Biotecnologie genetico-molecolari - modulo

FLUSSO DELL'INFORMAZIONE GENETICA

Il genoma è scritto in triplette o codoni, ognuno dei quali indica un amminoacido. I conti però non tornano: con 4 diverse lettere si possono formare ben 64 parole diverse, mentre gli aminoacidi sono solo venti. Anche il genoma ha dei sinonimi: alcune triplette indicano lo stesso amminoacido. Il codone è la tripletta di basi nucleotidiche che va a specificare un preciso aminoacido. Tutti i 64 possibili codoni hanno una funzione specifica: - 61 sono codoni di senso, specificano i diversi amminoacidi; - 3 codoni non senso o codoni di stop, sono impiegati come segnali di arresto della traduzione (TAA è il più comune, poi TAG o TGA in alcuni casi). I 20 amminoacidi possono essere codificati da 61 diversi codoni. Questa caratteristica è detta degenerazione del codice genetico. Nella maggior parte dei casi i codoni sinonimi differiscono solo per la terza base all'estremità 3' che può variare.

Poiché i tRNA sono gli adattatori dei codoni, ci si aspettano 61 diversi tRNA: in realtà il numero è inferiore e sebbene variabile da specie a specie, non raggiunge mai il numero dei codoni possibili. Questo comportamento è noto con il termine vacillamento della terza base: l'appaiamento del codone con l'anticodone è tale da consentire la presenza di una base diversa in terza posizione.

Il codone di inizio nei procarioti è solitamente ATG (più raramente GTG o TTG) a cui corrisponde un tRNA che trasporta una N-formil-metionina (quando lo troviamo è il segnale di inizio del processo di traduzione che è tipica dei batteri) che è il primo amminoacido incorporato in una proteina e che viene frequentemente rimosso dalla proteina durante la sua maturazione (tutte le proteine batteriche hanno questo codone all'inizio, che poi verrà eliminato durante la traduzione).

Quando i codoni ATG, GTG o TTG si ritrovano all'interno di una sequenza nucleotidica e non all'inizio, codificano normalmente rispettivamente per una metionina, valina e leucina.

GENI

Un gene può essere ora definito come una sequenza di basi nucleotidiche continua, presente in una data regione del cromosoma che ha come limiti un codone di inizio, seguito da un certo numero di codoni interni, che termina con un codone di stop. Deve essere letto a triplette, partendo dal codone di inizio, fino al codone di stop; ciascuna tripletta interna codifica per un AA. Questa sequenza limitata da un inizio ed una fine se codifica per un prodotto del fenotipo viene chiamata gene. Un tempo era noto il concetto "un gene, una proteina", ma con il progredire degli studi genetici e biochimici si scoprì che molte proteine sono costituite da diversi polipeptidi che possono essere codificati da distinte regioni nucleotidiche. Di conseguenza, la definizione di gene si è

Un gene è una sequenza di DNA che contiene l'informazione per la sintesi di un polipeptide. Tuttavia, anche questa definizione è limitata perché ci sono sul cromosoma regioni di DNA che, sebbene non codifichino per proteine o polipeptidi, sono importanti per la vitalità cellulare o per la regolazione genica.

In termini molecolari si utilizza anche il termine ORF (open reading frame) per indicare una regione codificante della quale ancora non si conosce la funzione a livello del fenotipo.

In termini di numero di basi nucleotidiche, per capire quanto può essere lungo un gene, si può assumere che il PM medio di una proteina sia di circa 40.000 Dalton; se si considera quindi che un AA in media pesa 110 D, allora la proteina è costituita da circa 364 AA. Poiché ciascun AA richiede una tripletta di basi nucleotidiche, si può dedurre che una proteina sia codificata da un gene di circa 1092 coppie di basi (bp - base pair).

12TRASCRIZIONE All'inizio del gene, viene riconosciuta la sequenza dall'unità sigma della DNA polimerasi. Il sito promotore è caratterizzato da due sequenze di 6 basi nucleotidiche poste a -10 paia di basi dall'inizio di trascrizione del gene e a -35. Vengono chiamate anche box -10 e box -35 e costituiscono il sito promotore. La subunità si lega e favorisce l'apertura del DNA. Al termine della sequenza genica che deve essere trascritta, deve essere presente il sito terminatore, ovvero dei segnali che diano alla DNA polimerasi il segnale per fermarsi e per staccarsi dal DNA. In sintesi, lo schema di trascrizione è composto da sito promotore e sito terminatore che favorisce lo staccamento di DNA polimerasi.

SITO PROMOTORE Il sito promotore può determinare l'efficienza di trascrizione a seconda della sequenza di basi nucleotidiche e a seconda della distanza che hanno dai box -10 e -35. La cellula può regolare l'espressione di

vari geni, che può essere più forte o più debole, in base al sito promotore. Tra il box -10 e l'inizio del gene da trascrivere, c'è una piccola regione chiamata RBS (Ribosomal Binding Site) ricca in adenina e guanina, che ha la proprietà di essere riconosciuta dai ribosomi per leggere il messaggio dell'mRNA dall'inizio, che potrebbe casualmente legarsi anche al DNA. Questa sequenza è complementare alla sequenza Shine-Delgarno presente su rRNA 16S; questa complementarietà consente il legame con il DNA per la sintesi proteica nel punto esatto. Le sequenze più forti sono quelle consensus, che consentono un legame più forte della DNA polimerasi al DNA e una trascrizione più efficiente. Queste sequenze però, possono essere anche diverse, ma l'efficienza di trascrizione sarà minore. Per essere molto efficiente, il box -10 (detto anche TATA box) deve essere precisamente in quella posizione.

così come il box -35.

