DNA ricombinante, PCR, RFLP, elettroforesi

Dna ricombinante

Vettori di clonaggio

• Plasmidi: possono contenere da 0,1 a 10 kb
• Fagi (batteriofagi → virus che infetta E.coli): contengono da 8 a 22 kb
• Cosmidi: da 32 a 45 kb
• BAC: da 75 a 300 kb (contiene geni derivati dal fattore F di E.coli necessari alla replicazione del DNA)
• YAC: da 100 a 200 kb (cromosoma artificiale del lievito)

I cosmidi sono vettori ibridi creati dall'unione di un plasmide e un batteriofago (solitamente fago lambda). Il cosmide ottiene dal fago le regioni cos che permettono l’impacchettamento del DNA all'interno del fago; dal plasmide prende il sistema di replicazione e la resistenza agli antibiotici. Il cosmide viene inserito nel fago e, attraverso questo, nei batteri che permettono la divisione dell'ibrido nel quale è stato inserito il tratto di DNA, o meglio, il gene che ci interessa duplicare. Agiscono due endonucleasi: la prima taglia il primo sito e la molecola da circolare diventa lineare. Poi la seconda endonucleasi taglia a livello del secondo sito e qui viene inserito il gene grazie alla ligasi.

Plasmidi e cosmidi non sono buoni vettori quando bisogna infettare cellule di lievito che, in quanto eucariotiche, hanno differenti origini di replicazione. È stato quindi ideato lo YAC che possiede non solo l'origine di replicazione ma anche sequenze per il centromero e il telomero.

Il batterio Agrobacterium presenta un plasmide detto Ti (tumor inductor) che provoca l’insorgenza di tumori nella corteccia delle piante. Questo perché tale plasmide contiene la sequenza T-DNA (DNA trasformante). Si prende il plasmide, si taglia la sequenza T-DNA e si inserisce un gene (es. quello per la resistenza agli insetti) → tali geni entreranno nel genoma della pianta che nascerà sana, con carattere diverso e resistente. Tale tecnica sta alla base degli OGM.

Libreria

Esistono due tipi di librerie principalmente:

• Genomiche
• Di DNA

Quelle genomiche a loro volta si distinguono in:

• Plasmidiche
• Fagiche

In generale, per libreria di DNA si intende una popolazione batterica che contiene plasmidi modificati che contengono tutti i geni del DNA. Le librerie di cDNA (DNA complementare) differiscono da quelle genomiche poiché il cDNA è ottenuto da mRNA prelevato da tessuti, dunque già maturo, e non presenta introni, ma solo esoni. Sono importanti tali librerie perché sono tessuto-specifiche. Se mi serve il gene dell'Hb non posso aspettarmi di ottenerlo dal cDNA ottenuto per retrotrascrizione da mRNA prelevato dal tessuto muscolare, per fare un esempio.

Amplificazione del DNA (1983, Mullis)

L’amplificazione del DNA può avv...