15 Identificazione dei lieviti: isolamento da acini d'uva e tecniche molecolari (estrazione dna, pcr e preparazione mix di reazione, elettroforesi e preparazione gel, its-pcr, mlst, rapd, rflp, aflp, dgge, sau-pcr ecc.)

Identificazione molecolare dei lieviti

Sugli acini d'uva solitamente ci sono dei ceppi di lievito che possono attuare una fermentazione spontanea. Bisogna tener conto comunque del fatto che la pioggia, ad esempio, può determinare una perdita di lieviti che vivono sulla superficie dell'uva e in questo caso la fermentazione spontanea potrebbe venir meno o comunque avvenire con una intensità minore. Sulla superficie degli acini possono ritrovarsi molte “razze”, dette più specificamente “ceppi”. Questi convivono in natura senza che un ceppo si sviluppi a spese di un altro.

Quando, però, l'uva viene trasformata in mosto inizia una vera e propria guerra di predominio, che conduce in genere alla coabitazione di soli 2 o 3 ceppi, quantomeno in una fase iniziale e media. Quando poi le caratteristiche del mosto cambiano (ad esempio, quando l’azoto viene a mancare, oppure l’alcol supera i 12 gradi ecc.) riesce a resistere un solo ceppo. A volte, invece, c’è un arresto, perché nessun ceppo è capace di sopravvivere nelle nuove condizioni ambientali.

Inoltre, è fondamentale ricordare che sulle uve vi sono sia lieviti “buoni” che lieviti “cattivi”: i primi generano alcol, mentre i secondi acidità volatile. Quindi ritorna utile sapere quali ceppi di lievito si possono ritrovare sulla superficie dell'uva. Una volta classificati i lieviti presenti sull'uva, sono presto dette le loro caratteristiche. Di conseguenza, se in seguito a queste analisi risulta che tutti i ceppi di lievito presenti sull'uva, ad un certo punto della fermentazione, smettono di “funzionare”, oppure tutti i ceppi presenti sugli acini sono cattivi, si procede fin dall’inizio con l’aggiunta di lieviti selezionati.

Classificazione e biotipizzazione

È ormai universalmente accettato che la classificazione dei lieviti richiede un approccio polifasico comprendente lo studio della morfologia e fisiologia cellulare, seguito dall'identificazione ottenuta tramite impiego di una o più tecniche molecolari. Con il termine “identificazione” si fa riferimento all’attribuzione del microrganismo al genere o alla specie di appartenenza per confronto, da un punto di vista morfologico o genotipico, con individui già identificati.

La differenziazione di ceppi nell’ambito della specie di appartenenza è detta biotipizzazione. Ad esempio, dire che il lievito identificato è S. cerevisiae è come dire “un cane”. La determinazione del ceppo, entro la specie S. cerevisiae, del microrganismo in analisi prende il nome di biotipizzazione. La biotipizzazione, in altri termini, può essere espressa come lo studio effettuato per determinare, ad esempio, la razza di un cane.

Analisi del DNA

Se il DNA di un organismo mostra un alto grado di omologia con quello di un altro organismo, i due organismi sono considerati membri della stessa specie. Il DNA di specie microbiche diverse non mostra omologia. Per effettuare l’analisi del DNA, esso dovrà prima essere estratto dalle cellule. Le cellule dalle quali si estrarrà il DNA vengono fatte crescere in piastra per 3 o 4 giorni su terreno agarizzato a 25°C.

Per isolare i microrganismi presenti sugli acini d'uva per identificarli successivamente da un punto di vista molecolare (o anche morfologico), bisogna porre un grappolo d'uva in un sacchetto sterile e pigiare (praticamente si ottiene il mosto). Il sacchetto con il pigiato viene posto in agitazione a 1300 rpm per 30 minuti per il distacco e la dissoluzione dei microrganismi presenti sulla bacca (o chicco o acino) d'uva.

Diluizioni seriali e terreni di coltura

Si procede con diluizioni seriali del mosto. Quindi, si preleva 1 ml di mosto e lo si miscela a 9 ml di acqua sterile all’interno di una provetta, ottenendo una diluizione di 1:10^-1 (detta anche 10^-1). Dopo aver agitato con un vortex la provetta, si preleva da quest’ultima 1 ml di soluzione e la si miscela con 9 ml di acqua sterile all’interno di un’altra provetta, ottenendo una diluizione di 1:100 (detta anche 10^-2). Si agita anche questa provetta con un vortex. In ultimo, si preleva 1 ml di soluzione da quest’ultima provetta e la si miscela in 9 ml di acqua sterile all’interno di un’ulteriore provetta, ottenendo una diluizione di 1:1000 (detta anche 10^-3). Si agita anche questa provetta.

Effettuate le diluizioni, si procede, prelevando 100 microlitri da ciascuna provetta e seminando, per spatolamento, ciascuna quantità prelevata su tre piastre distinte. Si utilizzano diversi terreni per la crescita: WL+Bifenile e Agar Lisina. Cioè 100 microlitri della prima soluzione diluita vengono piastrati su WL+Bifenile e 100 microlitri della stessa soluzione vengono piastrati su Agar Lisina e così via per le altre soluzioni diluite. Le piastre poi vengono incubate a 25°C per 4 o 5 giorni.

Il terreno WL (Wallerstain Laboratory) nutrient agar+Bifenile è un terreno contenente il colorante verde di bromocresolo (indicatore di viraggio). I microrganismi, che crescono su questo terreno, assumono colorazioni, consistenza e morfologia diverse a seconda della specie. Ad esempio, il lievito Hanseniaspora uvarum, su questo terreno, si presenta con una colorazione verde intensa, con un profilo tipicamente piatto, superficie liscia e consistenza burrosa, mentre il S. cerevisiae ha un colore variabile dal crema al verde, superficie liscia e consistenza cremosa. L’aggiunta di 0,02% di Bifenile consente un rallentamento della crescita delle muffe che altrimenti si espanderebbero fino a coprire la superficie della piastra impedendo l’osservazione e la conta dei lieviti.

L’Agar Lisina è un terreno selettivo che contiene Lisina come fonte di azoto assimilabile dai lieviti non-Saccharomyces e non dal lievito Saccharomyces cerevisiae. Per questo i lieviti Saccharomyces crescono difficilmente su questo terreno e originano colonie puntiformi, a differenza dei lieviti non-Saccharomyces che invece riescono a crescere normalmente.

Estrazione del DNA

Quindi, coltivate le cellule, si procede con l’estrazione del DNA che prevede tre principali fasi:

• Lisi cellulare. Questa fase può essere eseguita in diversi modi: per digestione enzimatica (la parete dei lieviti può essere digerita con enzimi come l'azimoliasi); utilizzando solventi organici (quali toluene ed etil-acetato ecc.) o detergenti anionici (come l'SDS, cioè sodio-dodecil-solfato); con sferette di vetro; per sonicazione (nella sonda viene immersa una sonda metallica di un sonicatore, che vibrando è in grado di emettere onde sonore ad altissima frequenza ed è capace di rompere le cellule. Lo svantaggio di questa tecnica è che si può sviluppare calore; ma questo lo si può rimediare lavorando con le soluzioni in bagno di ghiaccio e programmando il funzionamento pulsato, cioè intermittente della sonda).
• Deproteinizzazione, che serve a separare il DNA dalle proteine istoniche.
• Sospensione del DNA.

Un protocollo standard per l'estrazione del DNA da cellule di lievito non-Saccharomyces prevede i seguenti passaggi:

• Prelevare le cellule dalla piastra con un'ansa di plastica (1/8 della superficie totale) e metterle in una eppendorf con 300 microlitri di tampone (composto da 0,1 M di Tris a pH 8,5; 50 mM di EDTA e 1% di SDS, cioè sodio-dodecil-solfato, che è un detergente anionico).
• Aggiungere le sferette di vetro aventi un diametro di 0,2-0,3 micrometri (riempiendo circa 1/3 del contenuto dell'eppendorf).
• Vortexare per 1 minuto e porre in ghiaccio per 1 min (ripetere per 3 volte).
• Bollire le eppendorf in acqua per 10 minuti.
• Mettere in ghiaccio per 3 minuti.
• Aggiungere 20 microlitri di tris HCl 1M e 15 microlitri di EDTA 0,5 M.
• Aggiungere 50 microlitri di SDS 10% e mescolare con la pipetta.
• Aggiungere 200 microlitri di Potassio Acetato 5 M e spipettare leggermente.
• Riporre in ghiaccio 30 minuti.
• Centrifugare 10 minuti a 14.000 rpm.
• Prelevare 500 microlitri del surnatante (buttare pellet e sferette) ed aggiungere un uguale volume (500 microlitri) di Isopropanolo freddo (-20°C).
• Incubare 5 minuti in ghiaccio e centrifugare 10 minuti a 14.000 rpm.
• Eliminare il sovranatante e aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo.
• Centrifugare per 5 minuti ed eliminare il surnatante (l'etanolo).
• Risospendere su 100 microlitri di TE (buffer composto da Tris HCl ed EDTA).
• Incubare in stufa a 30°C per 15 minuti.
• Spipettare bene, vortexare e conservare a -20°C.

Amplificazione mediante PCR

Terminata la procedura di estrazione, si procede con l'amplificazione, mediante PCR, di regioni genomiche specifiche. La PCR è una tecnica che consente di ottenere rapidamente milioni di molecole identiche di DNA a partire da quantità estremamente ridotte dell'acido nucleico. Infatti la PCR è una reazione di amplificazione in vitro di uno specifico frammento di DNA per mezzo di una DNA polimerasi.

Nella reazione sono coinvolti due oligonucleotidi a singolo filamento (primer) complementari uno all’estremità 3’ e l’altro all’estremità 5’ del segmento di DNA che si vuole amplificare, che costituiscono gli elementi di innesco dell’attività della DNA polimerasi. Altri elementi coinvolti nella reazione sono i desossiribonucleotidi (unità del DNA, ciascuna composta da una base azotata, uno zucchero desossiribosio e uno o più gruppi fosfato) e il MgCl₂: i primi sono necessari per la sintesi dei nuovi filamenti ed il secondo rappresenta il cofattore indispensabile alla DNA polimerasi e maggiore è la quantità di MgCl₂, minore sarà la specificità di legame tra primer e filamento bersaglio, cioè i primer legheranno anche le estremità che non sono perfettamente complementari.

Inizialmente veniva utilizzata una DNA polimerasi prodotta da E.Coli. Tuttavia, questo enzima non è stabile alle alte temperature e viene inattivato durante la fase di denaturazione di ciascun ciclo PCR. Era pertanto necessario aggiungerne una nuova aliquota prima della fase di estensione, che veniva effettuata ad una temperatura di 37 °C. Tutto ciò rendeva la tecnica laboriosa e costosa e aumentava la probabilità di avere prodotti di reazione aspecifici. Nel 1988 fu isolata una DNA polimerasi termostabile prodotta dal batterio termoresistente Thermus aquaticus.