15 Identificazione dei lieviti: isolamento da acini d'uva e tecniche molecolari (estrazione dna, pcr e preparazione mix di reazione, elettroforesi e preparazione gel, its-pcr, mlst, rapd, rflp, aflp, dgge, sau-pcr ecc.)

AFLP

La sigla sta per "amplification fragment length polymorphism" quindi amplificazione di frammenti polimorfici ottenuti con la restrizione. E' una combinazione tra l'analisi di restrizione e la PCR. Questa tecnica prevede il susseguirsi dei seguenti passaggi: 1. Digestione del DNA cellulare con uno o più enzimi di restrizione (solitamente se ne usano 2); 2. Si procede con il legame di sequenze, dette adattatori, ai frammenti ottenuti dalla fase precedente. Solitamente gli adattatori sono sequenze a doppio filamento con un filamento sporgente rispetto all'altro; ma possono essere anche sequenze con estremità piatte come in questo caso. Sono utili per la fase successiva. Il legame degli adattatori ai frammenti ottenuti dalla restrizione del DNA cellulare avviene ad opera della DNA ligasi. 3. Dopodiché si effettua una amplificazione selettiva. Cioè si effettua una PCR utilizzando primer complementari alla sequenza adattatore con un nucleotide.

opiù nucleotidi all’estremità 3’ dei primer. Questi nucleotidi in più permettonol’amplificazione solo di alcuni frammenti di restrizione dal momento che questinucleotidi aggiuntivi troveranno i loro complementari solo su alcuni frammenti.

Il numero dei nucleotidi aggiuntivi dipende da quanto si vuole essere selettivi:cioè maggiore è il numero dei nucleotidi aggiuntivi e maggiore è la selettività;quindi, minore sarà il numero di frammenti che verranno amplificati. Gliadattatori, appunto, servono a progettare, come in questo caso, primercomplementari ad essi quando non si conosce la sequenza del frammento diDNA che si vuole amplificare. Ovviamente gli adattatori sono utilizzati anche peraltri scopi, ad esempio nel clonaggio del DNA.

4. I frammenti amplificati vengono caricati su un gel di poliacrillamide e separatitra loro mediante elettroforesi.

Con questo sistema viene ottenuto un complesso di pattern di bande di

molecola di DNA. Durante l'elettroforesi su gel in gradiente denaturante, il gel viene preparato con una concentrazione crescente di un agente denaturante lungo la sua lunghezza. Ciò crea un gradiente di denaturazione che permette la separazione dei frammenti di DNA in base alla loro stabilità. I frammenti di DNA che hanno una maggiore affinità per il denaturante si denaturano prima e migrano più lentamente nel gel, mentre quelli con una minore affinità si denaturano più tardi e migrano più velocemente. Questo permette di ottenere un pattern di bande unico per ciascun isolato di DNA, che può essere utilizzato per identificare e confrontare le diverse specie microbiche.molecola di double-stranded DNA (dsDNA). La temperatura e la concentrazione di denaturante a cui si verifica la separazione dei due filamenti dipendono fortemente dalla sequenza del frammento stesso. In particolare, i fattori determinanti sono: la quantità di legami idrogeno che si instaurano tra basi complementari e il tipo di interazione che si stabilisce tra basi adiacenti sullo stesso filamento. Una molecola di DNA possiede quindi domini con temperature di fusione (o melting) caratteristiche, determinate dalla sequenza nucleotidica. Frammenti di DNA pressoché identici in peso molecolare, ma che differiscono anche per un solo nucleotide, possono essere caratterizzati da Tm e melting domains diversi tra loro. L'analisi DGGE viene condotta su gel di poliacrilammide contenente un gradiente denaturante in modo che il dsDNA sia sottoposto, durante la corsa, ad un aumento delle condizioni di denaturazione con conseguente separazione in corrispondenza dei melting domains. Nella partesuperioredel gel, dove si hanno condizioni di denaturazione blande, i melting domains a Tminferiori iniziano a denaturarsi parzialmente, creando molecole ramificate con mobilità minore. L'incremento nelle condizioni di denaturazione lungo il gel di poliacrilammide può determinare la totale dissociazione dei frammenti in single stranded DNA (ssDNA). Sperimentalmente, la completa dissociazione dei due filamenti di dsDNA viene ostacolata mediante introduzione all'estremità di ciascun filamento di domini caratterizzati da alto contenuto in G+C ed alte Tm. Queste sequenze ricche in G e C si dicono GC-CLAMP. La formazione di 3 legami a idrogeno in una coppia di basi GC. A differenza dei 2 presenti in una coppia AT, implica la necessità di raggiungere una temperatura o una concentrazione di denaturante chimico più elevata, per ottenere la rottura di tali legami. Solitamente si amplificano i 16S dell'intera comunità di cellule che sivogliono essere utilizzati per una classificazione più dettagliata. MLST si basa sull'amplificazione e il sequenziamento di geni specifici, chiamati loci, che sono presenti in tutti i microrganismi ma variano tra le specie. Questi loci sono selezionati in base alla loro variabilità e alla loro capacità di fornire informazioni sulla relazione filogenetica tra i microrganismi. Per eseguire MLST, vengono utilizzati primer universali che si legano ai loci target e amplificano il DNA corrispondente. Uno di questi primer ha una coda di GC in posizione 5', in modo che tutti i frammenti amplificati abbiano una coda di GC all'inizio. Questa coda serve a evitare che i due filamenti di DNA si separino completamente durante la successiva separazione elettroforetica, producendo frammenti ramificati. Le bande di DNA amplificate possono essere visualizzate su un gel elettroforetico. Se necessario, le bande possono essere tagliate dal gel e il frammento di DNA può essere estratto dalla matrice del gel per essere sequenziato. MLST è una tecnica molto utile per la tipizzazione di microrganismi, in quanto fornisce informazioni dettagliate sulla loro relazione filogenetica. Tuttavia, è importante conoscere almeno la specie batterica che si sta studiando per determinare quali loci siano i migliori da analizzare.È sempre in grado di permetterci di discriminare diversi ceppi all'interno della stessa specie. Si basa sull'analisi di geni housekeeping (detti anche costitutivi, cioè sempre tradotti). Comparando, in seguito ad amplificazione e sequenziamento, le sequenze geniche ottenute con quelle presenti in un database, si possono identificare polimorfismi nucleotidici che ci permettono di distinguere diversi ceppi. SAU-PCR metodo coltura-indipendente La tecnica si basa sulla iniziale digestione del DNA genomico con l'endonucleasi di restrizione Sau3AI, che riconosce la sequenza GATC. Si formano estremità sporgenti che vengono colmate utilizzando primer complementari alla sequenza di restrizione riconosciuta dall'endonucleasi. Successivamente si prosegue con cicli di PCR che prevedono l'impiego di primer complementari alla sequenza di restrizione riconosciuta da Sau3AI, ma presentano anche due nucleotidi in più all'estremità 3'.

