Domande esame di microbiologia generale, industriale e alimentare

Domande di microbiologia

1. Quali sono le dimensioni dei batteri?

I batteri sono invisibili a occhio nudo e generalmente hanno dimensioni che vanno da 0.2 um a 2 um. Essendo per lo più unicellulari, essi presentano limitate varietà di forme come bastoncellare, a virgola, spirale, sfera. Le forme più comuni sono i bacilli, i vibrioni, gli spirilli e i cocchi. I batteri filamentosi formano ife costituite da lunghe catene. Molto spesso i batteri si organizzano in colonie: si possono avere batteri organizzati in tetradi, in sarcine o in stafilococchi. I batteri organizzati in colonie però mantengono un metabolismo indipendente. (I lieviti sono circa 10 um, mentre i virus sono nell’ordine dei nm).

2. Com'è costituita una membrana cellulare?

La membrana cellulare è costituita da un doppio strato fosfolipidico. Ha la funzione di dividere la parte interna della cellula dall’esterno. La parte idrofobica è all’interno della membrana composte da code di acidi grassi mentre la parte idrofilica è alle estremità, composta da una testa polare e da fosfato. Possono essere presenti proteine di membrana (che hanno diverse funzioni) e steroli (che contribuiscono a dare rigidità). Proprio per la sua struttura chimica la membrana cellulare funge da barriera.

3. Quali sono le differenze tra eucarioti e procarioti?

Tutte le cellule sono dotate di una membrana che ne separa l’ambiente interno dall’esterno. Le cellule eucariotiche contengono al loro interno organelli che svolgono diverse funzioni (cloroplasti e mitocondri), assenti nelle cellule procariotiche e le prime sono dotate di nucleo, contenente l’informazione genetica, delimitato da una membrana che lo separa dal resto del citoplasma, mentre nelle ultime (le cellule procariotiche) il materiale genetico si trova libero nel citoplasma. Sempre a riguardo del materiale genetico, nelle cellule eucariotiche sono presenti due o più cromosomi, sempre presenti a coppie; nelle cellule procariotiche il cromosoma è generalmente uno solo anche se raramente son di più ma mai accoppiati. Un’altra differenza tra le due tipologie di cellule è il modo in cui si riproducono: la divisione delle cellule procariotiche è di tipo mitotico e mediante riproduzione asessuata, mentre quella delle cellule eucariotiche può essere di tipo mitotico ma anche di tipo meiotico a cui si aggiunge anche la possibilità di una riproduzione sessuata per avere così un arricchimento della biodiversità. Infine, abbiamo anche una differenza per quanto riguarda le dimensioni dei ribosomi delle due cellule: i procarioti contengono ribosomi di 70S (“Svelberg”, unità di sedimentazione: 1S=10^-13 sec) mentre gli eucarioti contengono ribosomi di 80S.

4. Descrivi sinteticamente la "specie batterica"

Oggigiorno la tassonomia microbica è molecolare, cioè basata sulla lettura delle sequenze genetiche. Tutte le classificazioni tassonomiche si basano sulla definizione di specie che è diversa per i microrganismi in quanto spesso non è nota la riproduzione sessuale. Per i microrganismi, si considera specie un insieme di individui uguali tra loro sulla base di caratteri ritenuti essenziali da chi li osserva (questi caratteri ritenuti importanti possono essere di tipo morfologico, fisiologico, biochimico, ecologico, genetico, ecc.). Quando una o più specie formano un gruppo ben definito e nettamente distinto dagli altri, allora questo gruppo viene denominato “genere”; invece, ancora al di sotto della specie batterica si ha il ceppo. Un ceppo batterico è la popolazione batterica che discende da un unico microrganismo (in altre parole, da un singolo isolamento coltivato, quindi da una colonia) di una tale specie e che può presentare caratteristiche diverse da altri ceppi generati da un altro microrganismo della stessa specie. Dal punto di vista molecolare, per appartenere ad una determinata specie, i ceppi devono possedere una elevata omologia filogenetica, cioè una omologia di sequenze codificanti per il gene 16S rDNA maggiore o uguale al 97-98%.

5. Con quale obiettivo si osserva il "Licheniformis" a un microscopio ottico con oculare 10x?

Essendo di piccolissime dimensioni (siamo nell’ordine dei um, cioè 10^-6) si usa un obiettivo 100x; infatti un obiettivo di questo tipo accoppiato a un oculare 10x consente un ingrandimento totale di 1000x, cioè consente un’identificazione nell’ordine dei mm (10^-3), visibile dall’occhio umano.

