Enzimi e cinetica enzimatica

Enzimi

Ad eccezione di un piccolo gruppo di molecole di RNA con funzione catalitica, tutti gli enzimi sono proteine. Hanno la funzione di catalizzare reazioni chimiche; un catalizzatore è una sostanza che partecipa a una reazione velocizzandola e alla fine della reazione ritorna nel suo stato iniziale, pronto per un nuovo ciclo catalitico. Il nome "enzima" viene dal greco en zymos (nel lievito) poiché furono identificati inizialmente nel lievito.

La loro attività catalitica dipende dall'integrità della loro conformazione proteica nativa; la struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria sono essenziali per l'espressione dell'attività catalitica (vedi esperimento Anfinsen). Nella maggior parte dei casi, le proteine con funzione enzimatica sono specifiche per una sola reazione, in quanto sono in grado di riconoscere un solo substrato (o, al massimo, un substrato molto simile).

Condizioni di reazione

Gli enzimi operano a condizioni di pH e temperatura blandi, fisiologici, al contrario dei catalizzatori chimici in cui le reazioni possono essere condotte a temperature molto elevate o in condizioni di pH molto estremi. Molti enzimi lavorano in compartimenti cellulari specifici, ad esempio alcuni operano solo all'interno dei lisosomi mentre altri solo all'interno del citoplasma o dei mitocondri. Enzimi che svolgono la stessa funzione ma che sono compartimentati in distretti diversi della cellula o che sono espressi in tessuti diversi dell'organismo sono detti isoenzimi.

Cofattori ed oloenzima

Alcuni enzimi, per svolgere la propria funzione, necessitano di componenti chimici addizionali detti cofattori. Un cofattore può essere costituito da uno o più ioni inorganici legati covalentemente, e in tal caso è detto gruppo prostetico, oppure da complesse molecole organiche o metallorganiche chiamate coenzimi. Un enzima cataliticamente attivo con tutti i suoi coenzimi o ioni metallici è detto oloenzima, mentre la parte proteica di un enzima, senza coenzima, è detta apoproteina o apoenzima. Molti cofattori provengono dalle vitamine, ovvero da sostanze che vengono assunte dalla dieta o prodotte dalla flora batterica intestinale e che il nostro organismo modifica per poterle rendere adatte al ruolo di cofattori.

Sistema di classificazione

La quantità di enzimi attualmente scoperti è talmente vasta da richiedere un preciso sistema di nomenclatura e classificazione. Ogni enzima ha un numero di classificazione a quattro cifre e un nome sistematico che identifica la reazione catalizzata.

• La prima cifra indica il nome della classe. Le classi possibili sono 6.
• La seconda cifra indica la sottoclasse (gruppo donato).
• La terza cifra indica la sottosottoclasse (tipo di accettore).
• La quarta cifra è un numero specifico assegnato a ciascun determinato enzima nella sua sottosottoclasse di appartenenza.

Energia di attivazione e coordinate di reazione

Convenzione importante: Per descrivere la variazione di energia libera della reazione, i chimici hanno definito un gruppo di condizioni standard (temperatura 298 K, pressione 1 atm, concentrazione 1 M). A queste condizioni, la variazione di energia libera è indicata come deltaG°, variazione di energia libera standard. Poiché nei sistemi biologici la concentrazione degli ioni H+ è molto distante da 1M, i biochimici hanno definito la variazione di energia standard biochimica, indicata con deltaG'°, cioè la variazione di energia libera standard a pH 7.

Un catalizzatore aumenta la velocità della reazione abbassando l'energia di attivazione. La funzione di un catalizzatore è quella di aumentare la velocità di una reazione; i catalizzatori non modificano gli equilibri delle reazioni. L’aumento della velocità di una reazione in presenza di un enzima può variare da 5 a 17 ordini di grandezza.

Il grafico della coordinata di reazione analizza le variazioni di energia libera che avvengono nel corso della reazione. Il punto di partenza per una reazione è definito stato basale e corrisponde al contributo di energia libera fornito al sistema da una molecola in determinate condizioni. L’equilibrio tra S (substrato) e P (prodotto) dipende dalla differenza tra i livelli di energia libera dei due composti ai loro stati basali. Se l’energia libera dello stato P è minore rispetto a quella dello stato S, il deltaG'° della reazione è negativo (la reazione è esoergonica) e all’equilibrio c’è più P che S (l’equilibrio favorisce P). Questo equilibrio non viene modificato da un catalizzatore.

