DNA ricombinante, PCR, RFLP, elettroforesi

(PCR).

PCR: serve per ottenere un enorme numero di copie di DNA

in poco tempo. Si utilizzano degli strumenti adeguati nei

quali vanno inseriti gli elementi necessari:

-DNA da amplificare

-polimerasi (generalmente taq che è resistente alle alte

temperature necessarie per la denaturazione del DNA)

-primers (forward e reverse) bisogna conoscere bene le

sequenze che ci interessa amplificare e le sequenze ai loro

lati in modo tale da procurarsi dei primers che delimitano la

regione da amplificare.

-buffer tampone necessario per formare l’ambiente ideale

per la DNA polimerasi

Nella macchina vengono impostati 30 cicli, ognuno dei quali

ha tre fasi:

Denaturazione: si porta il DNA a una temperatura di

1- 90°-95° per far separare le due eliche

Annealing: ovvero appaiamento dei primers (avviene a

2- 50°-60°)

Estensione (70°-75°): i primers vengono allungati dalla

3- polimerasi che aggiunge nucleotidi all’estremità 3’ dei

primers.

Il risultato di questi tre cicli sono due copie di DNA. Nel

secondo ciclo 4 e così via in maniera esponenziale

(teoricamente) secondo la formula

X=x + 2^n

La resa reale della PCR non è esponenziale. Lo è solo fino

a 20 cicli circa. Infatti laPCR è limitata dalla quantità di

primers, nucleotidi, dall’attività della taq polimerasi.

Dunque dopo il 20° ciclo l’amplificazione rallenta: la curva

non ha più andamento esponenziale.

Bisogna poi evidenziare che nei primi 3 cicli circa non si

creano prodotti utili a causa del fatto che le estremità 3’ e 5’

nei primi cicli non sono fisse ma variabili.

La PCR è detta PCR-RT (quindi con retro trascrizione e

utilizzo di trascrittasi inversa) se il campione da cui si parte

è mRNA e dunque ad essere amplificato è il cDNA.

La PCR è detta “qualitativa” e non “quantitativa” poiché non

permette di risalire al numero di DNA o cDNA di partenza

poiché l’andamento è esponenziale (nei limiti già citati)

qualunque sia la quantità di partenza e porta ad una

quantità di prodotti amplificati simile al termine dei 30 cicli.

Allora è stata introdotta la PCR real-time (in tempo reale)

che è “quantitativa”, ovvero permette di conoscere

l’amplificazione del DNA ad ogni ciclo. Sarebbe ottimale

monitorare l’amplificazione in ogni punto della fase

esponenziale.

La PCR real-time si serve di sostanze fluorescenti che

legano il DNA. Si distinguono:

TaqMan più costosa

Sybr Green economica

La TaqMan: si utilizza una sonda che presenta ad

un’estremità un reporter (R) che determina la fluorescenza

(5’) e al 3’ una Q, quencher che inibisce la fluorescenza.

La taq polimerasi ha attività esonucleasica 5’3’ dunque

degrada la donda a partire da 5’, così che si attivi la

fluorescenza.

Siber Green: si lega al DNA a doppio filamento (dsDNA) ed

emette luce. È economico ma dal momento che lega anche

altri dDNA presenti nella reazione e non solo i prodotti utili

esso può causare una sovrastima della concentrazione dei

prodotti dell’amplificazione.

Plot di amplificazione (grafico)

-baseline indica il valore al di sopra del quale inizia

l’accumulo di amplificato

-threshold si trova a 10 derivazioni standard dal baseline ed

interseca la curva nel punto che sulle ascisse corrisponde a

Ct (ciclo di Threshold) che è il ciclo della reazione in cui la

fluorescenza supera quello della linea Threshold e diventa

significativa: è il punto in cui il valore di amplificazione

comincia ad aumentare velocemente. Ct è inversamente

proporzionale alla quantità di DNA iniziale.

Applicazioni PCR:

-individuazione di mutazioni puntiformi

-sequenziamento di DNA

-clonaggio

-altre

Gel elettroforesi: il risultato della PCR va immerso nel gel

elettroforesi per classificare i frammenti a seconda della loro

lunghezza e massa. I frammenti migrano verso l’anodo con

velocità inversamente proporzionale al loro peso