6. Elenca e descrivi sinteticamente i sistemi di trasporto di membrana

Il trasporto attraverso una membrana può essere di tipo passivo, cioè non richiede ATP, oppure di tipo attivo, cioè richiede ATP. Il trasporto passivo consiste nel passaggio di molecole secondo gradiente e può essere suddiviso in diffusione semplice e diffusione facilitata: nel primo caso non intervengono proteine di membrana ma passano facilmente molecole apolari ma anche alcune molecole polari non zwitterioniche (es. acqua, urea, glicerolo, etanolo), nel secondo caso, il trasporto si serve di alcune proteine canale o proteine carrier che veicolano il passaggio di molecole, ioni o composti che altrimenti non riuscirebbero a passare la membrana con diffusione semplice. L’osmosi è uno specifico tipo di diffusione facilitata in cui sono le molecole di un solvente (e non di un soluto) a permeare la membrana attraverso le proteine canale.

Il trasporto attivo consiste nel trasporto di composti contro il gradiente di concentrazione. Tale passaggio necessita di molecole di membrana che richiedono l’uso di energia sotto forma di ATP. Si distinguono diversi tipi di trasporto attivo: l’uniporto, nel quale una proteina di trasporto è specifica per una sola determinata molecola; il simporto, nel quale il passaggio della molecola desiderata è facilitato dall’ingresso di una seconda molecola, la quale di solito si muove secondo gradiente; infine, l’antiporto sfrutta anch’esso il movimento secondo gradiente di una molecola dall’interno verso l’esterno per assicurare l’ingresso di un’altra molecola verso l’interno.

Traslocazione di gruppo o PEP-PTS e sistema ABC sono altre tipologie di trasporto attivo che richiedono più proteine di trasporto e richiedono anche una ingente quantità di energia sotto forma di ATP o di gruppi fosfato. Nel sistema ABC (“ATP-Binding-Cassette System”) sono richieste 3 proteine di membrana, una transmembrana, una localizzata sull’esterno della membrana per il riconoscimento molecolare e una sulla membrana interna; in questo meccanismo, fondamentale per il trasporto di piccoli amminoacidi, peptidi e altri piccoli trasportatori di azoto, è necessario consumare energia proveniente dall’idrolisi di ATP. Nella traslocazione di gruppo la molecola di PEP, che viene scelta in modo selettivo dalla proteina transmembrana, è ad alto livello energetico con un gruppo fosfato che viene ceduto alla proteina transmembrana che lo collega alle altre 4 proteine intracellulari del gruppo di traslocazione stesso che lo fosforilizzano; il fatto di ottenere uno zucchero già fosforilato significa che questo processo è molto interconnesso con la glicolisi.

7. Descrivi la parete di Streptococcus thermophilus

Questo microrganismo è un batterio lattico, omofermentante e anaerobio-aerotollerante. Si tratta di un batterio Gram +, quindi ha una parete cellulare formata prevalentemente da peptidoglicano e in minor quantità da fosfolipidi. Si tratta di una parete cellulare rigida per resistere alla pressione osmotica e allo stress ambientale e ha anche funzione di ancoraggio. Essendo composta da peptidoglicano, la parete è essenzialmente costituita da glicani, cioè zuccheri, e da peptidi legati da legami covalenti molto forti (ponti interpeptidici e legami B-1,4-glicosidici); ci sono catene polisaccaridiche composte da un’alternanza regolare di due amminozuccheri, NAG (n-acetil-glucosammina) e NAM (acido n-acetil-muranico).

Per rompere la parete cellulare di questo batterio, come per gli altri Gram+, è necessario usare una forte azione meccanica oppure uno o più particolari enzimi che idrolizzano i legami peptidici (sono le proteasi) e glicosidici (per esempio, il lisozima).

8. Quali sono i reattivi della colorazione di Gram?

Il primo passo del processo di colorazione consiste nel trattare lo striscio da studiare con cristalvioletto, un colorante; successivamente si copre il preparato con mordente, cioè una soluzione di ioduro di potassio e iodio, che serve a formare con il cristalvioletto un composto insolubile. A questo punto si aggiungono allo striscio delle gocce di etanolo, processo che corrisponde alla cosiddetta fase di decolorazione, fase che consente una prima distinzione tra Gram+ e Gram-: infatti nei Gram+ il colorante si fissa alla parete e l’etanolo non decolora, mentre nei Gram- l’etanolo decolora e il microrganismo non resta colorato di viola. Poi, dal momento che l’etanolo disidrata, bisogna reidratare con acqua la superficie del microrganismo e infine effettuare la colorazione di contrasto, cioè si tratta il preparato con safranina, che colora di rosso, quindi, solo i Gram-.

