusto pH per avere nuovamente

piena funzionaltà dell'enzima.

I caotropi sono sostanze in grado di destabilizzare le proteine. La loro azione è

spiegata nella serie di Hofmeister.

Ci sono alcuni ioni che, per la loro struttura chimica, sono in grado di

stabilizzare o destabilizzare la struttura proteica.

La serie di Hofmeister descrive gli ioni, diversi dai caotropi come l'urea, la cui

azione è dovuta alla capacità di legare l'acqua.

 Solventi immiscibili: la fase idrofobica è separata dalla fase idrofilica in modo

netto. La proteina si può denaturare all'interfaccia delle due fasi.

Modalità per stabilizzare un enzima

 Rimozione acqua: aggiunta di Sali cosmotropi, ossia che aumentano la

stabilità della struttura proteica. Molto spesso, questi Sali vengono utilizzati

insieme alla liofilizzazione. Il sale rimane legato alla proteina liofilizzata e la

proteggono durante il processo. 8

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 Interventi sulla proteina: aggiungendo substrato o inibitori competitivi si

creano legami con il sito attivo, quindi si crea, localmente, una struttura più

stabile. Questa stabilizzazione conformazionale si trasmette a tutta la

proteina

IMMOBILIZZAZIONE DI ENZIMI

Soprattutto per gli enzimi con alto valore economico, che difficilmente vengono

aggiunti in un prodotto come enzima da perdere si ricorre all'immobilizzazione per

poterli applicare al giusto contesto.

Molte volte, l'enzi