DOMANDE MICROBIOLOGIA GENERALE E ALIMENTARE

Analisi della carica batterica dello yogurt

Vengono diluiti e omogeneizzati portandoli a 100 mL finali con un opportuno diluente. Dopo diluizioni, piastramento e incubazione della sospensione su un opportuno terreno di coltura si rilevano 95 colonie nella piastra Petri in cui sono stati inoculati 0,1 mL della diluizione 10^-6. Qual è la carica batterica dello yogurt? Indicare l'unità di misura.

95 UFCx10x10^6 = 9.5x10^8 UFC/ml e poi 9.5x10^8 UFC/ml x 100ml/10g = 9.5x10^9 UFC/g

31. Se ho 56 colonie e ho spalato 0,1 mL della diluizione 10^(-6), quanti UFC ho?

Ho 56x10^(6)x10, che equivalgono a 56x10^(7) UFC/mL

32. Se la densità cellulare in una mozzarella è di circa 10^8 UFC/g come procedo per ottenere colture in piastra Petri in cui ci siano circa 100 colonie?

Diluisco 1g di campione in 10g di diluente effettuando la prima diluizione (diluiz. 10^-1, 10^7 colonie). Effettuo le successive diluizioni fino alla diluizione 10^-6 nella quale saranno presenti 10^2 colonie. Piastro 1ml di diluizione 10^-6.

1. Metodo diretto: Conta al microscopio

Utilizza un vetrino con solchi (campi) che corrispondono ad un volume preciso. Si effettua la conta in diversi campi, si fa la media e si ottiene il numero di cellule per unità di volume. Tuttavia, c'è una soglia minima di 10^5 batteri sotto la quale non si ha più una concentrazione omogenea.

2. Metodo diretto: Contatore Coulter

Utilizza un contatore Coulter per determinare direttamente il numero di cellule presenti. Questo strumento misura la resistenza elettrica delle cellule mentre passano attraverso un piccolo foro. Il cambiamento nella resistenza elettrica è proporzionale al volume delle cellule, consentendo di calcolare il numero di cellule presenti.

3. Metodo diretto: Citometria a flusso

La citometria a flusso è un'analisi multiparametrica che utilizza il citometro di flusso e sfrutta la focalizzazione idrodinamica. La sospensione viene trascinata e compressa da un fluido di trascinamento fino a quando le particelle risultano allineate nella camera di conta (tubulare, trasparente). Un laser illumina le particelle una alla volta e i fotodiodi rilevano la luce diffusa o emessa dalle particelle. Questo metodo permette di analizzare un gran numero di cellule in poco tempo e di ottenere informazioni dettagliate sulle caratteristiche delle cellule.

Per descrivere tutte le fasi della crescita microbica, utilizzerei il metodo diretto della conta al microscopio. Questo metodo permette di osservare direttamente le cellule e di determinare il numero di cellule presenti in diverse fasi di crescita. Inoltre, consente di valutare la morfologia delle cellule e di rilevare eventuali anomalie o cambiamenti nella popolazione microbica.

Il laser attraversa la sospensione e viene deviato dalle cellule. Un sensore oltre il tubo rileva la variazione del laser e determina il numero delle cellule mentre un computer digitalizza i dati. Gli eventi citometrici sono distinti dalle particelle presenti tramite molecole fluorescenti che si legano al DNA.

Conta vitale: si preleva un volume preciso dal campione e si effettuano una serie di diluizioni decimali consecutive e viene coltivato un volume noto da ogni diluizione. Si seleziona la prima piastra petri che permette di contare le colonie (da 30 a 100) e si ricava la concentrazione iniziale in base ai volumi prelevati per le diluizioni. Ottengo delle UFC per quantità di soluzione iniziale.

Metodi indiretti: permettono di determinare il numero di cellule presenti calcolando altri parametri.

Peso umido e peso secco: pesata della biomassa con o senza acqua

Analisi chimica di costituenti cellulari: analisi quantitativa di un costituente presente come il DNA

Turbidimetria analisi

della torbidità di una sospensione tramite lo spettrofotometro che misura l'assorbanza, ovvero il logaritmo del rapporto tra luce incidente e luce trasmessa. Più una sospensione è torbida più batteri sono al suo interno e più è elevata l'assorbanza.

Per descrivere tutte le fasi della crescita microbica si può utilizzare la citometria a flusso in quanto essa è un'analisi multiparametrica che consente di definire la quantità e lo stato delle cellule presenti. Essa può essere utilizzata in combinazione con la conta vitale per una maggiore precisione.

34. QUALE STRUMENTO PERMETTE DI OSSERVARE TUTTE LE FASI DELLA CRESCITA DI UN M.O.?

Lo strumento è il citometro di flusso, utilizzato per la citometria di flusso. Essa sfrutta la focalizzazione idrodinamica ed è un metodo multiparametrico che permette di determinare la numerosità, dimensione, complessità e stato delle cellule presenti in

Una sospensione. La numerosità, la dimensione e la complessità vengono determinate grazie ad un sensore che rileva le variazioni del laser che attraversa la camera di conta mente lo stato delle cellule può essere valutato introducendo molecole fluorescenti che si intercalano nel DNA e differenziano cellule vive da cellule morte e danneggiate.