9. Quali sono le strutture che rivestono la cellula di Escherichia coli?

Questo microrganismo è un Gram-, quindi questa cellula è rivestita, in ordine dall’interno all’esterno, prima da una membrana cellulare interna composta da un doppio strato fosfolipidico, poi da una parete cellulare di peptidoglicano (meno spessa di quella dei Gram+) e da un’altra membrana cellulare esterna di fosfolipidi. Tra le membrane e la parete cellulare sono presenti due spazi periplasmatici. La membrana esterna dei fosfolipidi è una struttura che perde la sua simmetria e a cui sono ancorati dei lipopolisaccaridi, strutture importanti poiché interferiscono con il sistema immunitario: questi lipopolisaccaridi sono formati, nella zona centrale interna, da un core specifico polisaccaridico e, nella zona esterna, dal cosiddetto “antigene 0” ripetuto molte volte, che è la molecola riconosciuta dal sistema immunitario ed emette una risposta innata.

Alcuni ceppi di Escherichia coli sono indifferenti nell’intestino umano (che lo colonizzano), altri sono importanti tecnologicamente nel Panerone, altri ancora sono patogeni e provocano gastroenterite.

10. Qual è il passaggio diverso tra colorazione per Gram+ o Gram-?

La colorazione di Gram avviene tramite 5 passaggi: fissazione delle cellule al calore, colorazione primaria con cristalvioletto, trattamento con ioduro di potassio (mordente), decolorazione con etanolo e, infine, colorazione di contrasto con safranina. La differenza tra i due sta nel fatto che, una volta reidratati dopo la decolorazione con etanolo, i Gram+ restano colorati di viola (cristalvioletto) mentre i Gram- perdono il loro colore viola e, trattati poi con safranina, acquistano un colore rosso.

11. Descrivi sinteticamente il protocollo utilizzato per effettuare la colorazione di Gram

Si mette con l’ansa il microrganismo sul vetrino, lo si lascia asciugare, lo si passa sulla fiamma per fissare il microrganismo e, infine, si procede con la colorazione: prima si procede con la colorazione primaria con cristalvioletto, poi si tratta con mordente, una soluzione di ioduro di potassio, successivamente si effettua una decolorazione con etanolo che, nei Gram-, rimuove il colorante, e, dopo una reidratazione con acqua, si conclude con la colorazione di contrasto mediante safranina.

12. Cosa si intende per colonia batterica? E cosa si intende per isolamento in coltura pura?

Per colonia batterica si intende la forma macroscopica con cui vediamo i batteri e i lieviti in ambienti di coltura studiati nei laboratori. Una colonia batterica è, di fatto, un insieme di microorganismi batterici nati da un’unica cellula madre che ha dato inizio alla divisione o riproduzione cellulare.

Invece, per isolamento in coltura pura si intende la coltivazione omogenea di un singolo ceppo di una specie batterica che viene prelevato da una colonia singola; infatti, in microbiologia si procede nello studio differenziato di ogni singolo ceppo poiché i diversi ceppi, anche se derivanti dalla stessa specie batterica, possono avere esigenze nutrizionali estremamente diverse.

13. Lactobacillus helveticus è prototrofo per l’acido glutammico. Dovendo coltivare in laboratorio questo microrganismo dovrò prevedere la presenza dell’acido glutammico nella formulazione del terreno di coltura? Perché?

Un organismo prototrofo è un organismo in grado di sintetizzare autonomamente i nutrienti necessari alla propria crescita, impiegando solo piccole quantità di vitamine e di glucosio. Il batterio qui citato, dal momento che è prototrofo per l’acido glutammico, è in grado di sintetizzarlo da solo; dunque, nel momento in cui si andrà a coltivarlo in laboratorio, non sarà necessario fornire acido glutammico nel terreno di coltura sulla piastra petri.