una coda di 7 nucleotidi ricca in G e C all'estremità 5'. I due nucleotidi aggiuntivi all'estremità 3' servono ad aumentare la specificità dei primer, cioè i primer si appaiono solo con quei frammenti che presentano due nucleotidi complementari a quelli aggiunti all'estremità 3' del primer. In questo modo non tutti i frammenti verranno amplificati. La coda ricca in G e C, invece, ha lo scopo di conferire una temperatura di fusione alta. Supponiamo che le due basi aggiuntive al 3' del primer siano A e T. Supponiamo, inoltre, che la sequenza di restrizione del frammento 1 sia seguita dalle basi T e A e che la sequenza di restrizione del frammento 3 sia seguita dalle basi C e G. Ovviamente solo il frammento 1 verrà amplificato, mentre non verrà amplificato il frammento 3 dal momento che l'estremità 3' del primer in questo caso non si appaia saldamente e questo

inibiscel'amplificazione. Dopo i vari cicli di amplificazione si continua con una elettroforesi ottenendo un certo profilo di bande per ogni microrganismo considerato. I profili vengono tra loro confrontati.

ELETTROFORESI IN CAMPO PULSATO metodo coltura-dipendente

Questa tecnica comporta la digestione del DNA genomico con uno o più enzimi di restrizione, la separazione dei frammenti di restrizione ottenuti mediante elettroforesi in inversione di campo e la risoluzione dei frammenti su gel di agarosio.

A differenza dell'elettroforesi convenzionale, nella quale il gel viene fatto correre in una sola direzione, l'elettroforesi su gel in campo pulsato provvede all'applicazione alternata di due campi elettrici (disposti a 90° l'uno dall'altro) per periodi di tempo crescenti da 1 a 100 secondi per un tempo complessivo che può variare a seconda delle dimensioni delle molecole da separare. I campi elettrici alternati forzano le molecole a cambiare

laloro direzione;i profili elettroforetici vengono definiti pulsovar. L'elettroforesi in gel di agarosio convenzionale impiega un campo elettrico statico e riesce a separare frammenti di DNA della taglia massima di 20-50 kb. La PFGE permette di separare frammenti fino a 10 Mb sfruttando la lentezza dei grossi frammenti nel riorientarsi ad ogni variazione del campo elettrico, lentezza che è proporzionale alla taglia del frammento. Per evitare rotture meccaniche del DNA, le cellule intatte vengono fissate in blocchetti di agarosio, all'interno dei quali avvengono le reazioni di lisi. Si caricano nei pozzetti del gel di agarosio i cubetti trattati con all'interno il DNA genomico dei ceppi da analizzare. In seguito all'elettroforesi si ottiene un certo profilo di bande caratteristico per ogni microrganismo. È spesso possibile distinguere ad occhio la presenza di profili identici o differenti per una o più bande.

AMPLIFICAZIONE DELLE SEQUENZE DELTAI

trasposoni sono sequenze di DNA che hanno la capacità di cambiare posizione all'interno del genoma. Essi, spostandosi, possono alterare o inibire la funzione di un gene. I retrotrasposoni non sono altro che trasposoni che riescono a muoversi solo dopo essere stati trascritti a RNA (sono in grado di autotrascriversi). L'RNA risultante verrà retrotrascritto grazie a una trascrittasi inversa, ottenendo una sequenza di DNA identica a quella del retrotrasposone di partenza. Questa sequenza di DNA si integrerà in una nuova regione del genoma. Per l'identificazione dei lieviti da un punto di vista molecolare si può considerare il retrotrasposone TY1 il quale è fiancheggiato da sequenze, chiamate sequenze delta. All'interno del genoma di Saccharomyces possono essere presenti da un minimo di 35 a un massimo di 55 sequenze delta. Datala variabilità di numero e di ubicazione delle sequenze delta tra i vari ceppi di S. cerevisiae sipuò pensare di identificarli procedendo con un'amplificazione di questeregi