Se un equilibrio è favorevole non significa però che la velocità della conversione di S in P sia elevata, in quanto la velocità dipende da un parametro diverso. Tra S e P esiste una barriera energetica che corrisponde all’energia libera necessaria a produrre le trasformazioni necessarie per passare da uno stato all’altro. Perché possa avvenire la reazione le molecole devono superare questa barriera e quindi devono raggiungere un livello energetico più alto di quello basale. Al punto più alto della curva, la molecola ha la stessa probabilità di decadere verso S o verso P; questo punto è detto stato di transizione e non corrisponde a una specie chimica con una stabilità significativa, non è un intermedio di reazione.

Stato di transizione e energia di attivazione

Lo stato di transizione è una forma di substrato che per un breve periodo di tempo si viene a trovare in cima alla curva energetica. La quantità di energia libera necessaria a raggiungere lo stato di transizione è detta energia di attivazione (deltaG ). La velocità di una reazione dipende dall’energia di attivazione; un’elevata energia di attivazione corrisponde a una bassa velocità di reazione.

In conclusione, tutte le reazioni chimiche hanno una barriera energetica che separa i substrati dai prodotti. L’energia di attivazione può essere abbassata aggiungendo un catalizzatore, ciò permette di velocizzare la reazione e di giungere all’equilibrio più rapidamente, SENZA MODIFICARLO.

Questa proprietà degli enzimi di abbassare così tanto l’energia di attivazione è spiegata grazie alla formazione di un complesso tra l’enzima ed il substrato.

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

ES ed EP sono complessi transitori (l’unione è momentanea e reversibile) tra enzima e substrato e tra enzima e prodotto. All’interno della proteina enzimatica, il substrato diventa prodotto, rimane momentaneamente legato all’enzima e poi viene liberato; l’enzima si ritrova allo stato iniziale poiché non viene consumato dalla reazione.

Sito attivo e cinetica enzimatica

Una delle caratteristiche principali delle reazioni catalizzate dagli enzimi è proprio quella di avvenire all’interno dei confini di una tasca dell’enzima detta sito attivo. La molecola che si lega al sito attivo e su cui l’enzima agisce è detta substrato. La formazione del complesso enzima-substrato è fondamentale per la catalisi ed è anche il punto di partenza per l’elaborazione matematica della cinetica enzimatica.

La formazione del complesso enzima-substrato è permessa grazie alla complementarietà di due parametri tra enzima e substrato:

• Complementarietà di forma, in quanto vi è una fessura sulla superficie dell’enzima che si giustappone alla geometria del substrato.
• Complementarietà elettronica, che permette la formazione di legami deboli (e in pochi casi la formazione di legami covalenti).

Il potere catalitico e la specificità degli enzimi derivano dall’energia libera rilasciata durante la formazione di legami covalenti e interazioni deboli che si instaurano transitoriamente tra il substrato e l’enzima nel sito attivo. In condizioni biologiche, senza catalisi, il substrato deve acquisire una grande quantità di energia per arrivare allo stato di transizione, prima di diventare prodotto; grazie alla formazione del complesso enzima-substrato l’energia libera da acquisire per giungere alla formazione di un prodotto è molto minore.

Questo perché la formazione di ciascun legame tra substrato e enzima è accompagnata dalla liberazione di una piccola quantità di energia libera, da cui dipende il grado di stabilità dell’interazione; più il complesso è stabile minore è il suo livello di energia libera. L’energia che si libera delle interazioni enzima-substrato viene detta energia di legame (deltaG ). L’energia di legame è la fonte principale di energia libera usata dall’enzima per abbassare l’energia di attivazione della reazione.

Esempio di catalisi enzimatica

Consideriamo una reazione immaginaria: la rottura di una barretta di metallo. Per rompere la barretta, formando due prodotti, è necessaria energia. Esaminiamo due ipotetici enzimi in grado di catalizzare la reazione, entrambi usano forze magnetiche al posto dell’energia di legame degli enzimi reali:

• Enzima complementare al substrato: Il suo sito attivo è una tasca rivestita di magneti. Perché possa reagire (rompersi), la barretta deve raggiungere lo stato di transizione della reazione. La barretta si adatta così bene al sito attivo che non può piegarsi, in quanto il movimento di piegatura eliminerebbe parte delle interazioni coi magneti. Un enzima di questo genere impedisce che avvenga la reazione, in quanto si ha una stabilizzazione del substrato.
• Enzima complementare allo stato di transizione: Le interazioni tra enzima e substrato diventano ottimali solo quando il substrato raggiunge lo stato di transizione. Il substrato legato deve andare incontro a un aumento della sua energia libera, necessario per raggiungere lo stato di transizione. Ora, però, l’aumento necessario per piegare la barretta e portarla in uno stato prossimo alla rottura, viene “pagato” dalle interazioni magnetiche che si formano tra l’enzima e il substrato nello stato di transizione. Molte di queste interazioni coinvolgono parti della barretta distanti dal punto della rottura; quindi le interazioni tra enzima e le parti non reattive della barretta forniscono l’energia utilizzata poi per la catalisi della rottura della barretta stessa. Questo “pagamento energetico” abbassa considerevolmente l’energia di attivazione e rende la reazione più veloce.

Le interazioni deboli di legame tra l’enzima ed il substrato rappresentano la principale forza trainante della catalisi. La complementarietà dell’enzima allo stato di transizione del substrato (“adattamento indotto”) fu ipotizzata da Linus Pauling, superando l’ipotesi “chiave-serratura” di Emil Fisher che prevedeva una complementarietà tra enzima e substrato. Un esempio di adattamento indotto è la reazione catalizzata dall’esochinasi. Essa catalizza la reazione tra il glucosio e l’ATP in presenza di magnesio che porta alla formazione di glucosio-6-fosfato e ADP.

Fattori fisici e termodinamici

Fattori fisici e termodinamici che contribuiscono a determinare l’energia libera di attivazione:

• Riduzione dell’entropia: diminuzione della libertà di movimento delle molecole in soluzione (l’entropia rappresenta il disordine del sistema).
• Desolvatazione: Il substrato che si trova in soluzione all’interno di un determinato mezzo, ad esempio il citoplasma, perde l’acqua di idratazione e si incontra con una regione (dominio) dell’enzima.
• Corretto allineamento tra i gruppi funzionali catalitici dell’enzima: adattamento indotto (sito attivo complementare allo stato di transizione).

Meccanismi di catalisi enzimatica

In conclusione:

• Gli enzimi portano a giustapporsi substrato-sito catalitico o substrato-substrato.
• Gli enzimi si legano al substrato nell’orientamento corretto (lungo la direzione di legame), lo posizionano correttamente perché questo possa trasformarsi in prodotto.
• La distribuzione della carica del sito attivo può guidare un substrato polare (catalisi elettrostatica).
• Gli enzimi bloccano i movimenti traslazionali e rotazionali del substrato quando formano un complesso con lo stato di transizione.

I meccanismi che attuano gli enzimi per la catalisi sono 3:

• Catalisi acido-base: enzima impegna residui che possono agire come acido o base e aiutare il substrato a trasformarsi. Quindi i residui che entrano maggiormente in gioco saranno quelli in grado di donare/accettare protoni.
• Catalisi covalente: l’enzima coi suoi residui può instaurare un legame covalente transitorio che aiuta il substrato a trasformarsi nel prodotto. Anche in questo meccanismo agiscono gli stessi amminoacidi che permettono la catalisi acido-base ma in questo caso funzionano andando a determinare un attacco nucleofilo su precise regioni del substrato. L’attacco nucleofilo, solitamente, può essere eseguito solamente da quegli amminoacidi che sono sufficientemente basici e cioè possiedono un doppietto elettronico che permette il meccanismo di connessione col substrato. Inoltre, i nucleofili devono essere anche dei buoni gruppi uscenti poiché una volta legati devono ....