Domande biotecnologie genetico molecolari

Valutazione della presenza di geni sul DNA plasmidico

Un altro modo per valutare la presenza di geni sul DNA plasmidico è quello di utilizzare dei primer specifici per quel gene nella PCR. È necessario però aver separato il DNA plasmidico da quello cromosomale tramite una denaturazione alcalina e un'ultracentrifugazione in gradiente di cloruro di cesio e bromuro di etidio. Se non è presente il gene di interesse sui plasmidi allora non si otterranno ampliconi.

Per stabilire se un ceppo è stabile bisogna anche valutare la resistenza nei confronti dei fagi. Si mette in contatto il ceppo con un fago che instaura il ciclo litico e si valuta se sopravvive. Se invece sono presenti dei fagi lisogenici integrati nel DNA, si sottopone il ceppo ad agenti mutageni i quali inducono il fago a staccarsi e a instaurare un ciclo litico.

Un'altra caratteristica che può inficiare sulla stabilità di un ceppo è la presenza delle sequenze di inserzione IS, ovvero trasposoni semplici o complessi. Se sul genoma sono presenti queste sequenze, possono causare instabilità genetica e variazioni nel fenotipo del ceppo.

del ceppo sono presenti molte IS, allora la stabilità è bassa. Per valutare la presenza di IS si può effettuare l’ibridazione southern consonde specifiche. Se si vuole valutare l’espressione del gene in diverse condizioni è necessario svolgere la qPCR.
18) Indicare le varie tecniche di ibridazione: geni codificanti per proprietà bioteconologiche
Le tecniche di ibridazione sono DNA-DNA e su membrana. L’ibridazione DNA-DNA ha lo scopo di stabilire se due ceppi appartengono alla stessa specie. Dovranno quindi avere un’omologia genetica superiore al 70% e un’omologia filogenetica superiore al 97%.
Le tecniche di ibridazione su membrana possono essere DOT-BLOT oppure southern. L’analisi DOT-BLOT serve per stabilire la presenza di un gene di cui non si conosce la sequenza su un DNA. Si estrae il DNA dalla matrice e lo si denatura al calore per permettere la separazione dei due filamenti. Poi lo si fissa su una membrana di nylon o.di idrocellulosa tramite i raggi UV. Per preparare la sonda bisogna cercare la sequenza di quel determinato gene che codifica per un certo enzima in microrganismi diversi, individuando il dominio catalitico, il quale è una sequenza conservata all'interno del gene. Si amplifica quindi questa sequenza tramite PCR e si ottiene la sonda che deve andare a ibridare con il DNA fissato. Se invece il gene di interesse codifica per una resistenza a un antibiotico, allora si cerca la sequenza di quel gene nelle specie filogeneticamente più affini al ceppo dal quale è stato estratto il DNA. Anch'essa viene poi amplificata tramite PCR ottenendo la sonda. La sonda viene quindi marcata in modo tale da emettere una chemioluminescenza grazie a una fosfatasi alcalina e poi viene denaturata al calore. Si mette poi in contatto con il DNA fissato e si fanno dei lavaggi ad alta o bassa specificità per eliminare la sonda non legata. Si visualizzano quindi dei punti neri.corrispondenza di dove la sonda ha riassociato, evidenziando quindi la presenza del gene. L'ibridazione southern di DNA trattati prevede una prima separazione tramite gel elettroforesi; in particolare, si può verificare la localizzazione di un gene a livello cromosomale o plasmidico. Si estrae il DNA totale e lo si sottopone a elettroforesi: i frammenti che corrono di più saranno i plasmidi poiché sono in forma CCC e incontrano meno resistenza rispetto al DNA cromosomale in forma lineare. Sono necessari però degli step preliminari: una depurinazione del gel di agarosio con una soluzione di HCl, poi si denatura il DNA per avere l'ibridazione in sito con il contatto con soda concentrata e poi si svolge la neutralizzazione con un tampone a pH 7. Si trasferisce poi il DNA sul gel con un processo di capillarità sulla membrana di ibridazione: si pongono il gel, la membrana, una carta assorbente, un peso e si lascia per una notte a temperatura ambiente.