35. CITOMETRIA A FLUSSO

Essa è un'analisi che sfrutta la focalizzazione idrodinamica ed è un metodo multiparametrico diretto per la conta microbica che permette di determinare la numerosità, dimensione, complessità e stato delle cellule presenti in una sospensione. In questo metodo, attraverso un fluido di trascinamento viene trascinata e compressa la sospensione di cellule che vengono allineate verso la camera di conta. Qui un laser colpisce le singole cellule della sospensione e viene diffratto, riflesso e rifratto. Un sensore dalla parte opposta della camera di conta rileva le variazioni del laser e

Analizzare una sospensione di cellule è inoltre un metodo multiparametrico che permette di determinare la numerosità, dimensione, complessità e stato delle cellule presenti. Esso permette infatti di determinare se le cellule analizzate sono vive, morte o danneggiate attraverso l'utilizzo di molecole fluorescenti capaci di intercalarsi nel DNA e di emettere luce se eccitate. In particolare, il syto24 (verde) permea nelle cellule e si intercala sempre nel DNA: le cellule vive presentano solo questa fluorescenza. Il propidio (rosso) si intercala nel DNA di cellule morte che hanno la membrana danneggiata. In questo caso, la fluorescenza rossa prevale su quella verde.

37. Quale fase della crescita batterica potresti non rilevare se come metodo di conta utilizzi la turbidimetria o la conta al microscopio?

In entrambi i casi la fase non rilevabile è quella di morte. Nel caso della turbidimetria, la morte cellulare è rilevabile soltanto in caso di lisi cellulare.

Che fa aumentare la torbidità della sospensione e le cellule vive possono essere evidenziate effettuando una colorazione. Nel caso della conta al microscopio la fase di morte non è invece rilevabile nel caso in cui avvenga la lisi della cellula.

38. DESCRIVI LA SPORA BATTERICA, LE CARATTERISTICHE E LE CARATTERISTICHE DEI BATTERI SPORIGENI

La spora batterica è una forma inattiva e quiescente tipica dei batteri gram positivi, resistente alladesidratazione, concentrazioni saline elevate e alte temperature. Viene prodotta dal batterio in caso di condizioni ambientali ostili ed è quindi una spora di resistenza. Essa è composta da un tegumento protettivo e contiene al suo interno materiale genetico, proteine ed enzimi. La resistenza del tegumento è dovuta alla struttura polimerica di NAM e NAG e all'accumulo di sali di dipicolinato di calcio. È una struttura piccola e leggera che può essere trasportata dall'aria e da altri veicoli.

In ambienti diversi (ubiquitarie). Quando si trova in condizioni favorevoli germina e si forma una cellula vegetativa. I batteri sporigeni sono batteri di interesse alimentare poiché le loro spore sono termostabili e quindi resistono ai processi di pastorizzazione ma non alla sterilizzazione. I batteri sporigeni possono essere aerobi, appartenenti al genere Bacillus (es. cereus, thuringiensis, anthracis) o anaerobi, appartenenti al genere Clostridium (es. botulinum e tyrobutirricum).

Esempi di batteri sporigeni aerobi e anaerobi:

• I batteri sporigeni hanno particolare interesse in ambito alimentare poiché le loro spore sono termostabili, resistendo ai processi di pastorizzazione ma non a quelli di sterilizzazione. I batteri sporigeni possono essere aerobi o anaerobi, quindi si trovano praticamente sempre. I batteri appartenenti ai Bacillus sono aerobi, alcuni esempi sono: B. Cerus (causa infezioni e tossinfezioni), B. thuringensis (insetticida), B. anthracis (causa infezione polmonare).

Mentre i batteri appartenenti al genere Clostridium sono strettamente anaerobi, alcuni esempi sono: C. tyrobutirricum (provoca gonfiore tardivo) e C. Botulinum (produce una tossina mortale).

40. QUALI SONO I PROBLEMI IN AMBITI ALIMENTARI CAUSATI DALLE SPORE BATTERICHE?

I batteri sporigeni sono di interesse alimentare perché le loro spore sono termostabili e resistono quindi ai processi di pastorizzazione ma possono essere eliminate con trattamenti di sterilizzazione.

Le spore sono prodotte da batteri gram positivi aerobi appartenenti al genere Bacillus (es. cereus, thuringensis, anthracis) o anaerobi appartenenti al genere Clostridium (es. botulinum e tyrobutirricum).

Gli alimenti in cui questi m.o. crescono e che non subiscono trattamenti di sterilizzazione sono a rischio di presenza di spore. Esse causano intossicazioni se ingerite ma non danno problemi se la loro germinazione viene inibita. Nelle conserve vegetali viene ad esempio utilizzato l'aceto per abbassare il pH sotto 5,5.

(inibisce anche le spore di C. botulinum). In generale, problematiche causate dalle sporebatteriche riguardano la sicurezza (infezioni e tossinfezioni alimentari, effetti di neurotossicità) maanche problemi di qualità dei prodotti (gonfiore tardivo).

41. QUALI SONO I FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA? (breve)

La crescita batterica è influenzata da diversi fattori, alcuni esempi sono:

• Temperatura: è uno dei fattori che più influenza il batterio che possiede un proprio range ditemperatura in cui può sopravvivere e un optimum di temperatura che consente al m.o. di svilupparsialla massima velocità.
• pH: i batteri hanno un proprio livelli ottimale di pH al quale si sviluppano più velocemente. La maggiorparte dei batteri cresce ad intervalli di pH neutri o subalcalini e in generale si possono distinguerebatteri acidofili (pH acido<7), neutrofili (pH neutro =7) ed alcalofili (pH basico >7).
• Presenza di ossigeno: