Enzimi e cinetica enzimatica, Biochimica

PROSTETICO

“Una proteina complessa senza cofattore non fa

avvenire la reazione o la fa avvenire piu

difficilmente.”

Enzimi specifici per reazioni

Ossidoreduttasi trasferimento di elettroni



1. Transferasi trasferimento di gruppi (nome cambia in base al gruppo)



2. Idrolasi idrolisi di legami



3. Liasi addizione di gruppi a doppi legami o a risonanze di gruppi formati da doppi



4. legami

Isomerasi

5. trasferimento di gruppi all’interno della stessa molecola con formazione di



isomeri

Ligasi formazione di legami per condensazione



6. Nomenclatura degli enzimi

Gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi

Suffisso “ASI”

(1) Nome del substrato Tipo di reazione

catalizzata

(in questo caso

ossidoriduzione)

Se è presente si aggiunge anche il coenzima *

Complesso ENZIMA-SUBSTRATO

E + S ES



Le interazioni tra le due molecole coinvolgono una zona detta “ SITO ATTIVO”

,composto da circa 10 a.a. che vanno a formare il sito di legame per il substrato e il

sito catalitico per la trasformazione chimica del substrato. Questi due siti possono

essere lo stesso sito o essere vicini.

In passato si pensava che l’enzima e il suo substrato dovessero essere

perfettamente complementari (interazione CHIAVE-SERRATURA) invece con gli

studi si è scoperto che non devono per forza essere “perfettamente

complementari”, poiche questa concezione da un senso di staticità delle molecole

(cosa fisiologicamente impossibile). Quindi è nata un’altra teoria ,che sostituisce

quella CHIAVE –SERRATURA , che è la teoria dell ‘ADATTAMENTO INDOTTO.

Questa teoria nasce dal fatto che si è vista l’interazione di alcuni enzimi con dei

substrati e si e visto come sia il substrato, ma anche l’enzima si adattassero tra

loro ,per interagire nel modo migliore e produrre il prodotto finale. Di solito è

l’enzima a cambiare di poco la sua forma per adattarsi al substrato (in modo

reversibile), invece si è visto che anche il substrato si adatta all’enzima, tipo

esponendo meglio i gruppi R e queste variazioni sono irreversibili e permanenti

,tante è che è cosi che si inizia a ottenere la formazione del prodotto

Reazioni chimiche

Stato fondamentale : REAGENTI

 Stato di transizione: specie chimiche con legami non completamente

 formati

Intermedi: specie chimiche con legami completamente formati

 Prodotti



Lo stato di transizione è uno stadio intermedio tra la struttura del substrato e

quella dei prodotti e le migliori interazioni enzima-substrato si verificano

proprio in questo stadio.

Cinetica enzimatica

È lo studio della velocità delle reazioni enzimatiche tenendo conto della:

[concentrazione variabile di substrato] : quanto prodotto si forma in un unità di

 tempo a seconda della quantità di substrato. (quota enzima fissa)

[temperature] : reazione a che temperatura avviene meglio (cellule sempre uguale)

 [Ph] : quasi sempre costante

 [presenza di attivatori o inibitori]



Quindi noi possiamo velocizzare o bloccare una reazione modificando i seguenti

parametri di una reazione (scopo dei farmaci)

Cinetica di Michaelis-Menten

La cinetica di Michaelis-Menten descrive l'andamento della velocità di una reazione

 catalizzata da enzimi, al variare della

concentrazione del substrato e dell'enzima. Questo modello, valido per enzimi non

allosterici, fu proposto da Michaelis e Menten nel 1913.

Inibitori ed induttori enzimatici sono sostanze in grado di alterare la cinetica enzimatica.

Il modello cinetico spiega come all'aumentare anche di poco della concentrazione del

 substrato disponibile all'enzima, la velocità della reazione aumenti vertiginosamente fino al

raggiungimento di un massimo, chiamato Vmax. In questo punto la reazione ha raggiunto

la velocità massima possibile semplicemente perché è presente tanto substrato da

saturare tutto l'enzima presente in

soluzione, perciò un'ulteriore aggiunta di substrato non servirebbe in quanto non verrebbe più

L'enzima libero, indicato dalla lettera maiuscola E, reagisce dapprima con il substrato S

 dando il

complesso enzima-substrato, ES, il quale si scomporrà originando il prodotto della reazione en

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

Enzima Enzima legato

forma libera Secondo livello

 Terzo livello

 Quarto livello

 Quinto livello



Reazione veloce di legame Reazione lenta (stadio limitante

enzima-substrato, che puo la velocità)

avvenire in un senso e

nell’altro.

1. [sub] bassa E libero (enzima man mano si lega al sub, quindi la velocità



dipende dal substrato.

[sub] alta E legato (enzima è tutto legato al substrato e quindi la velocità



dipende da complesso enzima substrato. Riportando su un

diagramma cartesiano l'andamento della velocità

Grafico ramo di iperbole.