SITO TERMINATORE

I metodi per terminare la trascrizione sono molteplici, uno tra questi è la presenza del sito terminatore. Al termine di ogni gene si trovano delle sequenze ripetute e invertite nello stesso filamento; quando l’mRNA dà luogo alla trascrizione, queste sequenze tendono a ripiegarsi e unirsi formando una forcina che impedisce alla DNA polimerasi di proseguire nella trascrizione.

TRADUZIONE

Le due subunità dei due ribosomi diventano attive quando l’mRNA si lega a livello dell’RBS della subunità 30S. Il ribosoma procede nella lettura dei codoni e al ribosoma arriva lo specifico tRNA corrispondente all’mRNA a livello della subunità maggiore, di cui si riconoscono il sito peptidico e amminoacilico. Successivamente avviene lo scorrimento lungo l’mRNA che permette la formazione della catena amminoacidica che darà luogo alla proteina completa. Dopo la formazione del legame peptidico, una

peptidil trasferasi trasferisce l'AA dal suo tRNA nel sito Pall'amminoacil tRNA sul sito A. Il movimento verso il codone successivo causa il distacco del tRNAdeacilato dal sito P mentre il dipeptidil-tRNA si muove al sito P.Il primo AA specifico nei batteri è l'N-formil-metionina che al termine della traduzione viene staccatoper dar luogo alla proteina attiva completa; viene quindi considerato un ulteriore sito di riconoscimento.

ORGANIZZAZIONE DELL'INFORMAZIONE GENICAIl genoma di E. coli, ad esempio, è costituito da 4.6 milioni bp suddivise in circa 4300 geni. Di questi,l'88% di DNA codificante proteine, 12% di DNA non codificante e contenente ad esempio il sitopromotore.Il DNA non codificante contiene i siti promotore e terminatore, siti per la regolazione genica, regioniacquisite con i processi di ricombinazione. Il DNA codificante, invece, contiene non solo geni (ovverosequenze con un codone di inizio e di stop e codoni ognuno codificante

Un operone è una regione genica che raggruppa 2 o più geni codificanti per prodotti richiesti contemporaneamente dalla cellula. Questi geni possono essere più di uno (2-3 oppure 10), che sono contigui e caratterizzati da un solo sito promotore e un unico terminatore, ciò significa che esisterà solo un mRNA che copierà tutti i geni compresi tra i due siti. Questi geni trascritti insieme, prendono il nome di operone. Un operone quindi, è una regione genica che raggruppa 2 o più geni codificanti per prodotti richiesti contemporaneamente dalla cellula. Un operone ha un solo sito promotore, un solo sito regolatore, un unico trascritto, permettendo alla cellula di risparmiare energia.

Alcuni esempi di operone sono l'operone ribosomale e l'operone lac. L'operone ribosomale viene usato molto come target e contiene 3 geni che codificano rispettivamente per l'rRNA 16S, 23S e 5S. Quando il gene deve sintetizzare i ribosomi, ha bisogno di tutti e tre, sintetizzandoli comodamente perché i geni sono riuniti in un unico operone con un solo sito promotore e un unico terminatore.

Infatti, avere 3 geni distinti, che andrebbero trascritti da 3 DNA polimerasi diverse, sarebbe uno spreco di energia. L'operone lac codifica per 3 enzimi (β-galattosidasi, β-galattosidepermeasi e β-galattoside transacetilasi) che servono contemporaneamente quando la cellula è in grado di usare lattosio come fonte di carbonio ed energia. Gli enzimi vengono quindi controllati in modo coordinato.

La regolazione viene fatta attraverso proteine regolatrici, in grado di riconoscere e formare legami idrogeno con le basi nucleotidiche, attraverso un cambio di conformazione. Queste proteine servono alla cellula e sono di diverso tipo. Per questo sono in grado di “accendere” i geni di cui servono i prodotti e “spegnere” gli altri, attuando alcune strategie.

Il controllo della trascrizione può essere di due tipologie. Il controllo costitutivo dipende dalla natura del promotore:

- Promotore

forte: box -10 e box -35 con sequenze consensus e distanza consensus dall'ATG iniziale. Promuove una trascrizione efficiente; - Promotore debole: box -10 e box -35 con sequenze diverse da quelle consensus e distanza maggiore dall'ATG iniziale. Promuove una trascrizione meno efficiente, in assenza di una specifica regolazione. Quando si analizza la sequenza, si guarda il sito promotore per vedere se viene espresso dal microrganismo e si ipotizza una regione che possa iniziare la trascrizione di quel gene. Il controllo regolativo dipende invece dalle proteine regolatrici. È proprio la cellula a decidere se mettere promotore forte o debole, ma ci possono essere eventi che potrebbero variare la potenza del promotore, come ad esempio un processo di ricombinazione che può portare a un inserimento di una regione di DNA tra il promotore e il gene, che di conseguenza cambierà la distanza rispetto alla consensus. CONTROLLO MEDIANTE REPRESSIONE Prendendo come esempio unmicrorganismo in grado di utilizzare