14. Perché il fosforo è fondamentale nei terreni di coltura?

La presenza di fosforo è fondamentale nella formulazione dei terreni di coltura poiché questo elemento, importantissimo per le cellule, è presente nel DNA (legami fosfodiesterici nei nucleotidi degli acidi nucleici), nei fosfolipidi di membrana ed è presente anche negli acidi teicoici, i quali sono ricchi di legami con fosfato che conferiscono una carica negativa alla superficie esterna della parete cellulare. Il fosforo viene generalmente fornito sotto forma inorganica, come fosfati di sodio o di potassio; in tali forme inorganiche il fosforo infatti ha lo stesso livello di ossidazione di quello presente nelle molecole organiche, quindi viene assunto senza alcuna riduzione.

15. Quali fonti di azoto grezze possono essere impiegate nella formulazione di un terreno di coltura su scala industriale?

Ci sono tre importanti fonti di azoto grezze che vengono usate su scala per il loro basso costo e sono residui di processi del settore agro-alimentare:

• Corn steep liquors: è un residuo del processo di estrazione dell’amido di mais. Sinteticamente, si ottiene trattando il mais a circa 45°C in acqua e in presenza di SO₂ che abbassa il pH; in questo modo i batteri lattici naturalmente presenti sul mais fermentano portando in soluzione le proteine. La parte liquida viene poi separata dalla parte solida e verrà concentrata per ottenere CSL, che è molto acido e dovrà essere usato insieme al carbonato di calcio nel terreno colturale.
• Farina di semi di piante oleaginose: sono il residuo dell’estrazione dell’olio da semi di piante oleaginose con solvente. Sono, per esempio, la farina di semi di soia o di cotone, che hanno un concentrato di proteine pari al 50% circa.
• Borlande da distilleria: sono il residuo del processo di produzione di etanolo, che viene ottenuto da fermentazione alcolica di lieviti nel fermentatore, dopo di che il fermentatore viene scaricato in una colonna di distilleria e viene fatto evaporare e ciò che residua è la borlanda che viene fatta essiccare e viene venduta. La borlanda è costituita da proteine per il 25%, cellule di lievito morte e residui del terreno colturale.

16. Descrivi il ciclo vitale di una popolazione batterica

Il ciclo di vita di una popolazione batterica si distingue in diverse fasi:

• Fase di latenza, che avviene prima che la cellula inizi a riprodursi, in cui la cellula si deve adattare all’ambiente di coltura in cui si trova; in questa fase quindi le cellule non si duplicano e non c’è aumento di numero e la durata di questa fase varia in base alla tipologia di microrganismo e in base alla temperatura in cui le cellule sono poste rispetto alla loro temperatura fisiologica.
• Fase di crescita esponenziale, in cui vi è un aumento del numero delle cellule alla massima velocità possibile ad una data temperatura, mantenendo costante e regolare il tempo di generazione e la crescita stessa. La fase di crescita si ferma o perché si accumulano sostanze che inibiscono la crescita stessa (sostanze tossiche) o perché si esauriscono le fonti di nutrimento nel terreno di coltura oppure perché cambiano le condizioni ambientali di batteri sensibili (poco ossigeno, elevata densità cellulare).
• Fase stazionaria, in cui il numero delle cellule rimane costante in quanto smettono di crescere, in altre parole hanno raggiunto un equilibrio tra crescita e morte. In questa fase quindi non aumenta più il numero delle cellule; le cellule ora cercano di sopravvivere e proseguono in questa fase fino a quando vi sono fonti di nutrimento.
• Fase di morte, in cui si assiste ad una diminuzione delle cellule vive: Questa fase può essere velocissima oppure più complessa (dopo un inizio di fase di morte veloce può seguire un rallentamento). Spesso le cellule alla morte lisano, aumentando la torbidità dell’acqua, ma a volte rimangono integre e quindi visibili.

17. Qual è l'azione delle basse temperature sulla crescita microbica?

La temperatura è uno dei maggiori fattori ambientali che influenzano notevolmente lo sviluppo microbico. Le basse temperature rappresentano il più diffuso mezzo di conservazione degli alimenti; il freddo infatti esercita una azione ritardante o bloccante la riproduzione batterica (azione microbiostatica) impedendone le attività enzimatiche. La ragione di tale fenomeno è che tutte le reazioni metaboliche dei microrganismi sono catalizzate da enzimi e che la velocità di tali reazioni è funzione della temperatura. Inoltre gli enzimi richiedono la presenza di acqua liquida che, con l’abbassarsi della temperatura, diminuisce. Tuttavia è bene ricordare che il freddo non distrugge le tossine batteriche.