Risultano di ovvia deduzione le seguenti

lic per modificare gli stili del testo dello schema

considerazioni:

condo livello • a basse concentrazioni di substrato la

reazione è praticamente del primo

o livello Enzima saturato ordine, crescendo la velocità proporzionalmen

Quarto livello • ad alte concentrazioni di substrato la

Quinto livello

 velocità tende ad assume un valore

massimo che diviene costante. Ciò è

dovuto alla completa saturazione

dell'enzima che annulla l'effetto dovuto

all'ulteriore aumento della

concentrazione di substrato (non è

presente più enzima disponibile). Una

tale cinetica di reazione è di ordine zero

e in questo caso risulta Vmax = K2 [E]0.

Aumentando la concentrazione di substrato

si ha un aumento della velocità ma non

proporzionale. Solo in quantità basse di

substrato la velocità cresce in modo

proporzionale.

Equazione di michaelis e mentin

are clic per modificare gli stili del testo dello schema

La velocità in qualsiasi momento è

Secondo livello uguale alla velocità max per il

substrato, diviso Km + substrato.

Terzo livello

Quarto livello

 Quinto livello



Costante di michaelis e mentin

La costante di Michaelis-Menten, KM

, rappresenta la concentrazione di substrato necessaria affinché la reazione abbia velocità pari a metà d

Essa equivale al seguente rapporto: K di dissociazione

ES

K di associazione

ES

La costante di Michaelis-Menten è una grandezza caratteristica di ciascun enzima. Essa è un

termine che indica quantitativamente l'affinità tra un enzima e il suo substrato:

più basso è il valore di KM e più bassa sarà la concentrazione di substrato che permette di

 raggiungere un valore di velocità di reazione pari alla metà della velocità massima, il che

indica una alta affinità dell'enzima per il substrato.

Viceversa un alto valore di KM indica che sarà necessario più substrato per raggiungere una

 velocità di reazione pari alla metà della velocità massima, il che significa una minore affinità

dell'enzima per il substrato.

Grafico dei doppi reciproci

Riportando l'equazione di Michaelis-Menten nella forma: Grafico utile per l’inibizione

enzimatica

è possibile ottenere il grafico dei doppi reciproci , piu

utile perche ci permette di trovare la Velocita massima e

la Km ),che rappresenta la pendenza) ,tramite dei punti

sul grafico. Lineweaver

-Burk), rappresentando graficamente l'andamento di 1/V in funzione di 1/[S]. In tal modo si ottiene una

retta con intercetta sull'asse delle ascisse nel punto - 1/KM

, sull'asse delle ordinate nel punto 1/Vmax e con Alcune reazioni sono piu

coefficiente angolare pari al rapporto KM/Vmax. veloci perche si accontentano

Questo sembra rispondere a molti problemi riguardanti il di substrati bassi, altre invece

calcolo dei parametri cinetici dalla curva velocità contro sono piu lente perche ci vuole

concentrazione del substrato: un TOT. Di enzimi.

Km è diverso per ogni enzima

E' una linea retta che di per sè è più facile da tracciare

 perche dipende dalla natura

Non richiede la misura diretta della Vmax

 del substrato e dal tipo di

enzima.

La lettura di entrambe Vmax e Km può essere fatta

 prontamente dal grafico.

Costante catalitica ( Kcat)

Numero di molecole di substrato convertite a prodotto da una

 molecola di enzima,nell’unità di tempo.

Espressa anche come efficienza catalitica : ovvero quante

 molecole ha catalizzato un singolo enzima nell’unità di tempo.

Esempio: CATALASI del H2O2 40.000.000 in un minuto

 

Influenza di temperatura e PH sugli

enzimi

Tutti gli enzimi lavorano ad una temperatura ideale , che varia per

 ognuno, ma che di solito si aggira intorno ai 37°. Se si va oltre

questa temperatura allora si inizia ad avere denaturazione degli

enzimi.

Anche il PH puo modificare le cariche degli a.a. e le loro

 interazioni, ecco perche la grande maggioranza degli enzimi

lavora a Ph fisiologico. Alcuni enzimi come le proteasi e

peptidasi gastriche resistono ai Ph fortemente acidi dello

stomaco.

Tipi di reazioni catalizzate

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Non importa l’ordine

Secondo livello

 con cui si legano i

Terzo livello

 substrati

Quarto livello

 Quinto livello

 Vanno in ordine

preciso di ingresso

Meccanismi di catalisi

Catalisi acido-base: (ambiente ne troppo acido ne troppo basico) trasferimento di

 protoni (a.a. presenti nel sito attivo possono agire da accettori o donatori di

protoni)

Catalisi covalente : formazioni di legami covalenti transitori tra enzima e

 substrato.

Catalisi da ioni metallici: interazioni ioniche da parte di ioni metallici.



*quando anche alla fine si fosse formato uno di questi legami tra E e S, alla fine

della reazione l’enzima torna da solo *

(esempio: chimotripsina)

Chimotripsina

Enzima della dieta, che scinde i legami peptidici

 Costituito da SER (195) – His(57) - Asp (102) , che formano il sito attivo e sono

 importanti per la catalisi.

Meccanismo d’azione:



Entra il peptide da scindere nel sito di legame.

La prima ad agire è la serina che cede un H+, accettato dall’His

(serina=acido\histidina=base). Quando la serina perde h+ allora O diventa reattivo e si

lega al substrato con legame covalente. His 5