modo da far avvenire il passaggio nella stessa posizione. Si fissa ari raggi UV e si fa l'ibridazione DOT-BLOT: facendo una fotografia prima e dopo si vede se l'ibridazione è avvenuta a livello cromosomale o plasmidico. Per stabilire il numero minimo di copie di un gene sul genoma; si estrae il DNA totale e lo si siframmenta con enzimi di restrizione ER, lo si fa correre sul gel per separare i frammenti e poi lo si mette in contatto con la membrana. Si ottengono frammenti in numero elevato con un range di PM ampio, quindi si ha una corsa più lunga. Si fanno sempre le fasi di depurinazione, denaturazione e neutralizzazione e si trasferisce sulla membrana. Si usa sempre una sonda per vedere dove i frammenti hanno riassociato. Il numero di copie è quello minimo perché ci possono essere dei frammenti più grandi che possono contenere più geni, ma all'UV vengono visualizzati come uno solo. In particolare, nel caso del rybotiping molecolare

si determina il numero di copie di operoniribosomiali lungo il genoma e la loro distribuzione utilizzando come sonda il gene 16S o la regionespaziatrice rilevando i frammenti in cui si ha il legame con la sonda e quindi il numero minimo.Oppure nel caso delle sequenze di inserzione IS, questo hanno una mobilità nel tempo a causa delletrasposas e sono affiancati da due regioni RI; esse possono essere presenti in vari punti nel genomae si spostano dando variabilità. Si può determinare il numero di copie minime facendo un'ibridazioneSouthern con ER e le sequenze IS come sonda e vedendo se si ha un cambiato di posizione ponendoi campioni a diverse condizioni di crescita e valutando se si ha un cambiamento nel profilo. 19) Quali analisi devono essere fatte per verificare l'inquinamento di un ceppo? Come identificare unnumero elevato di isolati?Per verificare l'inquinamento di un ceppo conoscendo la sua specie di appartenenza si può valutare la presenza di contaminanti specifici tramite analisi chimiche o microbiologiche. Inoltre, è possibile confrontare il profilo genetico del ceppo inquinato con quello di ceppi di riferimento per identificare eventuali differenze. Per identificare un numero elevato di isolati, si possono utilizzare tecniche di biologia molecolare come la PCR o il sequenziamento del DNA per analizzare un gran numero di campioni contemporaneamente.

regione spaziatrice RSA o ITS; essa è una regione non codificante presente nell'operone ribosomiale interna per separare il gene 16S dal 23S e 5S ma che presenta un grado di conservazione minore e quindi è utile per un'identificazione veloce di 100-200 isolati dello stesso gruppo fisiologico. È una regione che può variare per sequenza e lunghezza tra le varie specie, circa 300-700bp. Essa è una regione conservata all'interno della specie e, se si conosce il profilo elettroforetico della regione spaziatrice di una determinata specie, si possono rilevare delle bande che non rientrano nel profilo e che quindi sono sintomo di un inquinamento. La regione spaziatrice viene amplificata tramite dei primer universali costruiti sulla fine del gene 16S e sull'inizio del gene 23S e poi viene fatta l'elettroforesi. Da 100-200 isolati si possono ottenere 5-6 cluster. Il profilo elettroforetico che si ottiene dopo l'amplificazione

è più complesso perché l’operone è presente in più copie lungo il genoma in vari punti e spesso può avere lunghezza diversa, quindi si possono ottenere più bande. Se si ha una sola banda, non significa che si ha una sola copia in quanto si possono avere più copie della stessa lunghezza (PM); se si ottengono più bande si hanno sicuramente più copie ma non si conosce il numero esatto. Dopo aver ottenuto i cluster, è possibile fare l’amplificazione del gene 16S o l’associazione DNA-DNA per determinare le specie di appartenenza. È una metodologia utile per determinare una nuova specie facendo una riassociazione con un ceppo type, o per verificare l’inquinamento di un ceppo di cui si conosce il profilo RSA in quanto se si ha l’aggiunta di una banda è inquinato con certezza. Ceppi della stessa specie hanno lo stesso profilo RSA e quindi vengono raggruppati in cluster omogenei.

