Pcr, elettroforesi, dna ricombinante, enzimi di restrizione

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono particolari enzimi capaci di riconoscere e tagliare delle sequenze specifiche di DNA. Si suddividono in:

• ENDONUCLEASICI - quando rompono i legami all'interno della sequenza
• ESONUCLEASICI - quando rompono i legami che sono all'estremità della sequenza

Ulteriore suddivisione degli enzimi di restrizione è in base alla tipologia:

• TIPO I: sono poco specifici; riconoscono sequenze lontane dal sito di riconoscimento; hanno bisogno di energia per effettuare il taglio
• TIPO II: altamente specifici; riconoscono sequenze di 4-6 basi definite sequenze palindromiche (si leggono da dx verso sx e viceversa); tagliano il sito di riconoscimento; sono quelli maggiormente utilizzati; non hanno bisogno di energia
• TIPO III: sono poco specifici; tagliano vicino al sito di riconoscimento; hanno bisogno di energia per effettuare il taglio

I tagli degli enzimi di restrizione:

1. BLUNT ENDS: formazione di

testo formattato con tag html:

estremità piatte2) STICKY ENDS: formazione estremità appiccicose

Sono preferibili, perché la DNA ligasi appaia meglio i legami ad H

Gli enzimi di restrizione hanno una nomenclatura ben precisa:

EcoRI

E (prima lettera): indica il gene

co (seconda e terza) : indicano la specie

R (quarta lettera) indica il ceppo

I (numero) : indica l’ordine in cui è stato isolato

Gli enzimi di restrizione sono utilizzati per la rilevazione dei polimorfismi e per il DNA ricombinante.

DNA RICOMBINANTE.

Il DNA ricombinante è una porzione di genoma prelevato da un organismo ed inserito all’interno di un organismo ospite affinché quest’ultimo possa replicarlo.

FASI.

1) TAGLIO CON ENZIMA RESTRIZIONE→ il DNA viene estratto e digerito con un enzima di restrizione

2) SEPARAZIONE DEI FRAMMENTI→ i frammenti di DNA ottenuti con l’enzima vengono separati mediante elettroforesi

3) IDENTIFICAZIONE DEL GENE→ per trovare il gene di nostro interesse il

DNA viene ibridato con metodologia blotting (con sonde geniche)

4) PREPARAZIONE VETTORE DI CLONAGGIO→ il vettore di clonaggio è un sistema che contiene il frammento di DNA di nostro interesse e che verrà inserito nell'ospite. I vettori utilizzati maggiormente sono: virus, cosmidi, plasmidi.

Plasmide: molecola circolare di DNA extracromosomico in grado di replicarsi autonomamente. Presenta:

• Sito clonaggio (una sequenza per ogni enzima)
• Marcatore selettivo (per riconoscere le cellule con plasmide)
• Origine replicazione (per avere replicazione del vettore)

Per preparare il vettore di clonaggio vengono utilizzati gli enzimi di restrizione. Questi tagliano il vettore e il DNA e poi vengono uniti dalla DNA ligasi. I tagli sono fatti dallo stesso enzima e con tagli che creano estremità appiccicose.

5) TRASFERIMENTO IN CELLULA OSPITE→ può avvenire per trasformazione, per trasduzione o coniugazione.

6) RICONOSCIMENTO CELLELULE TRASFORMATE→ viene

utilizzato un marcatore (gene) che resiste agli antibiotici o che cambia il colore delle cellule. PCR = Reazione a Catena della Polimerasi La PCR è una tecnica enzimatica che permette l'amplificazione di un frammento o sequenza di DNA di nostro interesse. La procedura di PCR si suddivide in 3 fasi, che avvengono a tre differenti temperature. DENATURAZIONE ad una temperatura di circa 94°C - 95°C, porta alla separazione dei due filamenti di DNA. ANNEALING ad una temperatura di 40°C - 68°C, si ha l'attacco dei primers. ALLUNGAMENTO ad una temperatura di 72°C - 74°C, l'attacco della Taq DNA polimerasi permette l'allungamento del filamento di DNA complementare. Il ciclo viene ripetuto dalle 25 alle 30 volte, portando ad un aumento di numero di filamenti pari a 2 volte. N.B. La Taq DNA polimerasi utilizzata è derivante da un batterio termofilo (thermophilus acquaticum), che resiste bene alle alte temperature. I primers devono

avere due caratteristiche:

1. Lunghezza: pari a 18-24 nucleotidi, per avere maggiore specificità
2. Contenuto G/C (guanina/citosina): il rapporto % deve essere tra il 45 e il 55%. Un'elevata % porta ad appaiamenti troppo specifici; una % troppo bassa rende i primers inefficienti

PCR-RT: Reazione a Catena della Polimerasi Inversa

È una PCR che permette l'amplificazione di un filamento di DNA, partendo da un filamento di RNA.

Le fasi sono due:

1. RETROTRASCRIZIONE: il filamento di RNA viene trascritto in filamento di DNA, mediante l'enzima trascrittasi inversa, ottenendo un cDNA (DNA complementare)
2. AMPLIFICAZIONE: in questa fase si susseguono le fasi della normale PCR: denaturazione, annealing, allungamento.