invece non è noto il profilo della regione spaziatrice oppure cambia in ceppi appartenenti alla stessa specie, si piastra il microrganismo sul terreno solido e si isolano i due tipi di microrganismi. Si fa una diluizione e poi si ripiastra analizzando le diverse colonie. Dopo si usa una sonda specie-specifica e si valuta se i microrganismi rispondono alla sonda. Se non si ottiene nessun amplicone allora i microrganismi appartengono a una specie diversa a quella di mio interesse. 20) Determinare i parametri che caratterizzano la PCR quantitativa. La PCR real-time è un'analisi quantitativa che utilizza un componente interno alla reazione che dà fluorescenza con la stessa cinetica della reazione di PCR e quindi è proporzionale alla quantità di amplicone ed è relativo alla fase esponenziale. Per questo, si utilizza un termociclatore che misura la fluorescenza emessa durante ogni ciclo. Oltre ai componenti della reazione, si ha un fluorocromo cheè un colorante fluorescente che può essere di due tipologie: il SYBR GREEN si lega al doppio filamento del DNA in modo aspecifico e può essere usato per tutte le reazioni di PCR real-time per ogni target, quindi anche primer e inquinanti e bisogna quindi fare un controllo della curva di melting in quanto la Tm dell'amplicone deve essere uguale a quella che ci si aspetta. Oppure si hanno sonde specifiche marcate fluorescenti diverse per ogni amplicone. La curva di amplificazione ha un andamento sigmoidale e mette in relazione la fluorescenza con i cicli di amplificazione: all'inizio non viene registrato, si ha poi la fase esponenziale e poi un plateau con fluorescenza costante. Il controllo è dato da una miscela senza il DNA che deve essere vicino allo zero del segnale. I parametri che caratterizzano la qPCR sono la linea di base, ovvero quando non si ha la registrazione della fluorescenza e che dipende dalla sensibilità dello strumento, e

La linea soglia viene impostata e deve essere maggiore della linea di base e interseca la curva del campione nella fase esponenziale con un'efficienza del 100%. Si ottiene così il numero di cicli soglia CT, ovvero il numero di cicli per raggiungere la linea soglia che sono inversamente proporzionali alla quantità iniziale di DNA: minore è la quantità iniziale, maggiore è il numero di cicli necessari per raggiungere il valore.

21) Quantificazione assoluta PCR-real time

Per fare una quantificazione assoluta e quindi determinare il numero esatto di cellule del campione è necessario avere una curva standard per determinare in tempo reale la presenza di un microrganismo in una matrice complessa con una determinata concentrazione. È necessario avere una sonda specie-specifica di 100-700 bp, verificare la curva di melting e la specificità. La retta di calibrazione è una retta con pendenza negativa che mette in relazione il numero

raverso la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction). La PCR è una tecnica di amplificazione del DNA che permette di ottenere milioni di copie di un frammento specifico di DNA in modo rapido ed efficiente. Per stabilire la soglia di cicli, vengono preparate delle diluizioni del microrganismo di interesse. Queste diluizioni contengono diverse quantità di DNA, che vanno da una concentrazione alta a una concentrazione bassa. Nell'esperimento, vengono eseguiti una serie di cicli di amplificazione del DNA utilizzando la PCR. Durante ogni ciclo, il DNA viene denaturato, annealato con i primer specifici e allungato dalla DNA polimerasi. La soglia di cicli viene determinata quando il segnale di amplificazione raggiunge un valore predefinito. Questo valore predefinito può essere stabilito in base alla sensibilità del metodo di rilevamento utilizzato. Una volta stabilita la soglia di cicli, è possibile determinare la quantità di DNA presente nel campione iniziale. Questa quantità può essere calcolata utilizzando una curva di standardizzazione, che viene generata utilizzando campioni di DNA di concentrazione nota. In conclusione, la soglia di cicli è una misura della quantità di DNA presente nel campione iniziale ed è determinata utilizzando la tecnica della PCR. Questa misura è importante per valutare la presenza e la quantità di un microrganismo specifico nel campione analizzato.